人類基因組計(jì)劃

人類基因組計(jì)劃生命科技學(xué)院李友勇第一部分：?jiǎn)栴}的提出一、問(wèn)題的提出

人類在改造自然界、改造動(dòng)植物的同時(shí)，也需要改造人類本身。優(yōu)生遺傳學(xué)（eugenics）從定性的角度和經(jīng)驗(yàn)的積累提出提高人的質(zhì)量的方法，從遺傳學(xué)角度，來(lái)說(shuō)這是一種無(wú)奈的方式，即，只能用現(xiàn)有的顯性基因去遮蓋有害的隱性基因。這種作法一點(diǎn)也不會(huì)減少人的群體內(nèi)的不良位點(diǎn)頻率。要真正對(duì)人的遺傳物質(zhì)進(jìn)行改良，必須首先弄清人的遺傳結(jié)構(gòu)，即人的46條染色體，應(yīng)該有24個(gè)連鎖群，其上的DNA到底是怎樣的序列，人的基因在哪個(gè)位置上？有多少？功能是什么？這個(gè)問(wèn)題搞清楚了，對(duì)人的遺傳改良不是可以著手了嗎？最初的設(shè)想首先提出測(cè)定人的全部DNA序列的是美國(guó)一個(gè)科學(xué)家，叫Dulbecco，他在1984年提出該設(shè)想，但那時(shí)候人們計(jì)算了一下，這項(xiàng)工作幾乎是一個(gè)不可能事件。他們初步測(cè)知人的24個(gè)連鎖群，DNA長(zhǎng)度約1m，堿基對(duì)有30億對(duì)（3×109）對(duì)，人的基因平均長(zhǎng)度為50kbp（當(dāng)外顯子占3—5%的話），約有6萬(wàn)個(gè)基因。30億對(duì)的核甘酸，每人年可測(cè)15000個(gè)，那末，需20萬(wàn)人年工作量，即2000人預(yù)計(jì)工作100年。實(shí)際要測(cè)量約15個(gè)以上復(fù)本，可見(jiàn)工作量之浩瀚。。問(wèn)題的重新提出1986年3月7日在Science上發(fā)表一篇短文“腫瘤研究的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)：人類基因組的全序列分析”。因?yàn)槟[瘤研究的深入，認(rèn)為是基因表達(dá)的結(jié)果，那么，腫瘤基因在哪？它們什么時(shí)候表達(dá)？怎樣表達(dá)？解決這些問(wèn)題需要弄清人的基因組。此時(shí)，人類基因組研究又提到科學(xué)家面前。技術(shù)進(jìn)步事實(shí)上，1985年，PCR技術(shù)誕生，給基因組計(jì)劃帶來(lái)重大技術(shù)支撐，計(jì)算機(jī)技術(shù)的突飛猛進(jìn)，使測(cè)序的片段銜接更準(zhǔn)確，更快速，原來(lái)估計(jì)的2000人100年（也有人估計(jì)為1000人25年）過(guò)于保守了。二、人類基因組計(jì)劃開(kāi)始1989年1月(January)NortonZinderofRockefellerUniversitychairsthefirstprogramadvisorycommitteemeetingfortheHGP.

（主持了第一個(gè)HGP計(jì)劃會(huì)議）

啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃叫（Humangenomeproject）簡(jiǎn)稱HGP，是1990年開(kāi)始啟動(dòng)的，共有美、英、日、德、法、中六國(guó)科學(xué)家參與，其進(jìn)度遠(yuǎn)比預(yù)期的要快，但遇到的困難和工作量比原先想象的要大得多。好在現(xiàn)在測(cè)序能力大大增加了，每年達(dá)到300億～3萬(wàn)億堿基，相當(dāng)于一年可測(cè)8個(gè)人的基因組的工作量，再加上計(jì)算機(jī)（大型的）的應(yīng)用和方法的改進(jìn)，DNA測(cè)序已變得更簡(jiǎn)單和更適用了。HGP與中國(guó)1998年8月11日，中科院遺傳所“人類基因組中心”成立。

