大規(guī)模并行測(cè)序 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估-編制說(shuō)明

《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估》

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明

《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估》

標(biāo)準(zhǔn)起草組

2023年4月

1

一、工作簡(jiǎn)況

1任務(wù)來(lái)源

本項(xiàng)目根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)于2022年4月22日下達(dá)的2022年第一批推薦性

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃的通知（國(guó)標(biāo)委綜合〔2022〕17號(hào)，本項(xiàng)目計(jì)劃編號(hào)為20220184-T-469，

名稱為生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估，本標(biāo)準(zhǔn)等同采用ISO

20397-2：2021《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估》。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC387）提出并歸口。

2標(biāo)準(zhǔn)編制過(guò)程和主要工作過(guò)程

預(yù)研和起草階段：2022年4月，標(biāo)準(zhǔn)起草單位根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)于2022年

4月22日下達(dá)的2022年第一批推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃的通知（國(guó)標(biāo)委發(fā)〔2022〕17號(hào)文）

和全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)生檢標(biāo)〔2022〕16號(hào)文件《關(guān)于下達(dá)2022年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

制修訂計(jì)劃的通知（第一批）》立項(xiàng)文件的要求，成立了以中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院為牽頭單

位的標(biāo)準(zhǔn)起草工作組（以下簡(jiǎn)稱“工作組”）。2022年5月，工作組按照GB/T1.1-2020《標(biāo)

準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》、GB/T1.2-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作

導(dǎo)則第2部分：以ISO/IEC標(biāo)準(zhǔn)化文件為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)化文件起草規(guī)則》的要求完成

ISO20397-2：2021標(biāo)準(zhǔn)的翻譯校對(duì)工作，并針對(duì)國(guó)內(nèi)測(cè)序領(lǐng)域有關(guān)測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)情況進(jìn)行了

調(diào)研，國(guó)內(nèi)測(cè)序儀、測(cè)序方法、測(cè)序樣本要求等相關(guān)的采用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有23個(gè)，食品、

環(huán)境、植物、動(dòng)物、醫(yī)藥等各行各業(yè)都有一些標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。但評(píng)價(jià)測(cè)序數(shù)據(jù)的有效標(biāo)準(zhǔn)僅1

個(gè)，GB/T35890-2018《高通量測(cè)序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范》，是關(guān)于序列描述格式規(guī)范和高

通量測(cè)序數(shù)據(jù)整體格式的規(guī)定。關(guān)于測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估的現(xiàn)行有效的標(biāo)準(zhǔn)，ISO有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，

ISO20397-2-2021《Biotechnology—Massivelyparallelsequencing—Part2:Quality

evaluationofsequencingdata》。目前瑞士也已經(jīng)采用這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)作為他們的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)工作

組調(diào)研，我國(guó)在國(guó)家層面還沒(méi)有通用的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，ISO20397-2-2021標(biāo)準(zhǔn)在

我國(guó)適用。轉(zhuǎn)化ISO20397-2-2021，完善測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估勢(shì)在必行，基于此，本標(biāo)準(zhǔn)

等同采用ISO20397-2：2021《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)

估》，工作組結(jié)合ISO20397-2：2021開(kāi)始完善標(biāo)準(zhǔn)草案初稿。

3

二、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容

1、標(biāo)準(zhǔn)編制原則

本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》

和GB/T1.2-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第2部分：以ISO/IEC標(biāo)準(zhǔn)化文件為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)化文件

起草規(guī)則》的要求進(jìn)行編制。

本標(biāo)準(zhǔn)是在ISO20397-2:2019《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量

評(píng)估》的基礎(chǔ)上，結(jié)合我國(guó)測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估方法，對(duì)ISO20397-2:2019現(xiàn)有的主要內(nèi)容全部

采納而制定成本標(biāo)準(zhǔn)，制定本標(biāo)準(zhǔn)時(shí)遵循以下原則：

1）根據(jù)市場(chǎng)應(yīng)用和行業(yè)技術(shù)的實(shí)際情況出發(fā)，最大限度的促進(jìn)我國(guó)測(cè)序樣本的質(zhì)量

控制、測(cè)序儀器校準(zhǔn)、測(cè)序方法建立、測(cè)序文庫(kù)制備試劑盒的研發(fā)及應(yīng)用等方面的提高與

發(fā)展。本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)整理、評(píng)估，為樣品質(zhì)量檢驗(yàn)提供技術(shù)依據(jù)，并為行業(yè)未來(lái)的技

術(shù)發(fā)展留有一定空間，使標(biāo)準(zhǔn)具有一定的前瞻性。

2）本標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行相關(guān)法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)等協(xié)調(diào)一致。

3）根據(jù)樣品檢測(cè)結(jié)果和實(shí)際需求，在確定本標(biāo)準(zhǔn)的原始數(shù)據(jù)保存格式、質(zhì)量評(píng)估要

