分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)日常要求上課時(shí)間：上午8:00-下午5:00，提前5分鐘進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室遲到、早退每次扣3分，無(wú)故曠課每次扣10分，累計(jì)3次沒(méi)成績(jī)請(qǐng)假須醫(yī)院病假條或班主任簽字的假條上課時(shí)需穿實(shí)驗(yàn)服，不許在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)吃東西實(shí)驗(yàn)課期間不許打鬧、閑聊等，保持課堂紀(jì)律隨時(shí)保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)的整潔認(rèn)真作好值日工作，離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室須向教師聲明必須做到課前認(rèn)真預(yù)習(xí)，課間做好實(shí)驗(yàn)記錄、課后詳細(xì)總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并按時(shí)提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室的各種規(guī)章制度愛(ài)護(hù)實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)器材損壞必須按規(guī)定賠償用完儀器后必須復(fù)位注意門窗水電的安全在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一定要保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、地面、實(shí)驗(yàn)儀器有序、整潔和衛(wèi)生每位同學(xué)負(fù)責(zé)自己實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和柜體的衛(wèi)生，值日生負(fù)責(zé)公用實(shí)驗(yàn)臺(tái)、地面等處衛(wèi)生同學(xué)與老師之間、同學(xué)與同學(xué)之間、實(shí)驗(yàn)班與實(shí)驗(yàn)班之間一定要互相協(xié)作配合保持公用房間衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)成績(jī)平時(shí)成績(jī)60分實(shí)驗(yàn)技能20分實(shí)驗(yàn)報(bào)告20分實(shí)驗(yàn)態(tài)度10分實(shí)驗(yàn)室常識(shí)10分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施40分設(shè)計(jì)報(bào)告20分實(shí)驗(yàn)實(shí)施10分結(jié)果及分析10分參考書(shū)基因工程原理（第二版）吳乃虎編著科學(xué)出版社分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版）黃培堂等譯科學(xué)出版社基因克隆和DNA分析魏群等譯高等教育出版社最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)梁國(guó)棟主編科學(xué)出版社實(shí)驗(yàn)內(nèi)溶緒論—分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的誕生和發(fā)展分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本知識(shí)簡(jiǎn)介實(shí)驗(yàn)規(guī)范訓(xùn)練、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化PCR基因擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收(核酸的回收)瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)粒DNA的提取及其定性定量分析核酸的定量DNA重組－酶切連接、轉(zhuǎn)化、篩選外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測(cè)免疫印跡哺乳動(dòng)物基因組DNA的提取及其定性定量分析植物總RNA的提取及其定性定量分析演示：Southern、DNA序列測(cè)定、RT－PCR及mRNA差異顯示設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及其實(shí)施實(shí)驗(yàn)安排實(shí)驗(yàn)周實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1緒論—分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的誕生和發(fā)展分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)簡(jiǎn)介

2分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備及其使用實(shí)驗(yàn)規(guī)范訓(xùn)練及實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

3大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化4質(zhì)粒DNA的提取及其定性定量分析5PCR基因擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收（DNA的回收）6DNA重組（限制性酶切和連接）哺乳動(dòng)物基因組DNA的分離及其定性定量分析7大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及重組子的轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物基因組DNA的分離及其定性定量分析8重組子的篩選（藍(lán)白篩選、比較重組子的大小和酶切片段分析）9外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)討論10植物總RNA的提取及其定性定量分析11蛋白質(zhì)印跡、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備12設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)13設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、Southern（演示）14設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、DNA序列測(cè)定（演示）15設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、RT-PCR16設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)一:原核生物的酶的克隆和原核表達(dá)限定目標(biāo)：目的基因－原核生物的酶、表達(dá)載體－pET21a或pETBlue－2限制性內(nèi)切酶：BamHⅠ和HindⅢ要求：找到具體某一原核生物的某一編碼基因的全序列利用分析件進(jìn)行目的基因內(nèi)部限制性內(nèi)切酶的酶切分析及5’和3’末端引物的設(shè)計(jì)提交具體的實(shí)驗(yàn)方案（從提取全基因組到目的基因的重組、表達(dá)及活性分析）第八個(gè)實(shí)驗(yàn)周前必須把詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)交給指導(dǎo)教師第八個(gè)實(shí)驗(yàn)周指導(dǎo)教師組織全班同學(xué)討論每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定兩個(gè)最好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在全班進(jìn)行具體的實(shí)驗(yàn)實(shí)踐設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)二:小麥看家基因的克隆限定目標(biāo)：小麥看家基因、表達(dá)載體－pET21a或pETBlue－2限制性內(nèi)切酶：BamHⅠ和HindⅢ材料：培養(yǎng)10天左右的小麥要求：找到小麥的具體某一看家基因（最好是酶）的基因提交具體的實(shí)驗(yàn)方案（從材料準(zhǔn)備到看家蛋白的克?。┑诎藗€(gè)實(shí)驗(yàn)周前必須把詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)交給指導(dǎo)教師第八個(gè)實(shí)驗(yàn)周指導(dǎo)教師組織全班同學(xué)討論每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定一到兩個(gè)最好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在全班進(jìn)行具體的實(shí)驗(yàn)實(shí)踐設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)三:大腸桿菌K12堿性磷酸酶的定點(diǎn)突變限定目標(biāo)：大腸桿菌K12堿性磷酸酶的功能位點(diǎn)的突變表達(dá)載體－pET21a或pETBlue－2、限制性內(nèi)切酶：BamHⅠ和HindⅢ材料：大腸桿菌K12堿性磷酸酶要求：找到堿性磷酸酶的功能位點(diǎn)，用PCR的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變。提交具體的實(shí)驗(yàn)方案，第八個(gè)實(shí)驗(yàn)周前必須把詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)交給指導(dǎo)教師。第八個(gè)實(shí)驗(yàn)周指導(dǎo)教師組織全班同學(xué)討論每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定一到兩個(gè)最好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在全班進(jìn)行具體的實(shí)驗(yàn)實(shí)踐。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)四:荷瘤小鼠的mRNA差異顯示限定目標(biāo)：找到正常小鼠和荷瘤小鼠中有差異的mRNA材料：小白鼠、H22腹水瘤細(xì)胞要求：提交具體的實(shí)驗(yàn)方案（從材料準(zhǔn)備到mRNA的差異顯示）；第八個(gè)實(shí)驗(yàn)周前必須把詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)交給指導(dǎo)教師；第八個(gè)實(shí)驗(yàn)周指導(dǎo)教師組織全班同學(xué)討論每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定一到兩個(gè)最好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在全班進(jìn)行具體的實(shí)驗(yàn)實(shí)踐。緒論—分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的誕生和發(fā)展1952J.WatsonandF.Crick1953DNADoubleHelixmodel

分子生物學(xué)的重要里程碑TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962"fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmaterial"FrancisHarryJamesDeweyMauriceHughComptonCrick

WatsonFrederick

Wilkins

1965年發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978,"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics“1973年斯坦福大學(xué)Cohn和加州大學(xué)Boyer：重組DNA技術(shù)

WernerArberDanielNathansHamiltonO.SmithPaulBerg

WalterGilbert

FrederickSanger

"fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids“

1977

DNAsequencingTheNobelPrizeinChemistry1980"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA"