1999年2月，中心決定進(jìn)行大規(guī)?；蚪M測(cè)序，以創(chuàng)造加入“國(guó)際測(cè)序俱樂(lè)部”的條件。同年7月7日，中國(guó)在國(guó)際人類基因組測(cè)序協(xié)作組登記，申請(qǐng)加入“國(guó)際測(cè)序俱樂(lè)部”。中國(guó)是第六個(gè)參與國(guó)

1999年9月1日，倫敦，第五次人類基因組測(cè)序戰(zhàn)略會(huì)議上，北京中心(中科院遺傳所人類基因組中心)作為新的會(huì)員加入,負(fù)責(zé)測(cè)定全部序列的1%，即3號(hào)染色體上的3000萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)。中國(guó)成為繼美、英、日、德、法之后第六個(gè)國(guó)際人類基因組計(jì)劃參與國(guó)，也是參與這一計(jì)劃的唯一的發(fā)展中家。

2000年4月，中國(guó)科學(xué)家提前完成人類基因組計(jì)劃百分之一的測(cè)序任務(wù)，使得這一偉大的科學(xué)工程于6月26日如期完成。三、HGP技術(shù)的回顧四、HGP的目標(biāo)1.遺傳圖譜2.物理圖譜結(jié)構(gòu)基因組學(xué)3.DNA序列4.轉(zhuǎn)錄圖譜功能基因組學(xué)5.基因的功能第二部分：結(jié)構(gòu)基因組學(xué)一、DNA文庫(kù)的取材：選取的原始個(gè)體不同，DNA文庫(kù)的基因序列，DNA序列肯定不同。白種人、黃種人、黑種人、不同地區(qū)的人，選什么人，研究者有他們的想法，可能是科學(xué)家，也可能是他們自己，更可能是隨機(jī)取樣；二、測(cè)序方法的遴選對(duì)文庫(kù)中的各片段逐一測(cè)序，這是一個(gè)工作量很大的課題。目前有兩種思路：第一種是全基因組散彈法（wholegenomeshut-gun)：即從文庫(kù)中隨機(jī)取，然后分析，分析后再根據(jù)堿基序列進(jìn)行拼接，由Celera提出。步驟：取全基因組DNA—→

純化酶切或超聲波打斷—→電泳—→回收DNA片段—→構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)—→轉(zhuǎn)化宿主菌—→擴(kuò)增培養(yǎng)—→提質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR測(cè)序—→上測(cè)序儀—→處理測(cè)序數(shù)據(jù)—→補(bǔ)缺—→完整基因組序列。1.shutgun法全基因組DNA隨機(jī)酶切成小片段拼接補(bǔ)缺完整基因組序列缺點(diǎn)該方法對(duì)總DNA較少的細(xì)菌或噬菌體來(lái)說(shuō)是適合的，但對(duì)像人、高等動(dòng)植物來(lái)說(shuō)，DNA片段那么多，怎么用最少的克隆數(shù)，來(lái)保證每一個(gè)片段都有一次機(jī)會(huì)被分析，難度很大。因此，對(duì)人類全基因組A來(lái)說(shuō)，要建立新的方法。2.層次散彈（hierarchicalshutgun）第二種是層次散彈（hierarchicalshutgun）。即把大的基因組先進(jìn)行分層，如染色體編號(hào)、染色體下片段編號(hào)、小片段上作物理標(biāo)記，然后再對(duì)小片段測(cè)序，這樣使最后“拼接”變得容易得多。①染色體編號(hào)先將各個(gè)染色體分離，編號(hào)：1#，1’#，2#，2’#……以染色體為單位甚至更小的單位用shut-gun方法再進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序的兩種思路（圖）②路標(biāo)技術(shù)在不能切割成小片段進(jìn)而編號(hào)時(shí)，一條染色體上要設(shè)計(jì)幾個(gè)標(biāo)志，相當(dāng)于編號(hào)，稱路標(biāo)技術(shù)（Landmark），這個(gè)路標(biāo)是有順序的，路標(biāo)愈多，之間的距離愈近，路標(biāo)圖譜愈精密。，目前的路標(biāo)有：iSTS標(biāo)志iiEST標(biāo)志iiiSNP標(biāo)志ivRFLP、FLAP標(biāo)志（酶切點(diǎn)標(biāo)志）VSSR標(biāo)記I：STSSTS路標(biāo)：STS（SequenceTaggedSite）是物理路標(biāo)，如用激光切的染色體上DNA段。當(dāng)人的染色體片段在鼠的細(xì)胞中，其標(biāo)記是STS。STS可以較粗（長(zhǎng)），也可以更細(xì)（短）。ii：EST路標(biāo)EST標(biāo)簽：EST（expressedsequencetag）叫表達(dá)序列標(biāo)簽，實(shí)際上是遺傳圖譜，即已知的某一基因序列。用cDNA短片測(cè)序后，可做為EST標(biāo)簽。顯帶法和其他基因定位法鑒別的可表達(dá)基因位點(diǎn)也是EST。iii：RFLP標(biāo)志