求、評(píng)估方法、測(cè)得序列比對(duì)及組裝所用的軟件和工具以及相關(guān)質(zhì)量評(píng)估方法、基因組變

異檢測(cè)、數(shù)據(jù)質(zhì)量驗(yàn)證、測(cè)序靈敏度及特異性驗(yàn)證等內(nèi)容時(shí)，綜合考慮行業(yè)的需求、科學(xué)

研究需要和用戶的利益，尋求最大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，充分體現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)在技術(shù)上的先進(jìn)性、

科學(xué)性和經(jīng)濟(jì)上的合理性。使標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容更加完善、全面，且易于實(shí)施和應(yīng)用。

4）根據(jù)國(guó)情，標(biāo)準(zhǔn)制訂堅(jiān)持面向市場(chǎng)、服務(wù)產(chǎn)業(yè)的原則。結(jié)合我國(guó)測(cè)序領(lǐng)域的實(shí)際

現(xiàn)狀，并以引領(lǐng)和促進(jìn)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量水平的提升為目標(biāo)而修訂，提高標(biāo)準(zhǔn)的綜合水平。使

標(biāo)準(zhǔn)要適應(yīng)市場(chǎng)需求，滿足行業(yè)發(fā)展，為科研開(kāi)發(fā)、企業(yè)的生產(chǎn)、質(zhì)量檢驗(yàn)提供技術(shù)指導(dǎo)，

同時(shí)有助于引導(dǎo)本行業(yè)采用本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范化生產(chǎn)，具有一定的先進(jìn)性。

5）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)編排、編寫格式和內(nèi)容表達(dá)方法等按GB/T1.1-2020等系列標(biāo)準(zhǔn)的

規(guī)定進(jìn)行編寫，使標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化。

2、確定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)全文分為8章和3個(gè)附錄。標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容如表1所示：

表1本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容

章條名稱內(nèi)容簡(jiǎn)要

4

明確了對(duì)質(zhì)量評(píng)估和大規(guī)模并行測(cè)序數(shù)據(jù)的整體要求和建議。涵蓋

1范圍了原始數(shù)據(jù)生成過(guò)程、排序比對(duì)和變量調(diào)用。本文件還提供了MPS

數(shù)據(jù)驗(yàn)證和文檔化的一般指南。

2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件

3術(shù)語(yǔ)和定義ISO界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

包括總體要求、原始數(shù)據(jù)文件、原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估、原始數(shù)據(jù)預(yù)處

4原始數(shù)據(jù)

理等。

描述了應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇校正與比對(duì)策略，包括校正和比對(duì)文件

5序列校正與比對(duì)

格式、質(zhì)量控制、校正后處理等。

描述了不同類型的序列變異應(yīng)采用不同的計(jì)算方法、變異識(shí)別的數(shù)

6變異識(shí)別

據(jù)文件、質(zhì)量指標(biāo)及假陽(yáng)性變異的處理等。

包括生物信息學(xué)流程、試驗(yàn)性能、質(zhì)量參數(shù)等驗(yàn)證，建立原始?jí)A基

7驗(yàn)證

質(zhì)量值閾值、建立去除低質(zhì)量堿基的預(yù)處理方法等。

描述實(shí)驗(yàn)室記錄所有MPS結(jié)果分析、解釋和報(bào)告的算法、軟件和

8文件

數(shù)據(jù)庫(kù)等，以便對(duì)每個(gè)結(jié)果進(jìn)行追溯。

9附錄A資料性附錄，特定MPS平臺(tái)示例的質(zhì)量指標(biāo)

10附錄B資料性附錄，按應(yīng)用劃分的覆蓋范圍和讀取建議

11附錄C資料性附錄，序列比對(duì)和校正軟件

3、主要技術(shù)差異

等同采用了ISO20397-2:2021《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)

量評(píng)估》，本標(biāo)準(zhǔn)與ISO20397-2:2021相比，沒(méi)有技術(shù)差異。

4、標(biāo)準(zhǔn)解決的主要問(wèn)題

ISO20397-2:2021是基礎(chǔ)通用的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)等同采用ISO

20397-2:2021標(biāo)準(zhǔn)，大規(guī)模并行測(cè)序是一種新型的測(cè)序方法，它廣泛地影響生物技術(shù)的許

多方面。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了對(duì)質(zhì)量評(píng)估和大規(guī)模并行測(cè)序數(shù)據(jù)的整體要求和建議。本文件適用

于測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估與驗(yàn)證。確定了原始數(shù)據(jù)的評(píng)估指標(biāo)（序列長(zhǎng)度分布、每個(gè)序列GC

含量、質(zhì)量值、序列重復(fù)水平、超出閾值水平、集群密度、出錯(cuò)率等）、分析用于不同應(yīng)

