分子遺傳學基礎-基因工程的操作程序（遺傳學課件）

PCR擴增技術內(nèi)容一二三四五聚合酶鏈式反應示意圖PCR反應的條件PCR反應的溫度循環(huán)周期PCR引物PCR技術的應用在1983年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的科學家K.B.Mullis發(fā)明的。

PCR是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，有稱之為體外擴增法。聚合酶鏈式反應示意圖一、聚合酶鏈式反應示意圖PCR反應的溫度循環(huán)周期二、PCR反應的溫度循環(huán)周期PCR反應的溫度循環(huán)周期二、PCR反應的溫度循環(huán)周期三、PCR反應的條件PCR反應的條件PCR引物：與待擴增的靶DNA區(qū)段兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸片斷。其長度通常在15~30個核苷酸之間。簡并引物：簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。

四、PCR引物1、基因組克隆2、突變體的鑒定和在PCR過程中有目的的添加核酸序列。五、PCR技術的應用：在引物的5’端參入額外的DNA序列Ti質(zhì)粒介導的整合轉(zhuǎn)化程序內(nèi)容一二三四Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制Ti質(zhì)粒的結(jié)構與功能共整合轉(zhuǎn)化程序T-DNA染色體整合機制Ti質(zhì)粒的改造二元共整合轉(zhuǎn)化程序一、Ti質(zhì)粒的結(jié)構與功能幾乎所有的雙子葉植物尤其是豆科類植物的根部常常會形成根瘤，其根部致瘤特性是由一種革蘭氏陰性土壤農(nóng)桿菌細胞內(nèi)的野生型Ti質(zhì)粒介導所致的。Ti質(zhì)粒的圖譜整個質(zhì)粒160-240kb，其中T-DNA12-24kb。tms

的編碼產(chǎn)物負責：合成吲哚乙酸；tmr

的編碼產(chǎn)物負責：合成植物分裂素；tmt

的編碼產(chǎn)物負責：合成氨基酸衍生物冠癭堿。二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制(一)、損傷的植物根部會分泌出乙酰丁香酸和羥基乙酰丁香酸。

二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制（二）、它們能誘導Ti質(zhì)粒上的vir基因以及根瘤菌染色體上的一個操縱子表達。二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制（三）、vir基因產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的T-DNA單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達產(chǎn)物則與單鏈T-DNA結(jié)合形成復合物。二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制（四）、復合物轉(zhuǎn)化植物根部細胞二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制三、T-DNA的染色體整合機制四、Ti質(zhì)粒的改造（一）、除去T-DNA上的生長素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因為大量的生長素和分裂素會抑止細胞再生長為整株植物；（二）、除去T-DNA上的有機堿生物合成基因（tmt）；因為有機堿的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影響植物細胞的生長；（三）、除去Ti質(zhì)粒上的其它非必需序列，最大限度地縮短載體的長度；四、Ti質(zhì)粒的改造（四）、安裝大腸桿菌復制子，使其能在大腸桿菌中復制，以利于克隆操作；（五）、安裝植物細胞的篩選標記，如使用植物基因的啟動子和polyA化信號序列；（六）、安裝多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。五、共整合轉(zhuǎn)化程序六、二元整合轉(zhuǎn)化程序（一）、將外源基因克隆在大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的T-DNA區(qū)內(nèi)；（二）、重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株，該菌株攜帶只含vir區(qū)不含T-DNA區(qū)的Ti輔助質(zhì)粒；以上述重組農(nóng)桿菌感染植物細胞?；蚬こ痰拿笇W基礎—限制性核酸內(nèi)切酶內(nèi)容一二三命名斷裂方式定義一、定義定義：這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶。是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構的核苷酸內(nèi)切酶。寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象：人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/M體系）。細菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。R/M體系：寄主是由兩種酶活性配合完成的，一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，另一種是核酸內(nèi)切限制酶。EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。R/M體系的作用：保護自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解。二、命名限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：第一個字母：大寫，表示所來自微生物的屬名第一個字母。第二、三字母：小寫，表示所來自微生物種名第一、二個字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號。例：EcoRI來自于EscheriacoliRY13的第一個限制酶。三、斷裂方式核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式：（一）粘性末端：兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是圍繞著一個對稱結(jié)構中心，這樣形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片斷。具有3’-OH（Pst1），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。

Pst1EcoR15’CTGCAG3’5’GAATTC3’3’GACGTC5’3’CTTAAG5’三、斷裂方式核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式：（二）平末端

兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結(jié)構的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷。不易重新環(huán)化。Sma15’CCCGGG3’

3’GGGCCC5’三、斷裂方式核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式：（三）同裂酶指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同。（四）同尾酶指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大。限制片斷的末端連接作用：分子間的連接：不同的DNA片斷通過互補的粘性末端之間的堿基配對而彼此連接起來。分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個互補末端之間的堿基配對而形成的環(huán)形分子。分子內(nèi)連接分子間連接基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟內(nèi)容一二基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟基因工程的支撐技術1、從復雜的生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段；切2、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子；接一、基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟：3、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞（寄主細胞），并與之一起增殖；轉(zhuǎn)4、從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了細胞重組DNA分子的受體細胞克??；增一、基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟：5、從這些篩選出來的受體細胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，供進一步分析研究使用；檢6、將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。一、基因工程研