RFLP（RestricfionFrafmentlengthpolymophism）叫限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。由于多態(tài)性，同一種酶對(duì)同一區(qū)DNA（不同個(gè)體）進(jìn)行處理，會(huì)得到不同的長(zhǎng)段的區(qū)帶，這個(gè)酶切位點(diǎn)一般是一定的，因此，其片段也是相同的。不同的內(nèi)切酶處理，可得到不同限制性片段，因此有不同長(zhǎng)度的文庫(kù)?？捎脕?lái)進(jìn)行測(cè)序結(jié)果的比較。不同的RFLP酶A

酶B電泳圖iv：SNP路標(biāo)SNP（singlenucleotidepolymorphism）叫單核苷酸多態(tài)性。指基因組中核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性。包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入/缺失等。SNP位點(diǎn)極其豐富，在人的基因組中，每1000bp就會(huì)有1個(gè)SNP，這樣人的基因組中有300萬(wàn)個(gè)SNP。SNPSNP類型從DNA成份上分析，SNP應(yīng)有兩類，一類是在基因內(nèi)，即編碼區(qū)（codingregion）,叫cSNP，第二類是非編碼區(qū)，仍稱SNP。SNP的作用可根據(jù)它的位置而推斷。①作為遺傳圖譜，即此處有一個(gè)特異點(diǎn)；②進(jìn)化多樣性，肯定是分子進(jìn)化的多態(tài)性根源之一；③疾病基因定位及分子原因；三、建立DNA文庫(kù)創(chuàng)造人的46個(gè)染色的DNA文庫(kù)，該DNA是工作的材料。測(cè)序可能要做若干次重復(fù)，因此，要有一定數(shù)量材料做原料DNA文庫(kù),即，可克隆的DNA片段（clonableFragmant）。DNA文庫(kù)有cDNA（complementaryDNA）文庫(kù)和gDNA(genomeDNA)文庫(kù)兩種。DNA文庫(kù)技術(shù)RH（RadiationHybrid）YAC(yeastArtificidchromosome)BAC(BacferialArtificialchromosome)PAC,cosmid,fosmid等.RH（RadiationHybrid）方法將人的細(xì)胞（染色體）用X-光照射打斷染色體，該細(xì)胞與鼠細(xì)胞融合，使DNA片段能插入到鼠的染色體上，，擴(kuò)增的細(xì)胞株中的人DNA片段(5-10Mb)得到克?。ㄒ灿蠸TS出現(xiàn)），用作分析。YAC（YeastArtificialchromosome）方法利用酵母染色體結(jié)構(gòu)和復(fù)制系統(tǒng)（著絲點(diǎn)、端粒、復(fù)制子）來(lái)復(fù)制人的DNA分子；可克隆200～2000kb的DNA；特點(diǎn)：克隆片段大，可達(dá)Mb級(jí)別，用作自動(dòng)分析材料。BAC（BacterialArtificialChromosome）：把人的染色體片段嵌入細(xì)菌的質(zhì)粒（F質(zhì)粒）中，可運(yùn)載擴(kuò)增100～300kbDNA。特點(diǎn)：較小，便于普通測(cè)序。但自動(dòng)測(cè)序時(shí)顯得小。PAC文庫(kù)PAC(P1-derivedArtificialchromosome）是P1噬菌體為載體的DNA文庫(kù)?？梢钥闯?，PAC肯定較小，攜帶90-150kb的DNA。Loannou將PAC用于人基因組，構(gòu)建了12萬(wàn)個(gè)插入片段，長(zhǎng)度為110-120kb，容量是人基因組的3倍。120000×110×1000=1.32×1010/（3×109））=4.4倍，保守即約為3倍。TAC文庫(kù)TAC(Transformation-competentArtificialchromosome)叫可轉(zhuǎn)化人工染色體。載體是pYLTAC7(p1質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒），可用于植物。HAC文庫(kù)HAC(HumanArtificialchromosome)叫人類人工染色體?；蛭膸?kù)所需的克隆數(shù)理論上，一個(gè)細(xì)胞的全套染色體分割的好，就是一個(gè)完整的人的基因文庫(kù)?？寺?shù)=3×109/片段長(zhǎng)若片段平均長(zhǎng)1000kb，有3×109/1000kb=3000個(gè)克隆即夠了。若我們說(shuō)，要有99%的把握保證每一個(gè)片段都存在，需多少個(gè)克?。緾larke-Carbon公式

ln(1-p)N—克隆數(shù)N=————p—把握概率

ln(1-f)f—片段平均長(zhǎng)度/基因組DNA總長(zhǎng)度人的克隆數(shù)N=ln(1-0.99)/ln(1-1000000/(3*109)=-4.6/-0.0003333=13800個(gè)是3000個(gè)的4.6倍。四、DNA序列測(cè)定將DNA片段用熒光等分析儀，測(cè)出DNA序列堿基排列順序。DNA序列測(cè)定方法：1.化學(xué)降解法：G反應(yīng)；G+T反應(yīng)；T+C反應(yīng)和C反應(yīng)；2.Sanger的雙脫氧法：A/T/G/C四個(gè)反應(yīng)。測(cè)序電泳圖3.定向測(cè)序法首先用一輪測(cè)序所得的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一寡核苷酸，充當(dāng)下一輪測(cè)序時(shí)的引物，這樣可逐步分析全部靶DNA的序列。