用的序列校正及比對(duì)軟件；測(cè)序校正和比對(duì)的質(zhì)量控制，包括單端測(cè)序片段比對(duì)，配對(duì)段

測(cè)序片段比對(duì)，子片段的長(zhǎng)度比對(duì)；變異識(shí)別，能識(shí)別SNV、插入缺失、CNV和SVs四

種變異類型，變異識(shí)別質(zhì)量指標(biāo)包括變異質(zhì)量值、等位基因讀取百分比、樣品間污染分析

等；質(zhì)量指標(biāo)驗(yàn)證，包括建立去除低質(zhì)量堿基的方法、確定比對(duì)質(zhì)量參數(shù)、定義平均覆蓋

范圍；高通量測(cè)序方法特異性及靈敏度確認(rèn)（單一物種驗(yàn)證、混合樣品檢測(cè)、不同加工方

式樣品檢測(cè)）。

5

三、主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）情況；

本標(biāo)準(zhǔn)等同采用了ISO20397-2：2021《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序

數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估》。本標(biāo)準(zhǔn)與ISO20397-2：2021相比，沒(méi)有技術(shù)差異。主要技術(shù)指標(biāo)在

全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口的肉類摻假檢測(cè)的測(cè)序相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證，

以下列出了測(cè)序部分技術(shù)指標(biāo)的試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果。

1、單一物種樣品

對(duì)黃牛、牦牛、山羊、綿羊、雞、鴨、鵝、豬、馬、驢10個(gè)單一物種樣品的具體名

稱模糊處理，僅標(biāo)記相應(yīng)序號(hào)，將樣品DNA與構(gòu)建好引物擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序，測(cè)序

后比對(duì)位點(diǎn)序列，并設(shè)定序列相似性閾值，即非目標(biāo)物種位點(diǎn)的序列相似性的最大值，序

列相似性大于閾值的測(cè)序片段（reads）為有效reads，有效reads數(shù)大于100的位點(diǎn)則可判

為有效位點(diǎn)。結(jié)果如表1：

表110種單一樣品測(cè)序比對(duì)結(jié)果

序總位檢出位

樣品檢出位點(diǎn)總reads數(shù)檢出物種

號(hào)點(diǎn)數(shù)點(diǎn)數(shù)

1馬肉10HS-1~HS-5、HS-7~HS-1092943672馬(Equuscaballus)

2雞肉10CN-1~CN-3、CN-5~CN-982280390雞(Gallusgallus)

鴨(Anas

3鴨肉5DC-1~DC-551670754

poecilorhyncha)

4驢肉8DN-1~DN-882770142驢(Equusasinus)

5鵝肉9GS-1~GS-993330738鵝(Anseranser)

6豬肉7PG-2~PG-5、PG-753547802豬(Susbarbatus)

7黃牛肉5CA-2~CA-5420965878黃牛(Bostaurus)

8牦牛肉3YK-2、YK-324183222牦牛(Bosgrunniens)

GT-1~GT-4、GT-7~GT-8、山羊(Capra

9山羊肉1073411738

GT-10caucasica)

10綿羊肉3SH-1~SH-3311979056綿羊(Ovisaries)

單一物種樣品測(cè)序結(jié)果表明，驢、鴨、鵝、綿羊肉檢出的位點(diǎn)數(shù)分別為8、5、9、3，

檢測(cè)準(zhǔn)確率為100%，黃牛、馬、雞、山羊肉的位點(diǎn)檢出率也較高，在70%~90%之間。表

明測(cè)序準(zhǔn)確率較高，可準(zhǔn)確鑒別常見(jiàn)的肉類物種，與預(yù)期相符。

2、模擬混合樣品檢測(cè)

為驗(yàn)證高通量測(cè)序技術(shù)在混合樣品檢測(cè)中的靈敏度，分別對(duì)驢肉摻入比例為0.1%、

1%、10%、20%的混合樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果顯示，檢出限可達(dá)肉含量的0.1%，檢測(cè)結(jié)

6

果如表2所示，即使混樣中所含的DNA分子量小，但對(duì)摻假成分檢出影響較小，該方法

能鑒定混合樣品中的各源性成分，靈敏度較高。

表2模擬摻假樣品高通量測(cè)序結(jié)果

摻入比例檢出物種

編號(hào)總reads數(shù)檢出位點(diǎn)

驢(%)馬(%)雞(%)（位點(diǎn)數(shù)）

DN-2~DN-8、HS-1~HS-5、HS-7、

驢(7)，馬(8)，

YL010.149.9549.954661628HS-9~HS-10、CN-1~CN-3、CN-5~

雞(8)

CN-9

DN-2~DN-8、HS-1~HS-5、HS-7、

驢(7)，馬(8)，

YL02149.549.54482238HS-9~HS-10、CN-1~CN-3、CN-5~

雞(8)

CN-9

DN-1~DN-8、HS-1~HS-5、HS-7、

驢(8)，馬(8)，

YL031045454690626HS-9~HS-10、CN-1~CN-3、CN-5~

雞(8)

CN-9

DN-1~DN-8、HS-1~HS-5、HS-7、

驢(8)，馬(8)，

YL042040403668332HS-9~HS-10、CN-1~CN-3、CN-5~

雞(8)

CN-9

3、不同加工方式樣品檢測(cè)

