組培苗生產(chǎn)技術(shù)-外植體的選擇、處理與接種（植物組織培養(yǎng)課件）

外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)

一、外植物體的選擇與處理（一）外植體的選擇1、外植體（Explant）：是指植物離體培養(yǎng)中的各種接種材料。包括植物體的各個器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。2、外植體選擇的要求選擇優(yōu)良的種質(zhì)：材料的選擇要有目的,具有一定的代表性,提高成功率,增加實用性。選擇健壯的植株：選取發(fā)育正常的器官或組織，因為這些器官或組織代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，組培易成功。選擇合適的大小：根據(jù)不同的植物而異，太大容易污染，太小，多形成愈傷組織甚至難于成活。一般在0.5-1.0cm之間。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小。選擇最適的時期：組織培養(yǎng)選擇材料時，一般按植物生長的最適時期選取材料，要注意植物的生長季節(jié)和植物的生長發(fā)育階段。這樣不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高；花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉發(fā)育到單核期時取材，這時比較容易形成愈傷組織。（二）外植體的處理1、外植體的基因型不同種類的植物同一植物的不同器官

對誘導(dǎo)條件反應(yīng)是不一致的，有的部位誘導(dǎo)分化的成功率高，有的部位卻很難脫分化，或者再分化頻率很低單子葉植物不易誘導(dǎo)器官發(fā)生。b.木本植物較難誘導(dǎo)。c.存在基因型差異（如番茄29%~63%）d.開始生長季節(jié)取材容易誘導(dǎo)。外植體種類及基因型外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)

任務(wù)外植體的選擇與處理

任務(wù)：

以小組為單位，取飄香藤頂芽或葉片，進(jìn)行無菌操作，要求每瓶接種1-2個材料，接種完成后，作記號，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，7天后記錄觀察結(jié)果并完成實訓(xùn)報告。四、外植體的接種（一）外植體的接種（無菌操作）

是把經(jīng)過表面消毒后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞，并將它們轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。整個接種過程均須無菌操作。操作過程中引起的污染，主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，應(yīng)特別注意防止工作人員本身引起的污染。接種注意事項1．操作人員需著經(jīng)消毒的白色工作服，戴口罩。進(jìn)入接種室前，工作人員的雙手必須進(jìn)行消毒，用肥皂和水洗滌能達(dá)到良好的效果,進(jìn)行操作前再用70%的酒精擦洗雙手。2．操作期間經(jīng)常用75%的酒精擦拭雙手和臺面。特別注意防止“雙重傳遞”的污染，例如器械被手污染后又污染培養(yǎng)基等。

3．在打開培養(yǎng)瓶、三角瓶或試管時，最大的污染危險是管口邊沿沾染的微生物落入管內(nèi)，解決這個問題，可在打開前用火焰燒瓶口。如果培養(yǎng)液接觸了瓶口，則瓶口要燒到足夠的熱度，以殺死存在的細(xì)菌。為避免灰塵污染瓶口，可用紙包扎瓶口和塞子，以遮蓋瓶子頸部和試管口，相對地減少污染機(jī)會。4．工具用后及時消毒，避免交叉污染。5．工作人員的呼吸也是污染的主要途徑。通常在平靜呼吸時細(xì)菌是很少的，但是談話或咳嗽時細(xì)菌便增多，因此操作過程應(yīng)禁止不必要的談話并戴上口罩。

6．由于空氣中有灰塵，因此在操作時，仍要注意避免灰塵的落入。盡量把蓋子蓋好，當(dāng)打開瓶子或試管時，應(yīng)拿成斜角，以免灰塵落入瓶中。刀、剪、鑷等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用時在火焰上消毒，待冷卻后使用。每次使用前均需進(jìn)行用具消毒。外植體接種全過程酒精擦拭手外植體消毒浸泡5min器械消毒酒精燈灼燒酒精擦拭培養(yǎng)皿酒精擦拭旋轉(zhuǎn)灼燒取外植體接種蓋好瓶塞修剪外植體滅菌燒杯、無菌水、洗液、滅菌劑、鑷子、超凈臺等工作前準(zhǔn)備任務(wù)實施分六組，各組采取植物外植體進(jìn)行消毒1、外植體的選取2、外植體的消毒工作實施外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)

外植體的消毒是組培成功與否的第一關(guān)鍵步驟。

外植體的預(yù)處理：對外植體進(jìn)行修整,去掉不要的部分,在流水下沖洗干凈.