一輪隨機(jī)引物

二輪測(cè)出的序列作為二輪的引物三輪測(cè)出的序列作為三輪的引物五、組裝與補(bǔ)缺到2001年的9月份，據(jù)報(bào)道有6%的DNA序列非常難測(cè)，找不到規(guī)律。目前已完成達(dá)99.9%，但還有約400個(gè)縫隙有待填補(bǔ)。Celera公司的負(fù)責(zé)人說(shuō)，這些縫隙，主要是染色體的中央和尾部（即著絲點(diǎn)和端粒。附：隨機(jī)測(cè)序法i用內(nèi)切酶及電泳方法，把靶DNA從載體上分離出來(lái)（在基因文庫(kù)中，成段DNA一般與某一種載體結(jié)合著），電泳后純化靶DNA；ii把純化的DNA用連接酶連接起來(lái)，叫環(huán)化（100p）：（目的，確保靶DNA所有區(qū)段再一次被打斷的機(jī)會(huì)相等）；iii在Mn+1存在下，用DNA酶消化（或用超聲波）打斷DNA；iv電泳方式分離大小適中的DNA片段（500～800bp）；v用T4噬菌體DNA聚合酶修補(bǔ)末端，然后連接于預(yù)先制備好的（序列已清楚）載體（如M13MP18，M13、MP19）上。vi將該載體一靶DNA復(fù)合體轉(zhuǎn)染到大腸桿菌中，經(jīng)過(guò)一種叫空斑純化現(xiàn)象分離噬菌體，并獲得單鏈DNA。vii用sanger法和其它方法分析各片段DNA序列；viii，比較或用計(jì)算機(jī)排序，測(cè)出靶DNA序列。DNA序列1，1’2,2’3,3’4,4’……是堿基相同的，因此應(yīng)是連接處，這就是著名的YAC（YeastArtificialchromosome）方法原理，用該方法美國(guó)首先將人的第22染色體，第13染色體測(cè)序完成。組裝分析出各個(gè)片段的DNA序列，最后裝配到一個(gè)染色體上。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)上述方法我們把染色體分離，制備cDNA或gDNA文庫(kù)，再?gòu)膸?kù)中取出DNA片段，制備出標(biāo)簽，建立物理圖譜，再將各段DNA測(cè)序，最后確定出整個(gè)染色體的DNA序列，這就是結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structureGenomics）的研究?jī)?nèi)容。人的基因組圖2000年6月26日公布。人的染色體HGP實(shí)驗(yàn)室（圖）HGP實(shí)驗(yàn)室（圖注）1999年9月，中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃，負(fù)責(zé)測(cè)定全部序列的1%。坐落在北京順義空港工業(yè)園B區(qū)的中科院遺傳所人類基因組中心承擔(dān)了"1%"主要測(cè)序任務(wù)。圖為技術(shù)人員正在準(zhǔn)備從細(xì)菌中分離出DNAHGP實(shí)驗(yàn)室（圖）HGP實(shí)驗(yàn)室（圖注）1999年9月，中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃，負(fù)責(zé)測(cè)定全部序列的1%。坐落在北京順義空港工業(yè)園B區(qū)的中科院遺傳所人類基因組中心承擔(dān)了"1%"主要測(cè)序任務(wù)。圖為每天實(shí)驗(yàn)室消耗的大量實(shí)驗(yàn)槍頭，據(jù)介紹，完成國(guó)際人類基因組計(jì)劃"1%"工作用了1200萬(wàn)個(gè)槍頭。HGP實(shí)驗(yàn)室（圖）HGP實(shí)驗(yàn)室（圖注）1999年9月，中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃，負(fù)責(zé)測(cè)定全部序列的1%。