通過(guò)對(duì)生肉及三種不同加工條件下（蒸、煮、干燥）處理的不同摻假比例的混合肉樣

進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證高通量測(cè)序方法對(duì)生肉及深加工肉制品檢測(cè)的適用性，由表17可知，隨

著雞、鴨、豬肉的摻入質(zhì)量減少，位點(diǎn)數(shù)也逐漸減少，生肉及三種加工肉均呈現(xiàn)相同的趨

勢(shì)，最終該方法能檢測(cè)出生肉及煮制肉中0.1%的源性成分，蒸制及干制肉中1%的源性成

分，說(shuō)明該方法可用于加工肉制品中摻雜或摻假組分的鑒定，靈敏度高，適用性強(qiáng)。

表3不同加工方式樣品高通量測(cè)序結(jié)果

摻入比例

樣品加工

綿羊雞鴨豬總reads數(shù)檢出物種（位點(diǎn)數(shù)）

編號(hào)方式

(%)(%)(%)(%)

S0199.70.10.10.122015622綿羊(3)，雞(7)，鴨(4)，豬(3)

S02生971113239018綿羊(3)，雞(7)，鴨(4)，豬(4)

S03855553059070綿羊(3)，雞(7)，鴨(5)，豬(5)

Z0199.70.10.10.1396732綿羊(3)

Z02蒸971111090816綿羊(3)，雞(1)，鴨(4)，豬(1)

Z0385555482114綿羊(3)，雞(5)，鴨(3)，豬(3)

B01煮99.70.10.10.15735156綿羊(3)，雞(6)，鴨(4)，豬(2)

7

B02971115968700綿羊(3)，雞(7)，鴨(5)，豬(3)

B03855552411062綿羊(3)，雞(8)，鴨(5)，豬(3)

G0199.70.10.10.17154182綿羊(3)，鴨(4)，豬(3)

G02干971117168650綿羊(3)，雞(7)，鴨(4)，豬(4)

G03855553802240綿羊(1)，雞(7)，鴨(4)，豬(4)

四、標(biāo)準(zhǔn)中涉及專利的情況

本標(biāo)準(zhǔn)不涉及專利問(wèn)題。

五、預(yù)期達(dá)到的社會(huì)效益、對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的作用等情況

測(cè)序技術(shù)應(yīng)用廣泛，一次測(cè)序得到大量數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)整理與分析是高通量測(cè)序應(yīng)用于生

物研究最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，若未按需求對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與評(píng)估，則所測(cè)得數(shù)據(jù)無(wú)法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)

果。有效的數(shù)據(jù)分析與質(zhì)量控制有利于物種鑒定、病原體識(shí)別、病毒基因溯源、醫(yī)療診斷、

環(huán)境微生物檢測(cè)、測(cè)序儀校準(zhǔn)等需要，用于通過(guò)測(cè)序和序列比對(duì)分析來(lái)進(jìn)行基因鑒定的行

業(yè)/科研領(lǐng)域。

大規(guī)模并行測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估是一項(xiàng)跨領(lǐng)域的分析手段，涉及生物信息學(xué)知識(shí)較

多，廣泛影響生物科技的許多方面。例如，在食品領(lǐng)域，即使沒(méi)有參考樣本或參考基因序

列，通過(guò)對(duì)植物或動(dòng)物產(chǎn)品中源性成分各目標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息比對(duì)即

可確定源性，以進(jìn)行物種真實(shí)性鑒定，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜背景樣本和未知物種樣本中各種源性成

分信息的高通量檢測(cè)，用于品牌維護(hù)及肉類摻假鑒定；對(duì)土壤、水體、空氣中微生物及發(fā)

酵產(chǎn)品、果蔬貯藏過(guò)程中微生物的多樣性及功能分析；通過(guò)血清中腫瘤標(biāo)志物的測(cè)定，協(xié)

助腫瘤的診斷、預(yù)后判斷及療效評(píng)價(jià)；通過(guò)檢測(cè)腫瘤患者特定的基因變異情況，協(xié)助實(shí)施

針對(duì)靶點(diǎn)的精準(zhǔn)治療方案；基于reads深度、雙末端映射、拆分read、從頭拼接等方法檢

測(cè)拷貝數(shù)變異，以探究人類多種疾病的成因。

大規(guī)模并行測(cè)序技術(shù)由于其準(zhǔn)確性和檢測(cè)通量改變了整個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展。一次高通

量測(cè)序可以讀取400000-4000000條序列，不同的測(cè)序平臺(tái)可讀取到的堿基數(shù)不等，測(cè)序

平臺(tái)的不斷進(jìn)步與更新促進(jìn)了測(cè)序方法/儀器的廣泛發(fā)展，目前NGS的主要代表平臺(tái)有

Illumina公司的Solexa基因組分析儀、華大基因的MGISEQ-2000平臺(tái)及ABI的SOLiD測(cè)

序儀，Solexa聚合酶合成測(cè)序的關(guān)鍵技術(shù)是：“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)”，SOLiD

