細(xì)菌分離培養(yǎng)-細(xì)菌標(biāo)本片的制備及染色方法（動(dòng)物微生物課件）

掌握細(xì)菌常用標(biāo)本片的制作及染色方法；認(rèn)識革蘭氏染色的反應(yīng)特性；一、實(shí)訓(xùn)目的二、實(shí)訓(xùn)器材病料、細(xì)菌培養(yǎng)物、接種環(huán)、玻片、酒精燈、染色缸、染色架、染色液等。三、實(shí)訓(xùn)內(nèi)容（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作（二）血液推片的制作（三）常用的細(xì)菌染色方法（四）常用染色液的配制（五）注意事項(xiàng)（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作1.涂片2.干燥3.固定固體培養(yǎng)物：取清潔載玻片一塊，用吸管吸取生理鹽水1滴置于玻片中央，再將接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷后從固體培養(yǎng)基上挑取少許菌落，置于玻片上的生理鹽水中混均勻，并在玻片上涂成直徑約為1cm的涂面，要求薄而均勻。（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作1.涂片液體培養(yǎng)物：取清潔載玻片一塊，將接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷后取一滴培養(yǎng)液或液體，置于玻片中央，混均勻，涂成直徑約為1cm的涂面。病變組織抹片：做無菌切開，用切面在玻片中央觸一下或壓印成一薄層即可。（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作1.涂片在室溫下自然干燥，必要時(shí)將涂面向上，置火焰上方30～40cm來回微烤使其干燥。2.干燥火焰固定：將干燥后的玻片涂面向上，在火焰上快速來回通過2～3次，其溫度以手背接觸玻片底面感覺微燙手為宜?；瘜W(xué)固定：將干燥后的玻片浸入甲醇（乙醇、丙酮）中，或在玻片上滴數(shù)滴甲醇，2～3分鐘后自然揮發(fā)干燥。3.固定（二）血液推片的制作取一張邊緣整齊的載玻片，用其一端蘸取一滴血液，在另一張干凈無油脂的載玻片上，以45°角度均勻地推成一薄血涂片，以紅細(xì)胞不重疊為宜。1.取血：將血液滴在載玻片上。2.推片：以左手拿該片，用另一個(gè)載玻片作推片，在左手載玻片上由前向后接觸血滴，使兩載玻片約成45°角，輕輕移動(dòng)，使血滴成一直線，然后由前向后推為一均勻的薄片。5/11/202413讓血液粘附在推片上推出均勻的血膜5/11/202415竅門：將載玻片的一端墊起，有助于推出均勻血膜。5/11/202416做細(xì)菌涂片時(shí)，不宜涂得過厚，以免影響制片效果。固定必須確實(shí)，火焰固定時(shí)不宜溫度過高，以免破壞菌體結(jié)構(gòu)。每種染液染色的過程中應(yīng)保持染色液不干，尤其加熱染色的染液，在染色過程中應(yīng)隨時(shí)添加，以免蒸發(fā)干，影響染色效果。每種染液染色后，應(yīng)用水將染液一起沖掉，不可先將染液傾去后再用水沖洗。注意事項(xiàng)：細(xì)菌標(biāo)本片制備及染色方法