坐落在北京順義空港工業(yè)園B區(qū)的中科院遺傳所人類基因組中心承擔(dān)了"1%"主要測(cè)序任務(wù)。圖為實(shí)驗(yàn)室工作人員在無(wú)菌的狀態(tài)下進(jìn)行操作。我國(guó)的工作人員正在測(cè)序HGP實(shí)驗(yàn)室（圖）HGP實(shí)驗(yàn)室（圖注）1999年9月，中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃，負(fù)責(zé)測(cè)定全部序列的1%。坐落在北京順義空港工業(yè)園B區(qū)的中科院遺傳所人類基因組中心承擔(dān)了"1%"主要測(cè)序任務(wù)。圖為科研人員正在基因測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，實(shí)驗(yàn)室的墻上貼著向國(guó)際組織遞交的數(shù)據(jù)圖。中國(guó)的HGP實(shí)驗(yàn)室(圖）中國(guó)的HGP實(shí)驗(yàn)室（圖注）1999年9月，中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃，負(fù)責(zé)測(cè)定全部序列的1%。坐落在北京順義空港工業(yè)園B區(qū)的中科院遺傳所人類基因組中心承擔(dān)了"1%"主要測(cè)序任務(wù)。1999年4月至今，被實(shí)驗(yàn)人員成為“元老”的中心的第一臺(tái)計(jì)算機(jī)仍在24小時(shí)運(yùn)行。圖為這臺(tái)計(jì)算機(jī)上擺放著三根玉米棒，旁邊有一行字：窮棒子精神永遠(yuǎn)光芒。HGP實(shí)驗(yàn)室（圖）圖注：基因測(cè)序1999年9月，中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃，負(fù)責(zé)測(cè)定全部序列的1%。坐落在北京順義空港工業(yè)園B區(qū)的中科院遺傳所人類基因組中心承擔(dān)了"1%"主要測(cè)序任務(wù)。圖為科研人員正在基因測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。HGP實(shí)驗(yàn)室：基因測(cè)序1999年9月，中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃，負(fù)責(zé)測(cè)定全部序列的1%。坐落在北京順義空港工業(yè)園B區(qū)的中科院遺傳所人類基因組中心承擔(dān)了“1%”主要測(cè)序任務(wù)。圖為2001年5月，他們從美國(guó)引進(jìn)的三十臺(tái)世界上最先進(jìn)的基因測(cè)序儀。這使中國(guó)的基因測(cè)序能力提高了五倍，超過(guò)了原來(lái)領(lǐng)先于中國(guó)的德國(guó)和法國(guó)，僅次于美國(guó)、英國(guó)和日本。公布人類基因組草圖德國(guó)教育和科技部長(zhǎng)在公布基因草圖測(cè)序結(jié)果2001.2.13德國(guó)教育和科技部長(zhǎng)在公布人的基因組草圖測(cè)序結(jié)果2001.2.13國(guó)家主席江澤民2001.08.28在北京會(huì)見(jiàn)來(lái)華參加“人類基因組測(cè)序第十次戰(zhàn)略會(huì)議”的科學(xué)家人類基因組計(jì)劃“中國(guó)卷”完成通過(guò)有關(guān)專家的驗(yàn)收2001年8月26日，人類基因組計(jì)劃“中國(guó)卷”完成，其基因組圖在北京通過(guò)了國(guó)家科學(xué)技術(shù)部等部門有關(guān)專家的驗(yàn)收。中國(guó)承擔(dān)的任務(wù)