"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method“

KaryB.MullisMichaelSmith

"forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"TheNobelPrizeinChemistry19931997年2月蘇格蘭Wilmut

綿羊“多利”的克隆，為發(fā)育生物學(xué)研究開(kāi)拓了更廣闊的空間2000年6月HGP提前完成,功能基因組時(shí)代到來(lái)分子生物學(xué)中的兩項(xiàng)最重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

分子生物學(xué)的誕生和發(fā)展中的瓶頸基因克?。―NA重組，基因工程）

Geneclone,DNArecombination,geneengineering

基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)vectorDNA操作工具酶的發(fā)現(xiàn)DNAmanipulation

基因合成和基因測(cè)序sequencePCR技術(shù)

polymerasechainreaction開(kāi)設(shè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的歷史沿革和重要性

基因工程帶來(lái)的革命及在我國(guó)的反響生物化學(xué)的發(fā)展分子生物學(xué)成為現(xiàn)代生命科學(xué)的“共同語(yǔ)言”和深入研究的工具遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)神經(jīng)生物學(xué)、分子免疫學(xué)分子藥理學(xué)、分子病理學(xué)分子分類學(xué)、分子生態(tài)學(xué)農(nóng)林、畜牧等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的內(nèi)容及應(yīng)用舉例

廣義的分子生物學(xué)技術(shù)基因克隆、PCR及一系列技術(shù)從活細(xì)胞中提取DNA、RNA的基本技術(shù)基因操作技術(shù)電泳技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化技術(shù)重組子的篩選和鑒定技術(shù)DNA測(cè)序技術(shù)印跡和雜交技術(shù)核酸定量外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)等基因表達(dá)及基因工程藥物、基因工程疫苗基因鑒定的幾種方法及人類疾病基因的鑒定Southern（DNA)印跡Northern(RNA)印跡Western(蛋白）印跡PCR基因擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)人類疾病基因的鑒定基因突變及生物大分子結(jié)構(gòu)功能的研究

二十一世紀(jì)生物學(xué)的新熱點(diǎn)及領(lǐng)域結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）生物大分子的高級(jí)三維結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一生物大分子之間的互作→基因的社會(huì)學(xué)分子發(fā)育生物學(xué)（MolecularDevelopingBiology）基因表達(dá)，基因互作

器官發(fā)生胚胎形成個(gè)體發(fā)育21世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展的重要態(tài)勢(shì)對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)從單基因水平向全基因組整體水平發(fā)展現(xiàn)代生命科學(xué)研究的理論與技術(shù)從較長(zhǎng)期的積累走向應(yīng)用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本知識(shí)簡(jiǎn)介基因工程又稱DNA重組技術(shù)外源基因通過(guò)體外重組后，導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能夠在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)的操作包括基因的分離、重組、轉(zhuǎn)移、基因在受體細(xì)胞內(nèi)的保持、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)等全過(guò)程有人也將其它使細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)得到改造的體系也包括在基因工程內(nèi)以區(qū)別于DNA重組基因工程四要素：目的基因、工具酶、載體、受體細(xì)胞

工具酶

限制性內(nèi)切酶 連接酶 聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶 激酶和磷酸酶 核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶

DNA酶和RNA酶 甲基化酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶 蛋白思考題這些工具酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能是什么？2.它們?cè)诜肿由飳?shí)驗(yàn)中各有什么用途？工具酶—限制性內(nèi)切酶特異地識(shí)別和結(jié)合于一段特殊的DNA序列（二元對(duì)稱）多數(shù)限制性內(nèi)切酶識(shí)別長(zhǎng)度為4-6個(gè)核苷酸，少數(shù)識(shí)別更長(zhǎng)的核苷酸序列切割雙鏈DNA切割后形成平端或粘端

BamHⅠ

↓

5’NNGGATCCNN3’3’NNCCTAGGNN5’

↑

5’NNGGOH

pATCCNN3’3’NNCCTApHOGGNN5’HindⅢ

↓

5’AAGCTT3’3’TTCGAA5’↑↓

+注：不同的酶、不同廠家生產(chǎn)的同一種酶的消化條件不同，沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)時(shí)參閱說(shuō)明書(shū)星號(hào)酶活力限制酶識(shí)別位點(diǎn)與大腸桿菌dam、dcm甲基化作用位點(diǎn)重疊時(shí)

dam:表示限制性酶切時(shí)dam甲基化作用抑制

dcm:表示限制性酶切時(shí)dcm甲基化作用抑制

(－):表示以上兩種甲基化作用均無(wú)影響

(？):表示甲基化的影響未見(jiàn)報(bào)道許多限制性內(nèi)切酶在離開(kāi)識(shí)別序列一段距離的地方切割，其切割位點(diǎn)用括號(hào)內(nèi)的數(shù)字來(lái)表示。如：HgaIGACGC(5/10)切割消化條件不利于堿基間形成氫鍵而連接則相反工具酶—連接酶粘端、平端DNA或切口的連接：T4噬菌體DNA連接酶5’pApCpGoH

pApApTpTpCpGpT3’3’TpGpCpTpTpApAp

oHG

pCpAp5’Mg2+ATP

↓T4DNA連接酶5’pApCpGpApApTpTpCpGpT3’3’TpGpCpTpTpApApGpCpAp5’單鏈DNA或RNA的連接：T4噬菌體RNA連接酶熱穩(wěn)定DNA連接酶DNA聚合酶DNA聚合酶I(全酶）5’-3’DNA聚合酶活性3’-5’外切酶、5’-3’外切酶切口平移法標(biāo)記3’末端標(biāo)記Klenow片段5’-3’DNA聚合酶活性3’-5’外切酶末端補(bǔ)平、末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成T4噬菌體DNA聚合酶外切核酸酶活性比Klenow片段活性高200倍體外誘變、末端標(biāo)記T7噬菌體DNA聚合酶5’-3’DNA聚合酶活性3’-5’外切酶體外誘變、末端標(biāo)記熱穩(wěn)定DNA聚合酶聚合酶活性、5’-3’外切酶PCR、DNA序列測(cè)定

反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DNAcDNA的合成依賴于DNA的RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA合成單鏈RNA做探針末端轉(zhuǎn)移酶在2價(jià)陽(yáng)離子存在時(shí)催化dNTP加于DNA分子的3’羥基端cDNA末端加同聚尾末端標(biāo)記激酶和堿性磷酸酶

T4噬菌體多核苷酸激酶[r-32p]ATP二硫蘇糖醇Mg2+DNAOH5’或RNAOH5’5’[32p]DNA或5’[32p]RNAADP+

32P標(biāo)記DNA5’末端，磷酸化5’末端5’pDNA5’pRNA5’OHDNA5’OHRNA堿性磷酸酶細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)，牛小腸堿性磷酸酶(CIP)32P標(biāo)記前去除5’磷酸，去除DNA片斷5’磷酸防止自身環(huán)化載體自我復(fù)制、篩選標(biāo)記具有合適的限制酶切位點(diǎn)高拷貝數(shù)、小分子量、高穩(wěn)定性質(zhì)粒載體：pUC19、pET21a、pETBlue－2噬菌體載體：λ噬菌體載體

