結核分枝桿菌的核酸檢測教案

結核分枝桿菌的核酸檢測5/9/20241結核分枝桿菌的核酸檢測教案結核分枝桿菌核酸檢測是檢測結核分枝桿菌特異的核酸序列；陽性結果提示該檢測結核分枝桿菌核酸的存在，在排除核酸污染的情況下，可確定該檢測標本中存在結核分枝桿菌。結核分枝桿菌核酸檢測較常采用的目的片段有16SrRNA、IS6110、MBP64、rpoB、hsp65等第1頁/共25頁5/9/20242結核分枝桿菌的核酸檢測教案結核分枝桿菌核酸檢測

增加分子生物學陽性可以作為確診標準，及強調病原學檢查的重要性。3.4.2分子生物學檢查結核分枝桿菌核酸檢測陽性。4診斷原則肺結核的診斷是以病原學（包括細菌學、分子生物學）檢查為主，結合流行病史、臨床表現(xiàn)、胸部影像、相關的輔助檢查及鑒別診斷等，進行綜合分析做出診斷。以病原學、病理學結果作為確診依據(jù)。5.3確診病例結核分枝桿菌核酸檢測陽性，及胸部影像學檢查支持即可確診。第2頁/共25頁5/9/20243結核分枝桿菌的核酸檢測教案常用技術傳統(tǒng)實時熒光定量PCR檢測半巢式全自動實時熒光定量PCR檢測環(huán)介導等溫擴增檢測實時熒光核酸恒溫擴增檢測交叉引物恒溫擴增檢測基因探針檢測第3頁/共25頁5/9/20244結核分枝桿菌的核酸檢測教案抗酸染色每張檢查3-5min或更長時間→陽性率低因素之一熒光染色1.陽性率30%2.無法區(qū)分TB

orNTB1.假陽性率高2.結合抗酸染色第4頁/共25頁5/9/20245結核分枝桿菌的核酸檢測教案結核菌需要先培養(yǎng)出來（2-6周）再加入不同濃度抗菌藥物的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4-8周報告藥敏結果第5頁/共25頁5/9/20246結核分枝桿菌的核酸檢測教案2014年WHO關于結核診斷的標準肺結核所有患者，包括兒童，當疑似肺結核并可咳痰時，應送2份痰做涂片鏡檢或1份痰做XpertMTB/RIF檢測對于涂陰疑似肺結核患者，應當使用XpertMTB/RIF或培養(yǎng)進行診斷耐藥結核當患者具有耐藥結核的風險，或者合并HIV感染，或者病情嚴重時，應使用XpertMTB/RIF做初始診斷；肺外結核所有患者，包括兒童，懷疑有肺外結核時，應當采集相應的樣本進行微生物學和組織學檢查；優(yōu)先推薦使用XpertMTB/RIF做初始診斷第6頁/共25頁5/9/20247結核分枝桿菌的核酸檢測教案GeneXpertXpertMTB/RIF一種半巢式實時熒光PCR體外診斷技術，可以檢測結核分枝桿菌以及利福平耐藥性；針對rpoB基因81bp利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR）設計引物、探針。5個探針結合到野生型，而不是突變體目標。每個探針用不同的熒光染料標記，允許同時檢測。第7頁/共25頁5/9/20248結核分枝桿菌的核酸檢測教案痰標本與處理液1：2混合吸取2ml處理樣品到反應盒將反應盒放入檢測模塊（手工操作完成）標本自動清洗過濾超聲裂解DNA提純DNA和PCR反應試劑混合半巢式實時熒光定量核酸擴增檢測打印檢測報告獲得檢測結果時間：1小時50分鐘系統(tǒng)內自動完成第8頁/共25頁5/9/20249結核分枝桿菌的核酸檢測教案INH單耐藥的患者通常不會考慮立即改變治療方案，與此相反，對RIF單耐藥的患者，無論INH是否耐藥，都會采取與耐多藥患者相同的治療方案1。

約90%利福平耐藥的結核患者同時異煙肼耐藥，也就是耐多藥結核患者2。SvenO.Friedrichetal,.SuitabilityofXpertMTB/RIFandGenotypeMTBDRplusforPatientSelectionforaTuberculosisClinicalTrial.JournalofClinicalMicrobiology.2011(49):2827-2831.

XichaoOuetal.AfeasibilitystudyofXpertMTB/RIFtestattheperipherallevellaboratoryinChina.InternationalJournalofInfectiousDiseases.2015(31):41-46.MTB/RIF檢測對MDR-TB的防控“結核+利福平耐藥”對多耐結核控制產生的效果最為顯著。即便補充異煙肼耐藥，能提升的效果有限。第9頁/共25頁5/9/202410結核分枝桿菌的核酸檢測教案環(huán)介導等溫擴增儀（TB-LAMP）體外定性檢測結核分枝桿菌復合群；在恒溫條件下進行基因擴增反應；4種引物識別6個區(qū)域，特異性高；擴增反應效率高，67℃，40min。主要優(yōu)點在于對實驗室儀器的依賴程度較小，而且試劑成本較低。第10頁/共25頁5/9/202411結核分枝桿菌的核酸檢測教案傳統(tǒng)實時熒光定量PCR檢測目的：定量檢測人標本中的結核分枝桿菌核酸原理：PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累計實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的辦法。第11頁/共25頁5/9/202412結核分枝桿菌的核酸檢測教案XpertMTB/RIFTB-LAMP結核桿菌DNA目的基因片段rpoBgryB及IS6110IS6110方法半巢式實時熒光PCR環(huán)介導恒溫擴增實時熒光定量PCR時間2小時1小時2.5小時檢測敏感度131菌條/ml100菌條/ml1000～10000菌條/ml優(yōu)點全自動、同時檢測利福平耐藥基因、特異性高，生物安全性高67℃恒溫擴增，擴增時間短，特異性高，生物安全性高適合大批量篩查，低費用缺點最多一次同時檢測八個樣本標本用量較少，除痰標本以外的標本需進一步認證假陽性，易污染，需專業(yè)人員操作第12頁/共25頁5/9/202413結核分枝桿菌的核酸檢測教案樣本類型（一）抗酸桿菌涂片鏡檢：

