《生物技術(shù)+大規(guī)模并行測序+第2部分：測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估GBT+43584.2-2023》詳細(xì)解讀

《生物技術(shù)大規(guī)模并行測序第2部分：測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估GB/T43584.2-2023》詳細(xì)解讀contents目錄1范圍2規(guī)范性引用文件3術(shù)語和定義4原始數(shù)據(jù)5序列比對與定位6變異識別7驗證contents目錄8文件附錄A(資料性)特定MPS平臺示例的質(zhì)量指標(biāo)附錄B(資料性)按應(yīng)用劃分的覆蓋范圍和推洼它附錄C(資料性)序列比對和定位軟件參考文獻(xiàn)011范圍01021.1主題內(nèi)容涵蓋與MPS數(shù)據(jù)質(zhì)量評估相關(guān)的基本概念、原理、方法和實踐。本文檔主要討論生物技術(shù)領(lǐng)域中的大規(guī)模并行測序（MPS）數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估。1.2適用范圍適用于從事生物技術(shù)、生物信息學(xué)、基因組學(xué)等領(lǐng)域的研究人員和技術(shù)人員?？蔀闇y序平臺的選擇、測序?qū)嶒灥脑O(shè)計、數(shù)據(jù)分析流程的優(yōu)化等提供指導(dǎo)。引用和參考了國際通用的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。與其他相關(guān)文檔（如測序?qū)嶒炛改?、?shù)據(jù)分析流程規(guī)范等）保持一致性和互補性。1.3相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范022規(guī)范性引用文件國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）發(fā)布的相關(guān)生物技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，為大規(guī)模并行測序提供了基本的技術(shù)和操作規(guī)范。國際人類基因組測序協(xié)會（IHGSC）制定的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估指南，為評估測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性和完整性提供了重要參考。國際標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會發(fā)布的相關(guān)生物技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，包括測序技術(shù)、數(shù)據(jù)管理、質(zhì)量控制等方面的規(guī)范。中國生物信息學(xué)學(xué)會等學(xué)術(shù)組織制定的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估標(biāo)準(zhǔn)和建議，為行業(yè)內(nèi)評估測序數(shù)據(jù)質(zhì)量提供了統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方法。國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范行業(yè)規(guī)范與最佳實踐測序儀器制造商提供的操作手冊和技術(shù)規(guī)范，為使用特定測序平臺的用戶提供了詳細(xì)的技術(shù)指導(dǎo)和操作要求。測序數(shù)據(jù)中心和大型測序項目發(fā)布的數(shù)據(jù)處理和分析流程，包括數(shù)據(jù)質(zhì)量控制環(huán)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)和最佳實踐，為其他測序項目提供了有益的參考和借鑒。033術(shù)語和定義原始測序數(shù)據(jù)指從測序平臺直接下機的數(shù)據(jù)，通常包含測序讀段及其對應(yīng)的堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)等信息。處理后測序數(shù)據(jù)指經(jīng)過一系列數(shù)據(jù)處理流程（如堿基識別、質(zhì)量過濾、去重復(fù)等）后得到的測序數(shù)據(jù)，用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。