M13噬菌體載體病毒：pCAT3人工染色體：克隆載體{

表達(dá)載體{原核真核思考題載體的特點(diǎn)？2.都有哪些載體？3.每種載體在分子生物實(shí)驗(yàn)中的功能是什么？4.載體和宿主細(xì)胞之間的關(guān)系是什么？5.如何選擇合適的載體？T7promoter311-327T7transcriptionstart310T7?Tagcodingsequence207-239Multiplecloningsites(BamHI-Xho

I)158-203His?Tagcodingsequence140-157T7terminator26-72lacI

codingsequence714-1793pBR322origin3227bla

codingsequence3988-4845f1origin4977-5432lac

operator3606–3625T7promoter1–17lac

operator22–42T7transcriptionstart18multiplecloningregion276–467(Nco

I–PacI)His?Tag?codingsequence437–454HSV?Tag?codingsequence395–430lacZ

startcodon491lacZ

α-peptideORF57–491E.colipromoter541–569f1origin1096–1551bla

codingsequence1669–2526pUCorigin3206受體細(xì)胞受體細(xì)胞為外源基因的克隆和表達(dá)提供特定的環(huán)境和條件載體體系一定要與受體細(xì)胞的基因型相配如：利用α互補(bǔ)篩選的載體要選擇ф80lacZ△M15基因型的受體細(xì)胞才能實(shí)現(xiàn)α互補(bǔ)篩選思考題1.受體細(xì)胞的特點(diǎn)什么？2.都有哪些受體細(xì)胞？3.載體和受體（宿主）細(xì)胞之間的關(guān)系是什么？4.如何選擇合適的受體細(xì)胞？JM109菌株可作為大多數(shù)質(zhì)粒載體的受體菌，也可以用于制備M13等噬菌體載體的單鏈DNA。該菌株易于培養(yǎng)，并且可以用較多的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化。DH5α菌株一種常用于質(zhì)?？寺〉木辍Ｆ鋔80lacZ△M15基因的產(chǎn)物可與pUC載體編碼的b-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)a互補(bǔ)，可用于藍(lán)白斑篩選。recA1和endA1的突變有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。BL21（DE3）菌株該菌株用于以T7RNA聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主。T7噬菌體RNA聚合酶基因的表達(dá)受控于λ噬菌體DE3區(qū)的lacUV5啟動(dòng)子，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合于非毒性蛋白的表達(dá)。BL21（DE3）pLysS菌株該菌株帶有質(zhì)粒pLysS，具有氯霉素抗性。此質(zhì)粒含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能夠降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)。適合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表達(dá)。目的基因的來(lái)源和分離基因組文庫(kù)：基因組文庫(kù)是含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體

cDNA文庫(kù)：將真核細(xì)胞內(nèi)全部mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA并將雙鏈cDNA和載體連接，由此得到的cDNA克隆群體直接從特定的mRNA入手PCR和RT-PCR基因的化學(xué)合成從蛋白質(zhì)入手思考題1.為什么需要目的基因？2.如何鑒定目的基因？3.如何獲得目的基因？外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞CaCl2處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染高壓電穿孔聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體融合細(xì)胞核的顯微注射顆粒轟擊技術(shù)重組子的篩選1. 根據(jù)重組載體的特點(diǎn)進(jìn)行篩選：抗藥性篩選法、插入失活2. 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法：載體上攜帶某些營(yíng)養(yǎng)成分基因而受體菌缺失3. 限制性酶切分析4. 核酸雜交：原位雜交、Southern、Northern5. PCR表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)：電泳、測(cè)活、蛋白印跡序列測(cè)定分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備樣品、試劑和材料等的保存溫度控制系統(tǒng)--冰箱：40C、-200C、-700C恒溫培養(yǎng)箱細(xì)菌平板的培養(yǎng)恒溫空氣搖床

菌體的培養(yǎng)滅菌器培養(yǎng)基、試劑、耗材等的滅菌PCR儀PCR擴(kuò)增、保溫實(shí)驗(yàn)等恒溫水浴及微量加熱器保證實(shí)驗(yàn)溫度的恒定電泳槽核酸或蛋白質(zhì)的電泳定性分析時(shí)的凝膠支架電泳儀電泳時(shí)提供電壓和電流凝膠成像系統(tǒng)

電泳結(jié)果的定性和定量分析臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)樣品的分離落地式高速冷凍離心機(jī)樣品的分離分光光度計(jì)樣品的定量測(cè)定超凈工作臺(tái)

提供潔凈工作環(huán)境電子天平樣品、試劑等的稱量pH計(jì)

精確的pH值測(cè)定移液器

液體試劑的精確取量實(shí)驗(yàn)規(guī)范訓(xùn)練－儀器的操作要求：儀器在未經(jīng)培訓(xùn)前，不得擅自使用嚴(yán)格按操作規(guī)程使用儀器，有些儀器必須有教師在場(chǎng)時(shí)才能使用，并由教師操作違反規(guī)定的使用者，造成的后果由使用者承擔(dān)實(shí)驗(yàn)規(guī)范訓(xùn)練－量程的選擇天平燒杯、量筒、容量瓶、試劑瓶－－不同規(guī)格量程的選擇－移液器實(shí)驗(yàn)規(guī)范訓(xùn)練－標(biāo)簽所用的器皿上一定要做標(biāo)記標(biāo)簽一定要貼到固定的位置標(biāo)簽上應(yīng)包括具體的名稱、組別、實(shí)驗(yàn)班、日期實(shí)驗(yàn)規(guī)范－實(shí)驗(yàn)操作詳細(xì)記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并按時(shí)提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)中一定要處處用心、勤動(dòng)手，多問(wèn)為什么仔細(xì)操作和觀察保留好每一步的實(shí)驗(yàn)樣品，在確準(zhǔn)的情況下才能當(dāng)廢液扔掉實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備清點(diǎn)和熟悉常用玻璃器皿、耗材等洗滌本學(xué)期實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿配試劑1.0.1mol/LCaCl2100mL2.5mol/LNaOH100mL

膠塞3.LB液體培養(yǎng)基100mL

胰蛋白胨（typtone)1g

酵母提取物（yeastextract)0.5g

NaCl1g

加部分水溶解后加20μL5mol/LNaOH，定容到70mL（40mL到兩個(gè)250mL錐形瓶，3mL分別到大試管中，用于預(yù)培養(yǎng)及復(fù)蘇）4.10%(w/v)SDS儲(chǔ)液50mL

，室溫保存5.1mol/L

Tris200mL6.2mol/LHCL100mL7.0.5mol/LEDTA100mL80mL水中加18.61gEDTA-Na2H2O，用NaOH調(diào)pH8（約需2gNaOH），后定容至100mL8.5xTBE1000mL9.75%乙醇500mL10.Amp：50mg/mL20ml，分裝每管1mL，－200C保存注意：先將所需燒杯、量筒、玻棒、雙蒸水、小指管滅菌待溫度降到室溫后，在超凈臺(tái)中配制，再用一次性濾器過(guò)濾分裝于1.5mL無(wú)菌小指管中，用封口膜封口于－200C保存高溫滅菌1.LB液體培養(yǎng)基2.50mL離心管2個(gè)/組3.槍頭/2組：5mL6支，1mL1盒，200uL1盒4.培養(yǎng)皿6套/組5.1.5mL50個(gè)/2組6.無(wú)菌水100mL/班7.0.1mol/LCaCl28.燒杯、量筒、玻棒、小指管（配Amp組準(zhǔn)備）明天上午7:45收滅菌的東西及平板，下周三下午接菌預(yù)培養(yǎng)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化