8

連接酶測(cè)序取代了傳統(tǒng)PCR，可對(duì)單拷貝DNA片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量測(cè)序。

然而，對(duì)測(cè)序所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與分析仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。首先，一次測(cè)序得到海

量數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)分析處理需采用大量軟件及工具，要求試驗(yàn)人員熟練操作各項(xiàng)軟件并具有

生物信息學(xué)知識(shí)的儲(chǔ)備；其次，測(cè)序過(guò)程中存在儀器報(bào)錯(cuò)的可能性，影響測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量，

加大數(shù)據(jù)分析難度；此外，核酸濃度及純度未達(dá)到測(cè)序要求、選擇不合適的文庫(kù)制備方法

會(huì)影響測(cè)序結(jié)果，導(dǎo)致檢測(cè)效率低、準(zhǔn)確性差。

本標(biāo)準(zhǔn)的研制有利于提高測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可信度、支持測(cè)序方法的選擇和優(yōu)化、

提供可用于性能資質(zhì)鑒定的關(guān)鍵性能參數(shù)。具有更高可信度的生物技術(shù)和生物學(xué)工業(yè)數(shù)

據(jù)，能實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的共享，提升檢測(cè)準(zhǔn)確性，減少風(fēng)險(xiǎn)和成本，促進(jìn)國(guó)際交流。

六、采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度，以及與國(guó)際、國(guó)外同類標(biāo)準(zhǔn)水平

的對(duì)比情況，或與測(cè)試的國(guó)外樣品、樣機(jī)的有關(guān)數(shù)據(jù)對(duì)比情況

本標(biāo)準(zhǔn)等同采用ISO20397-2:2021《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)

的質(zhì)量評(píng)估》，與ISO20397-2:2021無(wú)技術(shù)差異。

七、在標(biāo)準(zhǔn)體系中的位置，與現(xiàn)行相關(guān)法律、法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)，特別是強(qiáng)制性標(biāo)

準(zhǔn)的協(xié)調(diào)性

本專業(yè)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)體系框架如圖：

9

本標(biāo)準(zhǔn)屬于生化檢測(cè)專用方法標(biāo)準(zhǔn)中23-00的數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)庫(kù)類的23-03數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)

庫(kù)安全標(biāo)準(zhǔn)小類。

本標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行相關(guān)法律、法規(guī)、規(guī)章及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。

本標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行有效的標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有沖突，配套使用。

八、重大分歧意見(jiàn)的處理經(jīng)過(guò)和依據(jù)

無(wú)重大分歧意見(jiàn)。

10

九、標(biāo)準(zhǔn)性質(zhì)的建議

建議本標(biāo)準(zhǔn)為推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

十、貫徹國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議（包括組織措施、技術(shù)措施、過(guò)渡辦法

等內(nèi)容）

1）首先應(yīng)在實(shí)施前保證測(cè)序儀的正常運(yùn)行，使研究單位以及檢測(cè)機(jī)構(gòu)等都能正常檢

測(cè)樣本，這是保證新標(biāo)準(zhǔn)貫徹實(shí)施的基礎(chǔ)。

2）本次制定的標(biāo)準(zhǔn)，不僅與測(cè)序平臺(tái)有關(guān)，而且與研究院所、檢測(cè)機(jī)構(gòu)、醫(yī)藥生產(chǎn)

等相關(guān)。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)使用過(guò)程中容易出現(xiàn)的疑問(wèn)，起草單位有義務(wù)進(jìn)行必要的解釋。

3）可以針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)使用的不同對(duì)像，如生產(chǎn)企業(yè)、質(zhì)量監(jiān)管等相關(guān)部門，有側(cè)重點(diǎn)地

進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的培訓(xùn)和宣貫，以保證標(biāo)準(zhǔn)的有效貫徹執(zhí)行。

4）建議本標(biāo)準(zhǔn)批準(zhǔn)發(fā)布即實(shí)施。

十一、廢止現(xiàn)行有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議

無(wú)。

十二、其他應(yīng)予說(shuō)明的事項(xiàng)。

暫無(wú)說(shuō)明事項(xiàng)。

11

目錄

一、工作簡(jiǎn)況...........................................................................3

二國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容..............................................4

三、主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）情況；...........................................................6

四、標(biāo)準(zhǔn)中涉及專利的情況...............................................................8

五、預(yù)期達(dá)到的社會(huì)效益、對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的作用等情況.........................................8

六、采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度，以及與國(guó)際、國(guó)外同類標(biāo)準(zhǔn)水平的對(duì)比情況，或與測(cè)試的國(guó)

外樣品、樣機(jī)的有關(guān)數(shù)據(jù)對(duì)比情況.........................................................9

七、在標(biāo)準(zhǔn)體系中的位置，與現(xiàn)行相關(guān)法律、法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)，特別是強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)性...........9

八、重大分歧意見(jiàn)的處理經(jīng)過(guò)和依據(jù)......................................................10

九、標(biāo)準(zhǔn)性質(zhì)的建議....................................................................11