3.1測序數(shù)據(jù)指每個堿基被測序的平均次數(shù)，是衡量測序數(shù)據(jù)覆蓋度的重要指標(biāo)。測序深度指測序過程中發(fā)生錯誤的概率，通常與測序平臺的性能、試劑質(zhì)量以及樣本質(zhì)量等因素有關(guān)。測序錯誤率指測序?qū)嶒灝a(chǎn)生的總數(shù)據(jù)量，通常以堿基對（bp）或兆堿基對（Mb）為單位進行衡量。數(shù)據(jù)產(chǎn)量指測序數(shù)據(jù)中每個堿基的質(zhì)量評估指標(biāo)，用于反映該堿基的測序準(zhǔn)確度和可信度。堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.2質(zhì)量評估指標(biāo)指基于邊合成邊測序原理的高通量測序技術(shù)，具有高通量、低成本、短讀長等特點，廣泛應(yīng)用于基因組、轉(zhuǎn)錄組等領(lǐng)域的研究。指基于單分子實時測序原理的測序技術(shù)，具有長讀長、無PCR擴增偏向性等優(yōu)點，適用于基因組組裝、結(jié)構(gòu)變異檢測等領(lǐng)域的研究。3.3測序技術(shù)第三代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)Illumina平臺指Illumina公司生產(chǎn)的測序平臺，包括NovaSeq、HiSeq、MiSeq等系列，具有高通量、高準(zhǔn)確度、低成本等特點，是目前市場上應(yīng)用最廣泛的測序平臺之一。PacBio平臺指PacificBiosciences公司生產(chǎn)的測序平臺，基于單分子實時測序原理，具有超長讀長、高均一性等優(yōu)點，適用于大型基因組的組裝和結(jié)構(gòu)變異檢測等領(lǐng)域的研究。OxfordNanopore平臺指OxfordNanoporeTechnologies公司生產(chǎn)的測序平臺，基于納米孔測序原理，具有便攜、實時、長讀長等特點，適用于現(xiàn)場檢測和病原體鑒定等領(lǐng)域的研究。3.4測序平臺044原始數(shù)據(jù)123原始數(shù)據(jù)是指在測序過程中直接產(chǎn)生的、未經(jīng)任何處理的數(shù)據(jù)，包括測序儀器輸出的原始圖像文件和堿基識別文件等。原始數(shù)據(jù)的定義原始數(shù)據(jù)是測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估的基礎(chǔ)，對于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和解讀具有至關(guān)重要的作用。原始數(shù)據(jù)的重要性為了保證數(shù)據(jù)的完整性和可追溯性，需要對原始數(shù)據(jù)進行妥善的存儲和備份，防止數(shù)據(jù)丟失或損壞。原始數(shù)據(jù)的存儲和備份4.1通則不同的測序平臺和數(shù)據(jù)類型會產(chǎn)生不同格式的原始數(shù)據(jù)文件，如FASTQ、BAM等。這些文件包含了測序過程中產(chǎn)生的所有信息，如堿基序列、質(zhì)量分?jǐn)?shù)等。原始數(shù)據(jù)文件的格式為了方便數(shù)據(jù)的管理和追溯，需要對原始數(shù)據(jù)文件進行規(guī)范的命名，包括文件名、文件擴展名、測序平臺、樣本信息等要素。原始數(shù)據(jù)文件的命名規(guī)則在接收原始數(shù)據(jù)文件時，需要進行完整性驗證，確保文件在傳輸過程中沒有發(fā)生損壞或丟失。原始數(shù)據(jù)文件的完整性驗證4.2原始數(shù)據(jù)文件質(zhì)量評估指標(biāo)01原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估主要包括堿基識別準(zhǔn)確率、測序深度、覆蓋度、GC含量等指標(biāo)。這些指標(biāo)可以反映測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性。質(zhì)量評估方法02對于不同的測序平臺和數(shù)據(jù)類型，需要采用不同的質(zhì)量評估方法。常用的方法包括FastQC、MultiQC等質(zhì)量評估工具，以及基于統(tǒng)計學(xué)的分析方法。質(zhì)量評估結(jié)果解讀03根據(jù)質(zhì)量評估指標(biāo)和方法，對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，并生成質(zhì)量評估報告。