時(shí)間安排時(shí)間實(shí)驗(yàn)內(nèi)容8:00-8:30接菌8:40-10:30培養(yǎng)2.5－3小時(shí)、講解本實(shí)驗(yàn)的基本原理及相關(guān)知識(shí)10:30-11:30培養(yǎng)2.5－3小時(shí)、配試劑、滅菌、準(zhǔn)備下次實(shí)驗(yàn)11:30-12:30午飯12:30-14:00感受態(tài)細(xì)胞的制備14:00-15:00轉(zhuǎn)化15:00-17:00復(fù)蘇、鋪Amp抗性平板、復(fù)蘇細(xì)胞涂平板受體菌：E.ColiDH5αR-,M-,Amps,Tcs外源質(zhì)粒:Puc18/19Ampr抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（β-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割A(yù)mp的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力基本原理感受態(tài)（Competence)：細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)轉(zhuǎn)化（transformation)：異源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程致敏過(guò)程:用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作細(xì)菌處于00C,CaCl2低滲溶液中,菌細(xì)胞膨脹成球形,外援DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽混合物黏附于細(xì)胞表面,經(jīng)短時(shí)間420C熱激處理,促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物復(fù)蘇：細(xì)菌在非選擇性培養(yǎng)基上保溫一段時(shí)間，使抗性的表型表達(dá)后再轉(zhuǎn)到含抗性的選擇性培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出來(lái)的菌落即為轉(zhuǎn)入了外源基因的菌落轉(zhuǎn)化的確切機(jī)制還不清楚實(shí)驗(yàn)流程感受態(tài)細(xì)胞的制備：1.預(yù)培養(yǎng)：接一單菌落到3mLLB培養(yǎng)基中，370C、190rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜2.取0.4mL預(yù)培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含40mLLB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，370C、250rpm振蕩培養(yǎng)2.5-3小時(shí)（OD6000.4-0.5）3.將菌液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，冰上放置10min4.離心6000rpm，40C，10min5.到出培養(yǎng)液，將管倒置使培養(yǎng)液流盡6.菌體加入預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl210mL，輕吹并懸浮細(xì)胞，冰上30min7.離心6000rpm，40C，10min，去上清8.用冰預(yù)冷的0.1M的CaCl22mL用槍輕吹懸浮細(xì)胞，冰上操作9.分裝細(xì)胞，200uL/份，此為感受態(tài)細(xì)胞（可于-700C或-200C凍存）轉(zhuǎn)化及復(fù)蘇1.取200uL感受態(tài)細(xì)胞，加入DNA(PUC19)2uL（50ng)

取200uL感受態(tài)細(xì)胞，加入2uL無(wú)菌水（陰性對(duì)照1）取200uL0.1mol/L的CaCl2，加入DNA(PUC19)2uL（50ng)

（陰性對(duì)照2）用槍頭混勻，冰上放置30min陰性對(duì)照的目的？2.420C循環(huán)水浴熱激90秒3.冰浴2分鐘4.每管加800uLLB液體培養(yǎng)基，370C慢搖1小時(shí)（150rpm）5.100uL或50uL已復(fù)蘇的感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含Amp的培養(yǎng)皿中6.倒置培養(yǎng)過(guò)夜（370C）影響轉(zhuǎn)化效率的因素細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)(5x107個(gè)/mL)感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量試劑的質(zhì)量外源DNA的質(zhì)量與數(shù)量器皿的潔凈度污染—盡量所有打開(kāi)器皿蓋的操作都在超凈臺(tái)中進(jìn)行思考題如陰性對(duì)照中長(zhǎng)出菌，原因？在Amp培養(yǎng)板中，菌的密度過(guò)高或培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)會(huì)在陽(yáng)性菌的周圍長(zhǎng)出一些小的衛(wèi)星菌落，它們是Amps的，原因？配試劑1.LB固體培養(yǎng)基100mL

滅菌后待溫度降到600C左右，加入Amp，立即鋪平板2.溶液I50mL

分成四份3.溶液III50mL

分成四份4.TE50mL

滅菌后分裝于小管中-200C冰箱保存5.氯仿:異戊醇＝24:1300mL

分成四份（棕色瓶）6.酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1200mL

棕色瓶分成四份（棕色瓶）（注：試劑2－6為下一個(gè)實(shí)驗(yàn)的試劑，本周準(zhǔn)備）滅菌1.LB固體培養(yǎng)基2.溶液I，溶III3.TE4.小指管：1.5mL

、2mL

各40個(gè)/2組，0.5mL20/2組5.槍頭：200uL、1mL各1盒/2組明天上午7:45收滅菌的東西及平板，下周三下午接菌預(yù)培養(yǎng)質(zhì)粒DNA的提取及其定性定量分析

時(shí)間安排

時(shí)間實(shí)驗(yàn)內(nèi)容8:00-9:30講解本實(shí)驗(yàn)的基本原理及相關(guān)知識(shí)9:40-13:30質(zhì)粒DNA的提取13:30-16:00電泳、測(cè)OD26O和OD28016:00-17:00準(zhǔn)備下次實(shí)驗(yàn)、滅菌質(zhì)粒DNA提取的相關(guān)知識(shí)質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA

如何去除下列物質(zhì)？蛋白基因組DNARNA

糖類脂類小分子物質(zhì)

堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們，在堿性pH，DNA變性，恢復(fù)中性時(shí)，線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒DNA卻可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中幾乎所有純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒DNA分子相對(duì)較小和共價(jià)閉合環(huán)狀這兩個(gè)特性核酸的凝膠電泳電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中的涌動(dòng)現(xiàn)象丙烯酰胺凝膠電泳

5bp—500bp（分辨率高，1bp)瓊脂糖凝膠電泳

200bp—50kb（分離范圍廣、方便）瓊脂糖介質(zhì)結(jié)構(gòu)均一，含水量大（98-99%），可通過(guò)調(diào)整瓊脂糖的濃度改變孔徑的大小，起到分子篩的作用核酸為兩性分子，在pH3.5時(shí)，堿基上的氨基解離而磷酸基團(tuán)中只有第一個(gè)磷酸解離，整個(gè)分子帶正電；pH8左右時(shí)，堿基幾乎不解離，而磷酸全部解離，整個(gè)分子帶負(fù)電膠濃度（%）線性DNA分離范圍（kb)0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3在堿性環(huán)境下，不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖結(jié)構(gòu)，幾乎具有相同的電荷密度，其電泳行為與SDS類似，線性分子在凝膠中的遷移率與其所含堿基對(duì)數(shù)目的對(duì)數(shù)值成反比?？梢越朴糜诠浪惴肿拥拇笮?/p>

影響遷移率的因素

DNA分子的大小瓊脂糖凝膠的濃度

DNA的構(gòu)象所加電壓一般5V/cm

電場(chǎng)方向染料的存在與否電泳緩沖液的組成常用電泳緩沖液0.5XTBE5X儲(chǔ)液1XTAE50X儲(chǔ)液凝膠載樣（上樣）緩沖液（loadingbuffer)增加樣品密度使樣品帶顏色，起指示作用常用染料EB:溴化乙錠，加入膠中或電泳后染色。EB插入核酸堿基平面，吸收紫外光的能量產(chǎn)生熒光，熒光的強(qiáng)度與DNA的量在一定范圍內(nèi)成正相關(guān)SYBR:新型低毒，高靈敏度熒光染料，可直接加入樣品中，價(jià)格較昂貴膠濃（%）溴酚藍(lán)二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb核酸定量紫外吸收法比爾-朗伯定律：ODλ=?c雙鏈DNA：1OD260