中國(guó)作為參加人類基因組計(jì)劃六個(gè)成員國(guó)中惟一的發(fā)展中國(guó)家，承擔(dān)了1%的測(cè)序任務(wù)，承擔(dān)區(qū)域：3號(hào)染色體短臂端粒至D3S3397(37CM)。（D-DNA;3-片段的位置，第三染色體；S-代表這是一條獨(dú)一無(wú)二的DNA片段;397—編號(hào)）.DNA片段的命名1DNA片段的命名一般由四部分組成。第一部分用D表示DNA；第二部分用0、1、2、…、22；X、Y：XY表示DNA片段所在的染色體位置,其中0代表還不知染色體位置,而XY表示片段在X和Y染色體上都有該片段；第三部分表示用探針檢測(cè)到的DNA片段的復(fù)雜程度,S代表這是一條獨(dú)一無(wú)二的DNA片段,Z代表在染色體一個(gè)單一位置重復(fù)出現(xiàn)的DNA片段,F代表在多條染色體上都存在同源序列但還沒(méi)有定義家族的DNA片段；

DNA片段的命名2第四部分為區(qū)分不同的DNA片段加上一個(gè)數(shù)字編號(hào),比如微衛(wèi)星DNA標(biāo)簽(microsatelliteDNAmarker)DXS990表示在X染色體上獨(dú)一無(wú)二的編號(hào)990的DNA片段。如果DNA片段是一個(gè)表達(dá)序列,可在上述四部分后加一個(gè)后綴E。完成情況