十、貫徹國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議（包括組織措施、技術(shù)措施、過(guò)渡辦法等內(nèi)容）............11

十一、廢止現(xiàn)行有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議..........................................................11

十二、其他應(yīng)予說(shuō)明的事項(xiàng)。............................................................11

2

一、工作簡(jiǎn)況

1任務(wù)來(lái)源

本項(xiàng)目根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)于2022年4月22日下達(dá)的2022年第一批推薦性

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃的通知（國(guó)標(biāo)委綜合〔2022〕17號(hào)，本項(xiàng)目計(jì)劃編號(hào)為20220184-T-469，

名稱為生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估，本標(biāo)準(zhǔn)等同采用ISO

20397-2：2021《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估》。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC387）提出并歸口。

2標(biāo)準(zhǔn)編制過(guò)程和主要工作過(guò)程

預(yù)研和起草階段：2022年4月，標(biāo)準(zhǔn)起草單位根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)于2022年

4月22日下達(dá)的2022年第一批推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃的通知（國(guó)標(biāo)委發(fā)〔2022〕17號(hào)文）

和全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)生檢標(biāo)〔2022〕16號(hào)文件《關(guān)于下達(dá)2022年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

制修訂計(jì)劃的通知（第一批）》立項(xiàng)文件的要求，成立了以中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院為牽頭單

位的標(biāo)準(zhǔn)起草工作組（以下簡(jiǎn)稱“工作組”）。2022年5月，工作組按照GB/T1.1-2020《標(biāo)

準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》、GB/T1.2-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作

導(dǎo)則第2部分：以ISO/IEC標(biāo)準(zhǔn)化文件為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)化文件起草規(guī)則》的要求完成

ISO20397-2：2021標(biāo)準(zhǔn)的翻譯校對(duì)工作，并針對(duì)國(guó)內(nèi)測(cè)序領(lǐng)域有關(guān)測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)情況進(jìn)行了

調(diào)研，國(guó)內(nèi)測(cè)序儀、測(cè)序方法、測(cè)序樣本要求等相關(guān)的采用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有23個(gè)，食品、

環(huán)境、植物、動(dòng)物、醫(yī)藥等各行各業(yè)都有一些標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。但評(píng)價(jià)測(cè)序數(shù)據(jù)的有效標(biāo)準(zhǔn)僅1

個(gè)，GB/T35890-2018《高通量測(cè)序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范》，是關(guān)于序列描述格式規(guī)范和高

通量測(cè)序數(shù)據(jù)整體格式的規(guī)定。關(guān)于測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估的現(xiàn)行有效的標(biāo)準(zhǔn)，ISO有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，

ISO20397-2-2021《Biotechnology—Massivelyparallelsequencing—Part2:Quality

evaluationofsequencingdata》。目前瑞士也已經(jīng)采用這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)作為他們的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)工作

組調(diào)研，我國(guó)在國(guó)家層面還沒(méi)有通用的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，ISO20397-2-2021標(biāo)準(zhǔn)在

我國(guó)適用。轉(zhuǎn)化ISO20397-2-2021，完善測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估勢(shì)在必行，基于此，本標(biāo)準(zhǔn)

等同采用ISO20397-2：2021《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)

估》，工作組結(jié)合ISO20397-2：2021開(kāi)始完善標(biāo)準(zhǔn)草案初稿。

3

二、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容

1、標(biāo)準(zhǔn)編制原則

本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》

和GB/T1.2-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第2部分：以ISO/IEC標(biāo)準(zhǔn)化文件為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)化文件

起草規(guī)則》的要求進(jìn)行編制。

本標(biāo)準(zhǔn)是在ISO20397-2:2019《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量

評(píng)估》的基礎(chǔ)上，結(jié)合我國(guó)測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估方法，對(duì)ISO20397-2:2019現(xiàn)有的主要內(nèi)容全部

采納而制定成本標(biāo)準(zhǔn)，制定本標(biāo)準(zhǔn)時(shí)遵循以下原則：

1）根據(jù)市場(chǎng)應(yīng)用和行業(yè)技術(shù)的實(shí)際情況出發(fā)，最大限度的促進(jìn)我國(guó)測(cè)序樣本的質(zhì)量

控制、測(cè)序儀器校準(zhǔn)、測(cè)序方法建立、測(cè)序文庫(kù)制備試劑盒的研發(fā)及應(yīng)用等方面的提高與

發(fā)展。本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)整理、評(píng)估，為樣品質(zhì)量檢驗(yàn)提供技術(shù)依據(jù)，并為行業(yè)未來(lái)的技

術(shù)發(fā)展留有一定空間，使標(biāo)準(zhǔn)具有一定的前瞻性。

2）本標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行相關(guān)法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)等協(xié)調(diào)一致。

3）根據(jù)樣品檢測(cè)結(jié)果和實(shí)際需求，在確定本標(biāo)準(zhǔn)的原始數(shù)據(jù)保存格式、質(zhì)量評(píng)估要