＝50ug/mL單鏈DNA和RNA：1OD260

＝40ug/mL單鏈寡核苷酸：1OD260

＝33ug/mL優(yōu)點(diǎn)：快速，不破壞樣品缺點(diǎn)：靈敏度低，要求樣品較純OD260／OD280：用于表示蛋白制品被核酸污染的程度，也可用來(lái)表示核酸被蛋白污染的程度，但核酸的消光系數(shù)較高，只有存在較多的蛋白污染時(shí)才能反應(yīng)出來(lái)純DNA：OD260:OD280=1.8純RNAOD260:OD280=2.0純蛋白：OD260:OD280=0.57EB或其它染料染色法:設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)樣品較純樣品：直接測(cè)OD260含較多雜質(zhì)：EB或其它染料估測(cè)實(shí)驗(yàn)流程質(zhì)粒DNA的提取接含PUC18(或pET21a)質(zhì)粒的單菌落于3mlLBAmp+液體培養(yǎng)基中

370C，190rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜

6000rpm、離心2min，收集菌體

100uL溶液I懸浮菌體（充分振蕩），室溫10min

加入200uL溶液II（振蕩混勻），冰上靜置5min裂解菌體

加入150uL溶液III（振蕩混勻），冰上靜置15min質(zhì)粒DNA復(fù)性

12000rpm，離心15min

上清加等體積的酚：氯仿：異戊醇（振蕩混勻）

12000rpm，離心15min

上清加等體積的氯仿：異戊醇（振蕩混勻）

12000rpm，離心15min

上清加2倍體積的無(wú)水乙醇（充分混勻），-200C30min

12000rpm，離心15min

沉淀用75%乙醇1mL洗滌兩次（振蕩混勻、離心）

12000rpm，離心10min

沉淀超凈臺(tái)中風(fēng)干

沉淀用20uLRTE溶解，-200C保存質(zhì)粒DNA的電泳鑒定1%瓊脂糖凝膠20mL(用buffer配)0.5xTBE100mL2uL質(zhì)粒DNA+1uL10xloading+1uLSYBR+3uL無(wú)菌水80伏恒壓電泳結(jié)果用凝膠成像儀分析照相質(zhì)粒DNA的定量分析質(zhì)粒DNA稀釋200倍（用TE緩沖液稀釋），總體積300uL滅菌：1mL、200uL槍頭各一盒/2組

0.2mLPCR管30個(gè)/全班，1.5mL小指管30個(gè)/2組PCR基因擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收

時(shí)間安排

時(shí)間實(shí)驗(yàn)內(nèi)容8:00-9:00準(zhǔn)備PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系9:00-10:30PCR擴(kuò)增、講解本實(shí)驗(yàn)的基本原理及相關(guān)知識(shí)10:30-12:30PCR擴(kuò)增、準(zhǔn)備電泳凝膠和下次實(shí)驗(yàn)試劑13:00-14:30電泳14:30-17:00PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、滅菌5’3’3’5’高溫變性低溫退火中溫延伸不斷循環(huán)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖目的片段模板引物對(duì)基本原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction),即PCR技術(shù)在合適條件下，這種循環(huán)不斷重復(fù),前一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物可作為后一循環(huán)的模板參與DNA的合成，最終使產(chǎn)物DNA的量按2n方式擴(kuò)增理論上講經(jīng)過(guò)30次的循環(huán)反應(yīng),DNA擴(kuò)增倍數(shù)為106~109PCR的特點(diǎn):

特異性高、靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便、無(wú)放射性、既可擴(kuò)增DNA也可擴(kuò)增RNA反應(yīng)體系模板：DNA或RNA引物：sense和antisense

Taq酶：耐熱DNA聚合酶dNTPMixture底物PCRbuffer：10mmol/LTris-HClpH8.4(200C)50mmol/LKClMg2+0.1mg/mL乙酰BSA引物的設(shè)計(jì)的總原則：擴(kuò)增的效率和特異性長(zhǎng)度：15—30bp堿基盡可能隨機(jī)分布（G+C含量45-55%）引物內(nèi)部不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)兩引物間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在3’端一定要與模板嚴(yán)格配對(duì)5’端可引入突變，加酶切位點(diǎn)等輔助軟件：Primer5，Oligo，DNAsis等引物Tm：DNA分子一半為單鏈，另一半為雙鏈時(shí)的溫度稱為該復(fù)合體的溶解溫度Tm，與G+C含量有關(guān)PCR引物設(shè)計(jì)AKPCDS5542038引物15’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC3’BamH1CDS5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT…………….…………………….……………….……………….CDS

….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’引物2

HindⅢ3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG5’擴(kuò)增條件的優(yōu)化優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)：退火溫度和時(shí)間、變性溫度和時(shí)間優(yōu)化Mg2+濃度模板的純度，優(yōu)化模板濃度優(yōu)化dNTP的濃度優(yōu)化引物濃度PCR儀：熱蓋、升降溫速度、精度PCR管的質(zhì)量等PCR的應(yīng)用目的基因的獲得基因組克隆DNA序列分析RNA分析基因突變基因組的比較研究醫(yī)學(xué)疾病診斷等PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收回收的方法很多，主要目的是去除Taq酶等，取出目的DNA片段進(jìn)行后續(xù)操作低熔點(diǎn)瓊脂糖法離心柱過(guò)濾離心柱吸附玻璃奶吸附實(shí)驗(yàn)流程PCR擴(kuò)增2.5mmol/LdNTPMixture2.0uL10xbufferMg2+Free2.5uLEx－TaqE1uL（1U）10pmol/uLsense1uL10pmol/uLantisense1uL模板DNA1uLMgCl2(25mmol/L)1uLddH2O16.5uL940C,2’

940C,1’

420C,1’

720C,2’

720C,10’|30cycles|PCR產(chǎn)物的電泳1xTAE150mL0.8%瓊脂糖凝膠20mL(用1xTAE配)25uLPCR產(chǎn)物+3uL10xloading(含SYBR熒光染料)80伏恒壓電泳PCR產(chǎn)物的回收（玻璃奶吸附法）

1.