掌握細(xì)菌常用標(biāo)本片的制作及染色方法；認(rèn)識革蘭氏染色的反應(yīng)特性；一、實(shí)訓(xùn)目的二、實(shí)訓(xùn)器材病料、細(xì)菌培養(yǎng)物、接種環(huán)、玻片、酒精燈、染色缸、染色架、染色液等。三、實(shí)訓(xùn)內(nèi)容（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作（二）血液推片的制作（三）常用的細(xì)菌染色方法（四）常用染色液的配制（五）注意事項(xiàng)（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作1.涂片2.干燥3.固定固體培養(yǎng)物：取清潔載玻片一塊，用吸管吸取生理鹽水1滴置于玻片中央，再將接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷后從固體培養(yǎng)基上挑取少許菌落，置于玻片上的生理鹽水中混均勻，并在玻片上涂成直徑約為1cm的涂面，要求薄而均勻。（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作1.涂片液體培養(yǎng)物：取清潔載玻片一塊，將接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷后取一滴培養(yǎng)液或液體，置于玻片中央，混均勻，涂成直徑約為1cm的涂面。病變組織抹片：做無菌切開，用切面在玻片中央觸一下或壓印成一薄層即可。（一）細(xì)菌標(biāo)本片的制作1.涂片在室溫下自然干燥，必要時(shí)將涂面向上，置火焰上方30～40cm來回微烤使其干燥。2.干燥火焰固定：將干燥后的玻片涂面向上，在火焰上快速來回通過2～3次，其溫度以手背接觸玻片底面感覺微燙手為宜?；瘜W(xué)固定：將干燥后的玻片浸入甲醇（乙醇、丙酮）中，或在玻片上滴數(shù)滴甲醇，2～3分鐘后自然揮發(fā)干燥。3.固定（二）血液推片的制作取一張邊緣整齊的載玻片，用其一端蘸取一滴血液，在另一張干凈無油脂的載玻片上，以45°角度均勻地推成一薄血涂片，以紅細(xì)胞不重疊為宜。1.取血：將血液滴在載玻片上。2.推片：以左手拿該片，用另一個(gè)載玻片作推片，在左手載玻片上由前向后接觸血滴，使兩載玻片約成45°角，輕輕移動(dòng)，使血滴成一直線，然后由前向后推為一均勻的薄片。5/11/202431讓血液粘附在推片上推出均勻的血膜5/11/202433竅門：將載玻片的一端墊起，有助于推出均勻血膜。5/11/202434（三）常用的細(xì)菌染色方法（三）常用的細(xì)菌染色方法1.單染法：又叫簡單染色法，即只用一種染料進(jìn)行染色。（1）美藍(lán)染色法染色液配制：甲液：美藍(lán)0.3g、95%酒精30mL；乙液：0.01%苛性鉀溶液100mL。先配甲液，將美藍(lán)放入研缽中，徐徐加入酒精研磨均勻后，把甲、乙兩液混合，過夜后用濾紙過濾即成。新鮮配制的美藍(lán)液染色不好，陳舊的染色好。（三）常用的細(xì)菌染色方法1.單染法：又叫簡單染色法，即只用一種染料進(jìn)行染色。染色方法：在已固定好的抹片上，滴加適量美藍(lán)染色液覆蓋涂面，染色2～3min，水洗，吸水紙輕壓吸干或晾干和鏡檢，結(jié)果菌體呈藍(lán)色。（1）美藍(lán)染色法（2）瑞氏染色法：染色液的配制：取瑞氏染料0.1g，純中性甘油1ml，在研缽中混合研磨，再加入甲醇60ml，使其溶解，裝入中性瓶中過夜，次日過濾，盛入棕色瓶中，暗處保存。保存越久，染色越好。染色方法：細(xì)菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片上以固定標(biāo)本，1～3min后，再滴加與染色液等量的磷酸緩沖液或中性蒸餾水于玻片上，輕輕搖晃使與染色液混和均勻，5min左右水洗，干后鏡檢，結(jié)果菌體呈藍(lán)色，組織細(xì)胞等物呈其他顏色。（2）瑞氏染色法：2.復(fù)染（三）常用的細(xì)菌染色方法革蘭氏染色原理革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-

）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法（KOH溶解試驗(yàn)和氨基肽酶試驗(yàn)可用作輔助試驗(yàn)）。該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。2.復(fù)染（三）常用的細(xì)菌染色方法革蘭氏染色原理G-的細(xì)胞壁中脂類較多，肽聚糖少,用灑精脫脂時(shí)，脂類易除去使得細(xì)胞壁的孔隙變大，從而使結(jié)晶紫染料從細(xì)胞壁中洗脫出來，最后用紅色的染料復(fù)染時(shí)而顯紅色；G+的細(xì)胞壁含脂類較少，肽聚糖多且交聯(lián)緊密，酒精作用后肽聚糖收宿，細(xì)胞壁的孔隙變小使得結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物不能脫出，經(jīng)紅色染料復(fù)染后仍為紫色。

革蘭氏染色染色：初染（結(jié)晶紫）媒染（碘液）脫色（酒精）復(fù)染（復(fù)紅）濾紙吸干油鏡鏡檢safraninCrystalviolet5/11/202442涂片

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干燥

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固定

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草酸銨結(jié)晶紫染色1min

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水洗干燥

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碘液媒1min

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水洗干燥

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95%乙醇脫脂15~20s

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水洗干燥→

番紅復(fù)染1min

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水洗干燥→鏡檢。革蘭式染色流程路線：5/11/202443實(shí)訓(xùn)三：細(xì)菌標(biāo)本片制備及染色方法染色步驟5/11/2024（２）（３）（１）（４）１分鐘水洗１分鐘水洗15-３０秒水洗３０-60秒水洗吸干復(fù)紅復(fù)染95％乙醇脫色結(jié)晶紫初染盧戈碘液媒染（1）涂片→干燥→固定215/11/202445固定的目的和方法使細(xì)菌的細(xì)胞凝固，使菌體與玻片粘得更牢固可改變菌體對染料的通透性加熱固定可殺死細(xì)菌，比較安全固定的方法將制成的標(biāo)本勻速通過火焰三次5/11/202446（2）草酸銨結(jié)晶紫染色1min→

水洗干燥5/11/202447結(jié)晶紫初染１分鐘水洗

5/11/202448

（3）碘液媒染1min水洗→干燥5/11/202449碘液媒染１分鐘

水洗

（3）碘液媒染1min水洗→干燥5/11/202450

（4）95%乙醇脫色15～30秒→水洗干燥5/11/202451酒精脫色３０秒水洗5/11/202452

（4）95%乙醇脫色15～30秒→水洗干燥（5）番紅復(fù)染30S～1min→水洗干燥→鏡檢5/11/202453番紅復(fù)染３０秒水洗5/11/20