求、評(píng)估方法、測(cè)得序列比對(duì)及組裝所用的軟件和工具以及相關(guān)質(zhì)量評(píng)估方法、基因組變

異檢測(cè)、數(shù)據(jù)質(zhì)量驗(yàn)證、測(cè)序靈敏度及特異性驗(yàn)證等內(nèi)容時(shí)，綜合考慮行業(yè)的需求、科學(xué)

研究需要和用戶的利益，尋求最大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，充分體現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)在技術(shù)上的先進(jìn)性、

科學(xué)性和經(jīng)濟(jì)上的合理性。使標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容更加完善、全面，且易于實(shí)施和應(yīng)用。

4）根據(jù)國(guó)情，標(biāo)準(zhǔn)制訂堅(jiān)持面向市場(chǎng)、服務(wù)產(chǎn)業(yè)的原則。結(jié)合我國(guó)測(cè)序領(lǐng)域的實(shí)際

現(xiàn)狀，并以引領(lǐng)和促進(jìn)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量水平的提升為目標(biāo)而修訂，提高標(biāo)準(zhǔn)的綜合水平。使

標(biāo)準(zhǔn)要適應(yīng)市場(chǎng)需求，滿足行業(yè)發(fā)展，為科研開(kāi)發(fā)、企業(yè)的生產(chǎn)、質(zhì)量檢驗(yàn)提供技術(shù)指導(dǎo)，

同時(shí)有助于引導(dǎo)本行業(yè)采用本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范化生產(chǎn)，具有一定的先進(jìn)性。

5）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)編排、編寫格式和內(nèi)容表達(dá)方法等按GB/T1.1-2020等系列標(biāo)準(zhǔn)的

規(guī)定進(jìn)行編寫，使標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化。

2、確定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)全文分為8章和3個(gè)附錄。標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容如表1所示：

表1本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容

章條名稱內(nèi)容簡(jiǎn)要

4

明確了對(duì)質(zhì)量評(píng)估和大規(guī)模并行測(cè)序數(shù)據(jù)的整體要求和建議。涵蓋

1范圍了原始數(shù)據(jù)生成過(guò)程、排序比對(duì)和變量調(diào)用。本文件還提供了MPS

數(shù)據(jù)驗(yàn)證和文檔化的一般指南。

2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件

3術(shù)語(yǔ)和定義ISO界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

包括總體要求、原始數(shù)據(jù)文件、原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估、原始數(shù)據(jù)預(yù)處

4原始數(shù)據(jù)

理等。

描述了應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇校正與比對(duì)策略，包括校正和比對(duì)文件

5序列校正與比對(duì)

格式、質(zhì)量控制、校正后處理等。

描述了不同類型的序列變異應(yīng)采用不同的計(jì)算方法、變異識(shí)別的數(shù)

6變異識(shí)別

據(jù)文件、質(zhì)量指標(biāo)及假陽(yáng)性變異的處理等。

包括生物信息學(xué)流程、試驗(yàn)性能、質(zhì)量參數(shù)等驗(yàn)證，建立原始?jí)A基

7驗(yàn)證

質(zhì)量值閾值、建立去除低質(zhì)量堿基的預(yù)處理方法等。

描述實(shí)驗(yàn)室記錄所有MPS結(jié)果分析、解釋和報(bào)告的算法、軟件和

8文件

數(shù)據(jù)庫(kù)等，以便對(duì)每個(gè)結(jié)果進(jìn)行追溯。

9附錄A資料性附錄，特定MPS平臺(tái)示例的質(zhì)量指標(biāo)

10附錄B資料性附錄，按應(yīng)用劃分的覆蓋范圍和讀取建議

11附錄C資料性附錄，序列比對(duì)和校正軟件

3、主要技術(shù)差異

等同采用了ISO20397-2:2021《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)

量評(píng)估》，本標(biāo)準(zhǔn)與ISO20397-2:2021相比，沒(méi)有技術(shù)差異。

4、標(biāo)準(zhǔn)解決的主要問(wèn)題

ISO20397-2:2021是基礎(chǔ)通用的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)等同采用ISO

20397-2:2021標(biāo)準(zhǔn)，大規(guī)模并行測(cè)序是一種新型的測(cè)序方法，它廣泛地影響生物技術(shù)的許

多方面。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了對(duì)質(zhì)量評(píng)估和大規(guī)模并行測(cè)序數(shù)據(jù)的整體要求和建議。本文件適用

于測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估與驗(yàn)證。確定了原始數(shù)據(jù)的評(píng)估指標(biāo)（序列長(zhǎng)度分布、每個(gè)序列GC

含量、質(zhì)量值、序列重復(fù)水平、超出閾值水平、集群密度、出錯(cuò)率等）、分析用于不同應(yīng)