1、

經(jīng)過(guò)作圖、大規(guī)模測(cè)序(工作框架圖階段和完成圖階段)后，最終獲得精確度達(dá)99.99%(相當(dāng)于錯(cuò)誤率低于萬(wàn)分之一)的完成圖序列17.4Mb，所有BAC序列都經(jīng)過(guò)指紋圖譜的驗(yàn)證。2、在端粒位置目前尚存在一段約40-50Kb的技術(shù)性空缺(根據(jù)含有端粒序列的半YAC序列與已測(cè)序列的重疊度推斷)。

3、除上述區(qū)域外，還完成了包括3號(hào)染色體其他區(qū)域以及其他染色體部分區(qū)域的序列14.2Mb，共完成31.6Mb的序列測(cè)定，有效總讀長(zhǎng)為384.2Mb。4、經(jīng)過(guò)序列分析，在3P端粒至D3S3397區(qū)域，共識(shí)別122個(gè)基因，其中86個(gè)是已知基因(55個(gè)為功能明確的基因，8個(gè)為疾病相關(guān)基因)；在31個(gè)基因中找到了75種不同的剪切方式；發(fā)現(xiàn)了1760個(gè)新的SNP(dbSNP中未報(bào)道)；還進(jìn)行了完成圖中重復(fù)序列、CpG島、GC含量的分析。意義

1%測(cè)序工作的完成將中國(guó)已有的測(cè)序隊(duì)伍完善成具有基因組文庫(kù)建立與篩選能力、大規(guī)模測(cè)序能力、生物信息處理能力的生力軍。我國(guó)基因組測(cè)序能力的建立將使我國(guó)能在小鼠、水稻等模式動(dòng)、植物基因組的國(guó)際測(cè)序計(jì)劃中發(fā)揮更大作用，也能使我國(guó)有足夠的技術(shù)力量啟動(dòng)具有中國(guó)資源特色的其他基因組研究。同時(shí)，該項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中所建立的研究基地和隊(duì)伍，可與生物產(chǎn)業(yè)界合作，開(kāi)展以獲取自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)為主的基因組研究項(xiàng)目。

第三部分：功能基因組學(xué)人類基因組學(xué)完成后，到2000年3月，有13種古細(xì)菌、58種細(xì)菌、7種真核生物的基因組DNA序列分析完成，下一步的工作就是解析其上的各個(gè)基因，這就是功能基因組學(xué)。功能基因組學(xué)（functionalgenomics)又叫后基因組學(xué)（post-genomics)，即，研究DNA序列上的基因及位置的學(xué)科。當(dāng)DNA測(cè)序完成后，需要確定出基因及所在位置，這是GHP的后5年的工作任務(wù)，如何對(duì)基因進(jìn)行定位，有以下幾種方法：1．測(cè)定序列時(shí)的遺傳標(biāo)志，即為基因所在位置如用mRNA探針，實(shí)際上，性狀→分析出其蛋白質(zhì)氨基酸序列→mRNA序列→與DNA對(duì)應(yīng)的序列，已知的蛋白質(zhì)能很快地將其基因定位。2．未知位點(diǎn)的基因測(cè)定及其定位——反求法遺傳學(xué)作圖目前預(yù)測(cè)人類中有6萬(wàn)個(gè)以上基因，用分析的方法測(cè)出的不超過(guò)一半，另外的幾萬(wàn)個(gè)基因在哪？功能是什么？這成為功能基因組學(xué)研究的重大課題。傳統(tǒng)方法是根據(jù)性狀，推斷基因存在。用連鎖方法作圖。反求法是用突變序列，觀察性狀變化，即可認(rèn)定基因在此。①功能喪失法（loss-of-function）第一步，用一個(gè)正常性狀的個(gè)體，標(biāo)志其DNA序列，認(rèn)定為正?；?；第二步，創(chuàng)造一個(gè)突變的DNA序列（測(cè)知與正常序列的差別）；第三步，讓突變的序列代替正常序列；微生物中是用不同品系雜交，使之產(chǎn)生重組，可把突變區(qū)段轉(zhuǎn)到正常個(gè)體中。其它生物用點(diǎn)突變方法。第四步，觀察正常個(gè)體性狀發(fā)生了什么變化，變化后的性狀，即為該基因的性狀。②轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法轉(zhuǎn)座子，又叫跳躍基因（Jumppinggene）,一段DNA，400—800對(duì)堿基，當(dāng)它插入到哪個(gè)部位后，該旁的基因往往喪失功能，因而出現(xiàn)性狀變異。轉(zhuǎn)座子目前已用的轉(zhuǎn)座子，如玉米中，Ac/Ds系統(tǒng)，En/Epm系統(tǒng).果蠅中，Copia,FB,P