外植體的表面滅菌：原則：充分滅菌，但不傷外植體；不同的外植體，滅菌的要求也不一樣。三、外植體的消毒外植體消毒滅菌的要求包括兩個方面：把外植體上帶的一切微生物，包括真菌、細(xì)菌及其他微生物都?xì)⑺啦荒軗p傷組織材料，保持外植體的生活力，使外植體在良好的培養(yǎng)條件下很快恢復(fù)生機(jī)，正常生長和繁殖.消毒劑的要求要求：具有良好的消毒作用，既不會殺死植物的組織細(xì)胞，又易被無菌水沖洗掉，不影響消毒后外植體的生長和分化.滅菌劑使用濃度（%）清除的難易消毒時間效果次氯酸鈉9—10易5—30很好次氯酸鈣2易5—30很好漂白粉飽和濃度易5—30很好氯化汞0.1—1較難2—10最好酒精70—75易0.2—2好過氧化氫10—12最易5—15好溴水1—2易2—10很好硝酸銀1較難5—30好抗菌素4—50mg/L中30—60較好常用滅菌藥劑的使用和效果外植體消毒順序:滅菌燒杯、無菌水、洗液、滅菌劑、鑷子、超凈臺等工作前準(zhǔn)備任務(wù)實施分六組，各組采取植物外植體進(jìn)行消毒1、外植體的選取2、外植體的消毒工作實施外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)

二、外植物體的種類與選擇（一）外植體的類型1、莖尖（園藝植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最多，繁殖率高，不易發(fā)生遺傳變異，但取材有限）2、莖段（采用嫩莖的切段促進(jìn)腋芽萌發(fā)，取材容易）3、葉（幼嫩葉片組織通過愈傷組織或不定芽分化產(chǎn)生植株，取材容易，操作方便，但易發(fā)生變異）；4、花球和花蕾5、種子、根、塊根、塊莖、花瓣等。（二）實例分析1、花卉（非洲菊）常用莖尖、嫩葉、花托進(jìn)行非洲菊的組織培養(yǎng)，也有利用種子進(jìn)行組織培養(yǎng)的。莖尖培養(yǎng)操作麻煩，但對于脫毒苗的生產(chǎn)是最有效的。花托培養(yǎng)可直接成苗，既可保持種性，又易行、耗時短，是首選的外植體。

首先要選擇花大、花色艷麗、市場流行的品種，然后再選擇無病蟲害、植株生長健壯、花色純正的優(yōu)良品種單株進(jìn)行取材。一旦選出優(yōu)株后，應(yīng)進(jìn)行掛牌標(biāo)記，并一直在其上采取花蕾。作為外植體的花蕾要選取直徑在1㎝左右，而且未露心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能獲得滿意的效果。2、水果（草莓）（1）選擇結(jié)果性優(yōu)良的草莓母株上新抽出的匍匐莖作外植體，以每年6～7月份最為適宜。（2）在無病蟲害的田塊，連續(xù)晴天3～4d時選取生長健壯、新萌發(fā)且未著地的匍匐莖段3cm長作外植體。3、蔬菜（龍牙百合）龍牙百合特征:鱗莖，無皮，廣卵形，外部鱗片長,將整個鱗莖包裹，直徑5~15厘米，白色，莖高90厘米左右，直立莖上葉多而散生，披針形，葉色從濃綠，光滑?；▎紊o頂?；ǘ涑世葼铋L筒形，白色，有清香。

龍牙百合的許多器官、組織都可作為外植體，如鱗片、花梗、葉片、莖尖、腋芽、花瓣、