切膠、稱膠重2. 每100mg膠加入300uL溶膠液，500C溶膠(一定要溶解)將在-200C凍存的玻璃奶解凍，振勻!!在溶解后的膠液中加入10uL玻璃奶，吹打均勻，冰浴沉淀10min5.10,000rpm，離心1min，棄上清6.在離心所得沉淀中加入200uL稀釋液，吹打均勻，10,000rpm離心1min，去上清，如此洗兩次（稀釋液：3倍體積濃縮洗膠液加入7倍體積無(wú)水乙醇）7.超凈臺(tái)中涼干（也可在500C干燥）8.加入20uLTE，吹打均勻，600C保溫5-10min，12,000rpm離心2min，收集上清（檢測(cè)是否含有DNA

）,-200C保存配試劑：1.組織勻漿液100mL

10mmol/LTris-HClpH8.025mmol/LEDTA100mmol/LNaCl2.酶解液30mL

（滅菌后再加蛋白酶K和SDS)20mmol/LTris-HClpH8.050mmol/LEDTA200mmol/LNaCl200ug/mL蛋白酶K1％SDS

3.生理鹽水1000mL

4.3mol/LNaAcpH5.230mL

先用15mL水溶解固體NaAc

再用3mol/L乙酸調(diào)pH5.2，最后定容（試劑1－4為下一個(gè)實(shí)驗(yàn)的試劑，本周準(zhǔn)備）滅菌試劑1－4槍頭：1mL

、200uL各一盒小指管:2.0、0.5mL各20個(gè)DNA重組－限制性酶切和連接

哺乳動(dòng)物基因組DNA的分離

時(shí)間安排時(shí)間實(shí)驗(yàn)內(nèi)容8:00-8:30準(zhǔn)備限制性酶切反應(yīng)體系8:30-10:30370C酶解3小時(shí)、講解本實(shí)驗(yàn)的基本原理及相關(guān)知識(shí)10:30-12:00370C酶解3小時(shí)、準(zhǔn)備下次實(shí)驗(yàn)、滅菌12:00-15:00純化酶切載體和目的基因、連接反應(yīng)15:00-17:00哺乳動(dòng)物基因組DNA的分離(到酶解過(guò)夜)DNA重組DNA重組:外源DNA分子與載體的連接，即將外源目的基因裝進(jìn)載體的過(guò)程酶切連接轉(zhuǎn)化篩選重組方法類型要求特點(diǎn)平端高濃度的連接酶限制酶位點(diǎn)消失，效率低，有串聯(lián)拷貝不同粘端載體酶解后需純化限制酶位點(diǎn)保留，單向插入，常用相同粘端用磷酸酶去掉5’-磷酸限制酶位點(diǎn)保留，有串聯(lián)拷貝和方向插入3’AT-vectorPCR產(chǎn)物可直接克隆+酶切連接轉(zhuǎn)化篩選Amp+影響重組效率的因素酶切效果載體和目的基因的比例細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)(5x107個(gè)/mL)感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量試劑的質(zhì)量外源DNA的質(zhì)量與數(shù)量器皿的潔凈度污染—盡量所有打開(kāi)器皿蓋的操作都在超凈臺(tái)中進(jìn)行思考題若無(wú)陽(yáng)性克隆，原因？如陰性對(duì)照中長(zhǎng)出菌，原因？在Amp培養(yǎng)板中，菌的密度過(guò)高或培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)會(huì)在陽(yáng)性菌的周圍長(zhǎng)出一些小的衛(wèi)星菌落，它們是Amps的，原因？重組子的篩選1.提取質(zhì)粒，酶切，電泳驗(yàn)證2.抗藥性篩選法，插入失活3.營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法4.雜交法：原位雜交，Southern5.測(cè)序6.表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)：測(cè)活、電泳、蛋白印跡7、α互補(bǔ)載體中引入LacZ’基因，包括LacZ的調(diào)控序列和編碼氨基端146Aa（α-肽）的序列，表達(dá)產(chǎn)物無(wú)活性，而在受體細(xì)胞中，染色體DNA上含有LacZ的編碼β-半乳糖苷酶羧基端的序列，其產(chǎn)物也無(wú)活性。二者結(jié)合才能有全酶的活性—α-互補(bǔ)。將無(wú)色的5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(x-gal)底物水解為藍(lán)色的5-溴-4-靛藍(lán)在146Aa（α-肽）編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)且不破壞其閱讀框，當(dāng)有外源基因插入時(shí)，則無(wú)完整的α-肽生成，β-半乳糖苷酶無(wú)活性，菌落白色，而無(wú)外源基因插入時(shí)，長(zhǎng)出藍(lán)色菌落。有些質(zhì)粒LacI缺失，不用IPTG誘導(dǎo)

啟動(dòng)子1LacI啟動(dòng)子2操縱子LacZLacYLacA阻遏蛋白

LacZ’乳糖操縱子IPTG實(shí)驗(yàn)流程連接反應(yīng)體系A(chǔ)KP3uLPUC183uL10xligasebuffer1.0uLT4DNAligase0.5uLddH2O2.5uL酶切反應(yīng)體系管號(hào)tube1tube2核酸15uLAKP7uLPUC1810xbufferK2uL1uLddH2O1uL0BamHI1uL1uLHandIII1uL1uL

370C酶解3小時(shí)分別將tube1和tube2中的樣品先加入1/10體積的3mol/L

NaAc（pH5.2)，再加2倍體積的無(wú)水乙醇，-200C沉淀30分鐘，12000rpm離心15min沉淀再用75%乙醇洗滌，12000rpm離心15min，干燥后加5uLTE溶解產(chǎn)物按連接反應(yīng)體系進(jìn)行連接反應(yīng)感受態(tài)細(xì)胞的制備：見(jiàn)前面的實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化及復(fù)蘇1.取200uL感受態(tài)細(xì)胞，加入10uL連接產(chǎn)物

取200uL感受態(tài)細(xì)胞，加入2uL無(wú)菌水（對(duì)照1）取200uL0.1M的CaCl2，加入5uL連接產(chǎn)物

（對(duì)照2）用槍頭混勻，冰上放置30min。陰性對(duì)照的目的？2.420C循環(huán)水浴熱擊90秒，冰浴2分鐘3.每管加800uLLB液體培養(yǎng)基，370C慢搖（150rpm）1小時(shí)4.在預(yù)制的LB瓊脂平板上，加40uLXgal（20mg/mL

）和40uLIPTG（20mg/mL）溶液，均勻涂布于瓊脂平板表面5.100uL或50uL已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，涂布在上述含Amp的培養(yǎng)皿中，平板向上靜置30min6.倒置培養(yǎng)過(guò)夜（370C）重組子的篩選抗性篩選藍(lán)白斑篩選提取比較重組質(zhì)粒的大小酶切鑒定：觀察是否含有已知大小的重組的目的基因片段哺乳動(dòng)物基因組DNA的分離及其定性定量分析提純的思路1.基因組DNA的特性：分子量較大、易斷（如何保證DNA分子的完整性？）2.組織和細(xì)胞的破碎3.要去處的物質(zhì)：蛋白、多糖、脂類、RNA和小分子物質(zhì)

所提取的DNA片段的大?。?00—150kb用途：Southern雜交、基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)流程

基因組DNA的提取：0.2g鼠肝，冰冷生理鹽水洗3次，剪碎

碎鼠肝轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器中，加入2mL勻漿液，勻漿6次（冰上操作）

勻漿液轉(zhuǎn)入2mL小指管，40C,5000rpm離心2min,

沉淀加0.4mL無(wú)菌水，吹散，再加0.4mL酶解液，慢慢顛倒混勻

550C水浴酶解過(guò)夜，40C存放

加RNase,終濃度200ug/mL，370C保溫60min

加等體積酚/氯仿/異戊醇，慢慢顛倒混勻，冰上平倒靜置10min

40C，10000rpm離心10min，用擴(kuò)口槍頭取出上清

上清加等體積氯仿/異戊醇，慢慢顛倒混勻

40C,10000rpm，用擴(kuò)口槍頭取上清

上清加1/10體積的NaAc和加2倍體積的無(wú)水乙醇慢慢混勻，-200C靜置30min

12000rpm離心15min，棄上清

沉淀用1mL75%冷乙醇洗兩次，每次12000rpm離心10min，棄上清

超凈臺(tái)中干燥加50uLTE,40C溶解過(guò)夜，-200C保存電泳：

0.3%瓊脂糖凝膠20mL(用TBE配)4uLDNA+5uLH2O+1uL10xloading（含熒光染料SYBR）

80伏恒壓電泳，凝膠成像儀觀察和分析結(jié)果基因組DNA的定量分析：基因組DNA稀釋300倍（用TE緩沖液稀釋），總體積300uL配試劑：1.0.1mol/L的CaCl2100mL2.LB液體培養(yǎng)基110mL