報告中會詳細(xì)列出各項指標(biāo)的結(jié)果和解讀，幫助用戶了解數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性。4.3原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估原始數(shù)據(jù)中可能包含一些低質(zhì)量、重復(fù)或無效的序列，需要通過數(shù)據(jù)清洗去除這些序列，提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量和準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)清洗為了方便后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和解讀，需要將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為統(tǒng)一的格式，如FASTQ、BAM等。轉(zhuǎn)換過程中需要保證數(shù)據(jù)的完整性和準(zhǔn)確性。格式轉(zhuǎn)換將清洗和格式轉(zhuǎn)換后的序列與參考基因組進行比對，確定序列在基因組上的位置和變異信息。比對過程中需要選擇合適的比對算法和參數(shù)，確保比對的準(zhǔn)確性和效率。序列比對在預(yù)處理過程中，還需要去除重復(fù)序列，以避免對后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和解讀造成干擾。重復(fù)序列的去除可以采用特定的算法和軟件實現(xiàn)。重復(fù)序列去除4.4原始數(shù)據(jù)預(yù)處理055序列比對與定位序列比對是將測序得到的序列與參考基因組或其他數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較，以確定其在基因組中的位置或與其他序列的相似性和差異。序列比對的定義序列比對的主要目的是確定序列的基因組位置、檢測序列變異、發(fā)現(xiàn)新基因或轉(zhuǎn)錄本等。比對的目的常用的序列比對算法包括Smith-Waterman算法、BLAST算法、Bowtie算法、BWA算法等，它們具有不同的特點和應(yīng)用場景。比對算法5.1通則SAM格式SAM（SequenceAlignment/Map）格式是一種通用的序列比對和定位文件格式，用于存儲序列比對的結(jié)果，包括序列信息、比對位置、比對質(zhì)量等信息。BAM格式BAM（BinaryAlignment/Map）格式是SAM格式的二進制壓縮版本，具有更高的存儲效率和更快的讀取速度，適用于大規(guī)模測序數(shù)據(jù)的存儲和處理。CRAM格式CRAM（CompressionandRandomAccessforMassivelyparallelSequencingdata）格式是一種針對大規(guī)模并行測序數(shù)據(jù)的壓縮和隨機訪問文件格式，可以更有效地存儲和處理測序數(shù)據(jù)。5.2序列比對與定位文件格式比對質(zhì)量評估指標(biāo)常用的比對質(zhì)量評估指標(biāo)包括比對率、錯配率、間隙率等，這些指標(biāo)可以反映比對結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。質(zhì)量控制方法對于比對結(jié)果中存在的低質(zhì)量比對或錯誤比對，可以采用過濾方法、重新比對方法、基于統(tǒng)計模型的校正方法等進行質(zhì)量控制。質(zhì)量控制工具常用的質(zhì)量控制工具包括Samtools、Picard、GATK等，它們可以對比對結(jié)果進行各種質(zhì)量控制操作，如去除重復(fù)序列、標(biāo)記PCR重復(fù)、重新校正比對質(zhì)量等。5.3序列比對和定位的質(zhì)量控制

5.4比對后處理比對結(jié)果統(tǒng)計比對后需要對比對結(jié)果進行統(tǒng)計，包括比對上的序列數(shù)量、比對位置分布、序列覆蓋度等信息，以便后續(xù)分析和應(yīng)用。變異檢測基于比對結(jié)果，可以采用各種變異檢測算法和軟件來檢測序列中的單核苷酸變異（SNV）、插入/刪除變異（Indel）、結(jié)構(gòu)變異（SV）等。可視化展示對于比對結(jié)果和變異檢測結(jié)果，可以采用各種可視化工具進行展示，如IGV、GenomeBrowser等，以便更直觀地查看和分析數(shù)據(jù)。066變異識別123變異識別是測序數(shù)據(jù)分析的核心環(huán)節(jié)，旨在檢測樣本基因組中的單核苷酸變異（SNV）、插入刪除（Indel）等。變異識別應(yīng)遵循一定的流程和規(guī)范，包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、比對、變異檢測、注釋等步驟。