用的序列校正及比對(duì)軟件；測(cè)序校正和比對(duì)的質(zhì)量控制，包括單端測(cè)序片段比對(duì)，配對(duì)段

測(cè)序片段比對(duì)，子片段的長(zhǎng)度比對(duì)；變異識(shí)別，能識(shí)別SNV、插入缺失、CNV和SVs四

種變異類型，變異識(shí)別質(zhì)量指標(biāo)包括變異質(zhì)量值、等位基因讀取百分比、樣品間污染分析

等；質(zhì)量指標(biāo)驗(yàn)證，包括建立去除低質(zhì)量堿基的方法、確定比對(duì)質(zhì)量參數(shù)、定義平均覆蓋

范圍；高通量測(cè)序方法特異性及靈敏度確認(rèn)（單一物種驗(yàn)證、混合樣品檢測(cè)、不同加工方

式樣品檢測(cè)）。

5

三、主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）情況；

本標(biāo)準(zhǔn)等同采用了ISO20397-2：2021《生物技術(shù)大規(guī)模并行測(cè)序第2部分：測(cè)序

數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估》。本標(biāo)準(zhǔn)與ISO20397-2：2021相比，沒(méi)有技術(shù)差異。主要技術(shù)指標(biāo)在

全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口的肉類摻假檢測(cè)的測(cè)序相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證，

以下列出了測(cè)序部分技術(shù)指標(biāo)的試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果。

1、單一物種樣品

對(duì)黃牛、牦牛、山羊、綿羊、雞、鴨、鵝、豬、馬、驢10個(gè)單一物種樣品的具體名

稱模糊處理，僅標(biāo)記相應(yīng)序號(hào)，將樣品DNA與構(gòu)建好引物擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序，測(cè)序

后比對(duì)位點(diǎn)序列，并設(shè)定序列相似性閾值，即非目標(biāo)物種位點(diǎn)的序列相似性的最大值，序

列相似性大于閾值的測(cè)序片段（reads）為有效reads，有效reads數(shù)大于100的位點(diǎn)則可判

為有效位點(diǎn)。結(jié)果如表1：

表110種單一樣品測(cè)序比對(duì)結(jié)果

序總位檢出位

樣品檢出位點(diǎn)總reads數(shù)檢出物種

號(hào)點(diǎn)數(shù)點(diǎn)數(shù)

1馬肉10HS-1~HS-5、HS-7~HS-1092943672馬(Equuscaballus)

2雞肉10CN-1~CN-3、CN-5~CN-982280390雞(Gallusgallus)

鴨(Anas

3鴨肉5DC-1~DC-551670754

poecilorhyncha)

4驢肉8DN-1~DN-882770142驢(Equusasinus)

5鵝肉9GS-1~GS-993330738鵝(Anseranser)

6豬肉7PG-2~PG-5、PG-753547802豬(Susbarbatus)

7黃牛肉5CA-2~CA-5420965878黃牛(Bostaurus)

8牦牛肉3YK-2、YK-324183222牦牛(Bosgrunniens)

GT-1~GT-4、GT-7~GT-8、山羊(Capra

9山羊肉1073411738

GT-10caucasica)

10綿羊肉3SH-1~SH-3311979056綿羊(Ovisaries)

單一物種樣品測(cè)序結(jié)果表明，驢、鴨、鵝、綿羊肉檢出的位點(diǎn)數(shù)分別為8、5、9、3，

檢測(cè)準(zhǔn)確率為100%，黃牛、馬、雞、山羊肉的位點(diǎn)檢出率也較高，在70%~90%之間。表

明測(cè)序準(zhǔn)確率較高，可準(zhǔn)確鑒別常見(jiàn)的肉類物種，與預(yù)期相符。

2、模擬混合樣品檢測(cè)

為驗(yàn)證高通量測(cè)序技術(shù)在混合樣品檢測(cè)中的靈敏度，分別對(duì)驢肉摻入比例為0.1%、

1%、10%、20%的混合樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果顯示，檢出限可達(dá)肉含量的0.1%，檢測(cè)結(jié)

6

果如表2所示，即使混樣中所含的DNA分子量小，但對(duì)摻假成分檢出影響較小，該方法

能鑒定混合樣品中的各源性成分，靈敏度較高。

表2模擬摻假樣品高通量測(cè)序結(jié)果

摻入比例檢出物種

編號(hào)總reads數(shù)檢出位點(diǎn)

驢(%)馬(%)雞(%)（位點(diǎn)數(shù)）

DN-2~DN-8、HS-1~HS-5、HS-7、

驢(7)，馬(8)，

YL010.149.9549.954661628HS-9~HS-10、CN-1~CN-3、CN-5~

雞(8)

CN-9

DN-2~DN-8、HS-1~HS-5、HS-7、

驢(7)，馬(8)，

YL02149.549.54482238HS-9~HS-10、CN-1~CN-3、CN-5~

雞(8)

CN-9

DN-1~DN-8、HS-1~HS-5、HS-7、

驢(8)，馬(8)，

YL031045454690626HS-9~HS-10、CN-1~CN-3、CN-5~

雞(8)

CN-9

DN-1~DN-8、HS-1~HS-5、HS-7、

驢(8)，馬(8)，

YL042040403668332HS-9~HS-10、CN-1~CN-3、CN-5~