胰蛋白胨（typtone)1.1g

酵母提取物（yeastextract)0.55g

NaCl1.1g

加部分水溶解后加22μL5mol/LNaOH，定容到120mL

兩個(gè)40ml到250mL錐形瓶，其余的分裝到大試管中（3mL/管）3.LB固體培養(yǎng)基100mLLB液體培養(yǎng)基中含1.5％的瓊脂

滅菌后待溫度降到600C左右，加入Amp，立即鋪平板滅菌1.試劑1－32.小指管：2.0、1.5mL各40個(gè)/2組

0.5mL小指管20/2組3.槍頭：200uL1盒/組1mL1盒（擴(kuò)口槍頭30個(gè)）/組4.50mL離心管2個(gè)／組明天上午7:45收滅菌的東西及平板，下周三下午接菌預(yù)培養(yǎng)DNA重組－重組子的轉(zhuǎn)化

哺乳動(dòng)物基因組DNA的分離（續(xù)）

時(shí)間安排時(shí)間實(shí)驗(yàn)內(nèi)容8:00-8:30接菌8:40-10:30培養(yǎng)2.5－3小時(shí)、基因組DNA的分離10:30-11:30培養(yǎng)2.5－3小時(shí)、基因組DNA的分離、準(zhǔn)備電泳凝膠11:30-12:30午飯12:30-17:00感受態(tài)細(xì)胞的制備、重組子的轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇、涂平板、電泳并觀察結(jié)果、配試劑滅菌明天上午7:45收滅菌的東西及平板，下周三下午接菌預(yù)培養(yǎng)滅菌小指管：2.0、1.5mL各40個(gè)/2組

0.5mL小指管20/2組3.槍頭：200uL1盒/組1mL1盒/2組DNA重組－重組子的篩選重組子轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株

時(shí)間安排時(shí)間實(shí)驗(yàn)內(nèi)容8:00-8:30接菌（表達(dá)菌株）8:40-12:00培養(yǎng)2.5－3小時(shí)、質(zhì)粒DNA的提取、準(zhǔn)備電泳凝膠12:00-15:00質(zhì)粒DNA的限制性酶切，電泳并觀察結(jié)果12:30-17:00感受態(tài)細(xì)胞的制備、重組子的轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇、涂平板、配試劑滅菌配試劑滅菌1.TM液體培養(yǎng)基40mL2.槍頭

200ul1盒

1ml1盒明天上午7:45收滅菌的東西及平板，下周三下午接菌預(yù)培養(yǎng)外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

時(shí)間安排時(shí)間實(shí)驗(yàn)內(nèi)容8:00-8:30接菌8:30-10:30菌體培養(yǎng)、講解本實(shí)驗(yàn)的基本原理及相關(guān)知識(shí)10:30-11:20配試劑和準(zhǔn)配實(shí)驗(yàn)11:20-16:00加IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)4.5小時(shí)13:00-16:00設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)討論16:00-17:00離心PromoterRibosomebindingsiteGeneTerminatorATGTAADNARNAProtein大腸桿菌中基因表達(dá)的重要信號(hào)啟動(dòng)子和載體系統(tǒng)受IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)載體lac啟動(dòng)子：如PUC，pGEM，pSK等，表達(dá)的蛋白與β－半乳糖苷酶氨基端融合。更大程度的誘導(dǎo)lac啟動(dòng)子需CAP（crp基因產(chǎn)物，cAMP激活蛋白）參與，不能用以葡萄糖為炭源的培養(yǎng)基阻遏蛋白IPTG啟動(dòng)子1LacI啟動(dòng)子2操作子LacZ’多克隆位點(diǎn)trp-lac(tac或trc)啟動(dòng)子：由trp啟動(dòng)子-35區(qū)和lacUV5啟動(dòng)子-10區(qū)融合而成，受lacI阻抑物調(diào)控而不受CAP介導(dǎo)的cAMP調(diào)控機(jī)制的調(diào)控。如：pKK223-3T7噬菌體啟動(dòng)子：在含T7噬菌體啟動(dòng)子的載體中，外源基因的表達(dá)受T7噬菌RNA聚合酶調(diào)控帶有colE1復(fù)制區(qū)，帶有Amp或Kan抗性表達(dá)效率高

LacIpET大腸桿菌基因組Lac啟動(dòng)子T7啟動(dòng)子IPTG誘導(dǎo)IPTG誘導(dǎo)

大腸桿菌

RNA聚合酶T7基因1T7RNA聚合酶滅活T7溶菌酶基因T7溶菌酶T7RNA聚合酶靶基因pET系統(tǒng)調(diào)控元件LacILac阻遏物L(fēng)ac阻遏物DE3LacOLacOpLysS

orE受溫度誘導(dǎo)的表達(dá)載體：PL啟動(dòng)子λ噬菌體PL啟動(dòng)子受溫度敏感型阻抑物cIts857調(diào)控，cIts857在低溫下能抑制PL驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄，而高溫則不能如：pHUB系列，pPLc系列等PLcIts857+宿主420C靶基因融合表達(dá)載體將兩個(gè)或多個(gè)開(kāi)放閱讀框架按一定的順序連在一起表達(dá)成一個(gè)雜和蛋白靶蛋白連接在運(yùn)載蛋白的N-端或C-端GST系統(tǒng)：將GSTs(谷光苷肽S-轉(zhuǎn)移酶）與外源蛋白融合表達(dá)后，可用GST－瓊脂糖柱純化，用GST或蛋白酶洗脫聚組氨酸－Ni系統(tǒng)：將外源蛋白與聚組氨酸融合表達(dá)，暴露的多聚組氨酸能結(jié)合于固化Ni樹(shù)脂，用酸性米唑洗脫融合表達(dá)載體啟動(dòng)子ATG運(yùn)載序列切割序列多克隆位點(diǎn)靶蛋白附著于已知酶功能和／或抗原組成的結(jié)構(gòu)域，有利于靶蛋白的標(biāo)記與純化靶蛋白與信號(hào)肽相連，可以將融合蛋白分泌到特定的細(xì)胞區(qū)運(yùn)載蛋白能保護(hù)靶蛋白免受原核宿主的蛋白酶降解運(yùn)載蛋白可以改變靶蛋白溶解性，防止形成不溶性包涵體表達(dá)系統(tǒng)：