不同的變異識別算法和軟件具有不同的特點和應(yīng)用范圍，應(yīng)根據(jù)實際需求選擇合適的工具。6.1通則變異識別的輸入文件主要包括測序數(shù)據(jù)（FASTQ/BAM格式等）和參考基因組序列。輸出文件通常包括變異位點列表（VCF/BED格式等），包含變異類型、位置、基因注釋等信息。在進行變異識別前，需要對輸入文件進行質(zhì)量檢查，確保數(shù)據(jù)完整性和準(zhǔn)確性。6.2變異識別的數(shù)據(jù)文件變異識別的質(zhì)量指標(biāo)主要包括敏感性、特異性、準(zhǔn)確性等。敏感性指變異識別算法能夠正確檢測出真實變異位點的能力；特異性指算法能夠正確區(qū)分真實變異位點和假陽性變異位點的能力；準(zhǔn)確性則綜合考慮了敏感性和特異性。為了提高變異識別的質(zhì)量，可以采用多種算法和軟件進行比較和驗證，同時結(jié)合實驗驗證和生物信息學(xué)分析手段進行綜合評估。6.3變異識別的質(zhì)量指標(biāo)假陽性變異是變異識別中常見的問題，可能由于測序錯誤、比對錯誤、重復(fù)序列等因素引起。為了降低假陽性變異的影響，可以采用多種策略進行過濾和校正，如基于質(zhì)量值、深度、基因型頻率等信息的過濾；基于已知變異數(shù)據(jù)庫或種群頻率信息的校正等。對于無法確定真實性的變異位點，可以采用實驗驗證或結(jié)合其他生物信息學(xué)分析手段進行進一步確認(rèn)。6.4假陽性變異處理常用的序列注釋工具包括ANNOVAR、SnpEff等，可以提供基因區(qū)域、轉(zhuǎn)錄本、蛋白質(zhì)水平等多個層面的注釋信息。在進行序列注釋時，需要注意選擇合適的參考基因組版本和注釋數(shù)據(jù)庫，以確保注釋結(jié)果的準(zhǔn)確性和完整性。序列注釋是將變異位點與基因組功能元件相關(guān)聯(lián)的過程，有助于理解變異對基因功能和表型的影響。6.5序列注釋077驗證驗證目的確保測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量符合預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)，滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析的要求。驗證流程包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、質(zhì)量指標(biāo)計算、結(jié)果解讀和報告撰寫等步驟。驗證人員需要具備生物信息學(xué)和統(tǒng)計學(xué)背景，熟悉測序技術(shù)和數(shù)據(jù)分析流程。7.1通則測序深度：驗證測序深度是否達(dá)到預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)，以確?；蚪M覆蓋度和變異檢測準(zhǔn)確性。堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)：檢查堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布，評估測序數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。序列復(fù)雜度：分析序列復(fù)雜度，以檢測可能存在的重復(fù)序列和PCR擴增偏差。比對結(jié)果：將測序數(shù)據(jù)與參考基因組進行比對，評估比對率和覆蓋均勻性。以上是對《生物技術(shù)大規(guī)模并行測序第2部分：測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估》中驗證部分的詳細(xì)解讀。通過驗證流程的實施，可以確保測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性，為后續(xù)的生物信息學(xué)分析和應(yīng)用提供有力支持。01020304057.2質(zhì)量指標(biāo)驗證088文件測序數(shù)據(jù)通常存儲在FASTQ或FASTA格式的文件中，這些文件包含了測序讀段（reads）的序列信息以及相應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。除了原始測序數(shù)據(jù)，其他相關(guān)文件可能還包括樣本信息、實驗設(shè)計、測序儀器參數(shù)等，這些文件對于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和質(zhì)量評估同樣重要。