酵母中：δ,Tr1T—DNA原理轉(zhuǎn)座子上可帶有標(biāo)志基因（remarkergene），也可以是其它標(biāo)志如放射性標(biāo)記32P，（生物素標(biāo)志）等，當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到受體染色體中后，觀察性狀變異，再分析轉(zhuǎn)座子的位置。轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化

Cccc

有色無(wú)色分析轉(zhuǎn)座子位置的方法①探針，→Southernblot②PCR→與基因組比較法根據(jù)轉(zhuǎn)座子或T—DNA的標(biāo)志基因，分離出這一段DNA→把DNA克?。≒CR）→測(cè)序→與基因組比較，重復(fù)的序列即為基因的位置。③MegaclonTM技術(shù)MegaclorleTM技術(shù)是通過(guò)將DNA固定于微粒(Micro—beads)上來(lái)進(jìn)行DNA文庫(kù)構(gòu)建的一種技術(shù)。用該技術(shù)可以進(jìn)行基因表達(dá)的差異顯示，并進(jìn)一步分離新的基因。利用Mega—cloneTM技術(shù)，可以將約100萬(wàn)種的DNA一次性地固定到Micro—beads上，一個(gè)Micro—beads上含有104～105個(gè)相同序列的DNA分子。在此過(guò)程中，先將欲固定的DNA與約1670萬(wàn)種不同的Tag相連接，然后通過(guò)Tag與固定于Micro—beads上的Anti—Tag(序列與Tag互補(bǔ))進(jìn)行雜交，將DNA固定到特定的Micro—beads上。Anti—Tag就如“Micro—beads”這個(gè)“家”中的門牌號(hào)，而Tag猶如“郵包”上書寫的“郵寄地址”。一個(gè)Micro—beads上只固定一種來(lái)源于mRNA的cDNA，在固定各種mRNA的cDNA時(shí)，不需要了解被固定的mRNA的任何信息，即使是沒(méi)有任何信息來(lái)源的生物物種，其mRNA來(lái)源的cDNA也可以固定于Micro—beads上。

sstagcDNA文庫(kù)的構(gòu)建首先，需要準(zhǔn)備帶有1670萬(wàn)種Tag的DNA載體。Tag是一種32個(gè)堿基的短鏈DNA，通過(guò)對(duì)這32個(gè)堿基的排列組合(），可能合成Tm值相近的1670萬(wàn)條OligoDNA。

把細(xì)胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，克隆至帶有1670萬(wàn)種Tag的DNA載體庫(kù)中，形成TagadaptedcDNALibrary。在此cDNALibrary中，使每種Tag只對(duì)應(yīng)一種cDNA。使用PCR法擴(kuò)增帶有各種Tag的cDNA片段，然后在T4DNA聚合酶的作用下，使其產(chǎn)生單鏈Tag的ssTagadaptedcDNA文庫(kù)。1．2cDNA和Micro—beads的結(jié)合

Micro—beads的直徑約為5μm，每顆Micro—beads上固定有一種Anti—Tag(32個(gè)堿基)，約有1