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)釀酒酵母、植物實(shí)驗(yàn)中，要根據(jù)所要表達(dá)的蛋白質(zhì)的大小、蛋白質(zhì)的需要量、是否需要活性以及實(shí)驗(yàn)室的條件等綜合考慮選擇合適的宿主-載體系統(tǒng)大腸桿菌遺傳圖譜明確，容易培養(yǎng)，費(fèi)用底，已有許多成功的先例，是首選的表達(dá)系統(tǒng)，但大腸桿菌中缺少翻譯后修飾系統(tǒng)，一些修飾后才有活性的蛋白必需選擇真核細(xì)胞為宿主分離基因構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化篩選鑒定優(yōu)化表達(dá)條件表達(dá)條件的優(yōu)化

翻譯效率的優(yōu)化:啟動(dòng)

ATG和SD序列之間的距離(5-7個(gè)核苷酸)

翻譯起始區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)減少SD序列核苷酸之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)密碼子的使用:稀有密碼子和密碼子的偏倚性培養(yǎng)條件的優(yōu)化:培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)物的濃度、培養(yǎng)基的組成和pH等可溶性表達(dá)不溶性表達(dá)融合表達(dá)非融合表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程1.預(yù)培養(yǎng)：接一單菌落到3mL含Amp的LB培養(yǎng)基中，370C、190rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜2.取0.5mL菌液轉(zhuǎn)移到50mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，

370C、250rpm振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，至OD6000.7-0.83.加入IPTG（40ug/mL）4.繼續(xù)在370C、250rpm振蕩培養(yǎng)4.5小時(shí)5.離心6000rpm，40C，10min6.沉淀在－200C凍存配試劑和準(zhǔn)配實(shí)驗(yàn)1、0.1%DEPC1500mL2、4mol/L異硫氰酸胍50mL3、2mol/LNaAcpH4.830mL4、4mol/LLiCl20mL5、3mol/LNaAcpH5.230mL（試劑2－5均用0.1%DEPC配制）滅菌1、0.1%DEPC20mL2、4mol/L異硫氰酸胍3、2mol/LNaAcpH4.84、4mol/LLiCl

5、3mol/LNaAcpH5.26、1.5mL

小指管20個(gè)

0.5mL

小指管10個(gè)7、槍頭200uL1盒

1mL1盒

5mL6支8、50mL離心管三個(gè)9、研缽一套，剪刀一把(剪刀、研缽、耗材等均用0.1%DEPC處理后再滅菌)植物總RNA的提取及其定性定量分析

時(shí)間安排時(shí)間實(shí)驗(yàn)內(nèi)容8:00-9:00講解RNA提取的基本原理及相關(guān)知識(shí)9:10-15:30RNA提取,配制RNA電泳的瓊脂糖凝膠15:30-17:00RNA電泳,測(cè)定紫外吸收，準(zhǔn)備下次實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕虻墨@得TR-PCRNorthern雜交CDNA克隆核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)體外轉(zhuǎn)譯差異顯示等為什么要提取RNA?核糖核酸核蛋白體不穩(wěn)定性,易被降解不均一性:rRNAmRNAtRNA及小分子RNARNA有哪些特性?目標(biāo)：

保證分離RNA的完整性、純度、產(chǎn)率盡量簡(jiǎn)化操作步驟、縮短提取過(guò)程、以減少各種有害因素對(duì)RNA的破壞、降低雜質(zhì)的污染到最低程度等

RNA的降解：物理、化學(xué)、酶學(xué)－－RNA酶（外源：環(huán)境、器皿、耗材、試劑；內(nèi)源：組織本身含有的RNA酶）試劑專用，最好使用新開(kāi)封的,分小份保存試劑，用后丟棄器皿、耗材、取液槍專用勤換手套等如何破壞RNA酶的活性？變性劑：異硫氰酸胍、苯酚、氯仿等抑制劑：DEPC、氧釩核糖核苷復(fù)合物、RNA酶蛋白抑制劑、巰基乙醇（或DTT）等在實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)該考慮的問(wèn)題：選材和取材：原核、酵母、植物、動(dòng)物、組織破碎：物理法、化學(xué)法、酶法破碎后的無(wú)細(xì)胞體系含有什么：細(xì)胞殘?jiān)?、核酸（DNA和RNA）、蛋白質(zhì)、蛋白聚糖、糖類、脂類、色素、小分子物質(zhì)等去掉什么留下什么如何去掉不需要的成分－－實(shí)驗(yàn)流程是什么實(shí)驗(yàn)流程在一滅菌50mL離心管中加入:

4mol/L異硫氰酸胍4mL

苯酚3mL2mol/LNaAc(pH4.8)0.3mL

氯仿0.6mL

避光培養(yǎng)小麥10天

稱取1.2g小麥苗的葉片,冰浴剪碎

液氮研磨葉片成粉末,轉(zhuǎn)入已準(zhǔn)備好的離心管中

混勻,冰浴30min（？）

40C,10000rpm,15min

上清至另一離心管中

加2倍體積無(wú)水乙醇,-200C,1小時(shí)

40C,10000rpm,15min

棄上清,沉淀中加4mol/LLiCl1mL,吹散

移入1.5mL小管,冰浴1小時(shí)

40C,13000rpm,15min

棄上清，沉淀加入400uLDEPC水,400uL氯仿混勻（？），13000rpm，6min

上清加1/10體積3mol/LNaAc(pH5.2)，2倍體積無(wú)水乙醇混勻，-200C,30分鐘

13000rpm，15min

沉淀用70%醇洗兩次,每次離心

室溫稍干燥

沉淀加50uLDEPC水溶解(-200C保存)RNA電泳：制膠：1％變性瓊脂糖膠稱取0.2g瓊脂糖，加入DEPC水12.6mL，5×電泳緩沖液4mL，加熱使溶解，稍冷卻（60－65℃）加入37％甲醛3.4mL和4μLGelStar混勻（或電泳完以后用EB染色），室溫凝固30分鐘(通風(fēng)櫥操作)7μL樣品+1μL樣品緩沖液80V恒壓電泳測(cè)OD260和OD260

／OD280結(jié)果：18SrRNA1.8Kb-2.0Kb28SrRNA4.6Kb-5.3KbmRNA0.6-5Kb(1.5-2.0Kb)（80-85%rRNA,28S,18S,5S；10-15%tRNA

及小分子RNA；1-5%mRNA）思考題1、如何分離提取脂類和糖類含量高的組織的總RNA？2、如何分離提取RNA酶含量或活性含量高的組織的總RNA？3、如何分離提取mRNA？4、還有其它簡(jiǎn)單的方法提取RNA嗎？配試劑1. 破碎緩沖液200mL50mMTris-HClpH8.02mMEDTA 測(cè)活液30mL50mMTris-HClpH8.50.2mg/mlBSA5mMMgCl2

10mMpNPP3.終止液300mL0.2MNa3PO4

4. 1.5MTris-HClpH8.8，100mL5. 0.5MTris-HClpH6.8，100mL30%Acr/Bis儲(chǔ)液200mL

過(guò)濾（棕色瓶）7. 10%AP10mL，－200C保存5x電極緩沖液500mL

室溫存放R-250染色液500mL

（棕色瓶）10.10xPBS儲(chǔ)液

137mMNaCl

＋2.7mMKCl10mMNa2HPO4

＋2mMKH2PO4

溶于900ml水后用HCl調(diào)pH7.4后定容到1000ml11.印跡緩沖液1000mL12.麗春紅染色液300mL13.封閉液300mL5%脫脂奶粉（用1xPBS配制）14.