8.1文件格式VS文件命名應(yīng)清晰、規(guī)范，能夠反映樣本信息、測序類型、測序儀器等關(guān)鍵信息，以便于數(shù)據(jù)的管理和追溯。測序數(shù)據(jù)應(yīng)存儲在可靠的存儲介質(zhì)上，如高性能計算集群或云存儲平臺，以確保數(shù)據(jù)的安全性和可訪問性。8.2文件命名和存儲在進行質(zhì)量評估之前，需要檢查文件的完整性和準(zhǔn)確性，包括文件大小、讀段數(shù)量、堿基質(zhì)量等?？梢允褂靡恍┕ぞ呋蜍浖ξ募M行校驗，如MD5校驗和、FASTQC等，以確保文件在傳輸或處理過程中沒有發(fā)生損壞或丟失。8.3文件完整性和準(zhǔn)確性測序數(shù)據(jù)的共享和交換應(yīng)遵循相關(guān)的數(shù)據(jù)共享政策和標(biāo)準(zhǔn)，如國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫合作組織（INSDC）制定的標(biāo)準(zhǔn)。在共享和交換數(shù)據(jù)時，需要提供詳細(xì)的數(shù)據(jù)說明和元數(shù)據(jù)信息，以便于其他研究人員理解和使用這些數(shù)據(jù)。8.4文件的共享和交換09附錄A(資料性)特定MPS平臺示例的質(zhì)量指標(biāo)堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)Illumina平臺為每個測定的堿基提供一個質(zhì)量分?jǐn)?shù)，該分?jǐn)?shù)表示測序過程中該堿基的測定準(zhǔn)確性。質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，堿基測定的準(zhǔn)確性越高。序列質(zhì)量分布描述測序數(shù)據(jù)中各位置堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分布情況，用于評估整體測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量。GC含量分布GC含量對測序過程有一定影響，GC含量分布可以反映測序數(shù)據(jù)的均勻性和偏差情況。測序深度指每個基因組區(qū)域被測序的次數(shù)，測序深度越高，基因組覆蓋度越全面，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性越高。Illumina平臺質(zhì)量指標(biāo)讀長分布準(zhǔn)確度序列完整性堿基修飾檢測PacBio平臺質(zhì)量指標(biāo)01020304PacBio平臺以長讀長著稱，讀長分布可以反映測序數(shù)據(jù)的整體讀長水平和測序質(zhì)量。通過比較測序結(jié)果與參考基因組序列的一致性來評估測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。評估測序數(shù)據(jù)在基因組各區(qū)域的覆蓋情況，以判斷數(shù)據(jù)是否全面。PacBio平臺可以檢測DNA甲基化等堿基修飾情況，為表觀遺傳學(xué)等研究提供重要信息。信號質(zhì)量測序速度讀長可移植性和靈活性O(shè)xfordNanopore平臺質(zhì)量指標(biāo)Nanopore測序過程中產(chǎn)生的電信號質(zhì)量，直接影響堿基識別的準(zhǔn)確性。與PacBio平臺類似，Nanopore平臺也可以產(chǎn)生較長的讀長，有助于解決復(fù)雜基因組區(qū)域的測序問題。Nanopore平臺具有實時測序的特點，測序速度是衡量其性能的重要指標(biāo)之一。Nanopore平臺設(shè)備小巧便攜，適用于各種環(huán)境和應(yīng)用場景，具有很高的靈活性和可移植性。10附錄B(資料性)按應(yīng)用劃分的覆蓋范圍和推洼它基因組學(xué)應(yīng)用評估全基因組的變異和結(jié)構(gòu)，包括單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入/刪除（Indel）、結(jié)構(gòu)變異（SV）等。外顯子組測序（WES）針對蛋白質(zhì)編碼區(qū)域進行測序，用于鑒定致病變異和基因診斷。靶向測序針對特定基因或區(qū)域進行深度測序，用于疾病篩查、病原體檢測等。全基因組測序（WGS）基因表達(dá)分析評估不同條件下基因的表達(dá)水平變化，用于研究生物學(xué)過程和疾病機制。非編碼RNA分析鑒定和表征非編碼RNA（如microRNA、lncRNA等），研究其在細(xì)胞功能和疾病中的作用。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在單細(xì)胞水平分析基因表達(dá)譜，揭示細(xì)胞