痰液、支氣管灌洗液、支氣管抽吸物、肺穿刺物、肺活檢標本、胃灌洗液、體液、組織、膿腫物、吸出的膿液、創(chuàng)傷標本、大便標本分枝桿菌分離培養(yǎng)：痰液、支氣管灌洗液、支氣管抽吸物、肺穿刺物、肺活檢標本、胃灌洗液、體液、組織、膿腫物、吸出的膿液、創(chuàng)傷標本、大便標本、血液結核分枝桿菌的核酸檢測：痰液、支氣管灌洗液、支氣管抽吸物、肺穿刺物、肺活檢標本、胃灌洗液、體液、組織、膿腫物、吸出的膿液、創(chuàng)傷標本、大便標本、血液（GeneXpert除外）、病理切片第13頁/共25頁5/9/202414結核分枝桿菌的核酸檢測教案樣本類型（二）分枝桿菌菌種鑒定

臨床分枝桿菌分離培養(yǎng)物結核分枝桿菌藥物敏感性試驗：臨床分離結核桿菌純培養(yǎng)物結核抗體的檢測：血清IFN-γ釋放試驗（T-SPOT.TB）：肝素鋰或肝素鈉抗凝血第14頁/共25頁5/9/202415結核分枝桿菌的核酸檢測教案標本留取標準1.痰標本：

（1）可疑肺結核患者：初診病人應收集3份標本（當日即時、夜間和次日晨痰），治療中或隨訪病人應按期留取2份痰標本（晨痰、夜間痰），體積3～5ml，盛于廣口和具有螺旋蓋子的痰瓶中。（2）即時痰采集后立即送檢，夜間痰和晨痰采集后常溫保存不應超過12小時，對當日不能進行涂片檢查的標本，須置于4℃冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。（3）對無法咳痰的患者：可使用高滲鹽水（3%NaCl）誘導痰或收集清晨胃液標本，或使用支氣管鏡采集支氣管灌洗液標本。第15頁/共25頁5/9/202416結核分枝桿菌的核酸檢測教案2．支氣管抽吸物、支氣管肺泡灌洗標本、肺穿刺物、肺活檢標本（1）對于不能留取痰標本的患者：推薦使用侵入性采集技術獲取標本，比如纖維支氣管鏡檢查、細針肺穿刺、肺活組織檢查。（2）嚴格器械清潔和消毒，避免引起交叉污染和感染。（3）支氣管鏡不能接觸自來水，通免污染環(huán)境分枝桿菌。

（4）對難以診斷的病例推薦使用其他侵入性技術采集標本，比如細針穿刺、開放肺活組織檢查，無菌條件下采集的經支氣管活檢和其他活檢標本，運輸過程中，應加入0.5～1ml無菌的生理鹽水。（5）支氣管分泌物至少2～5ml；支氣管肺泡灌洗液至少20-50ml。第16頁/共25頁5/9/202417結核分枝桿菌的核酸檢測教案3.胃灌洗液（1）嬰幼兒、兒童和遲鈍者診斷肺結核時，鑒于無法采集標本或支氣管灌洗液，推薦采集胃液標本，通過胃灌洗咽下去的痰液。（2）標本應在采集4小時內送到實驗室，否則應置于一次性內含100ml碳酸鈉酸他的無菌容器中。（3)胃灌洗液需連續(xù)采集3天，體積5～10ml，調節(jié)pH至中性。4.尿液（1）采集標本前，應清洗外生殖器，推薦連續(xù)采集3天清晨中段尿于無菌容器中，用于培養(yǎng)的尿液標本至少需要40ml（2）只有在不能獲得中段尿時，可以使用導尿術采集標本。（3）標本運送不及時，應冷藏保存。第17頁/共25頁5/9/202418結核分枝桿菌的核酸檢測教案5.無菌采集的體液（腦脊液、胸水、腹水、心包積液、關節(jié)液、骨髓）（1）臨床醫(yī)生采用抽吸技術或外科操作無菌收集體液標本于無菌容器。結核桿菌DNA及Xpert標本：為防止標本凝固，需加入EDTA抗凝處理（可注入于長紫管中顛倒混勻抗凝處理）。IFN-γ釋放試驗（T-SPOT.TB）標本：分離淋巴細胞需加入肝素抗凝，抗凝比例為100ml胸腹水加入0.8ml肝素，顛倒混勻。（2）標本盡可能快的運送到實驗室（3）應提交足夠量的樣本，腦脊液＞5ml，胸水和腹水5～10ml。第18頁/共25頁5/9/202419結核分枝桿菌的核酸檢測教案6．無菌采集的組織（淋巴結、皮膚和其他活檢標本）（1）采集標本盡可能無菌操作，放置到無固定劑或防腐劑的無菌容器中，不能浸泡在鹽水或其他液體或用紗布包裹，重量不少于1g。應迅速運送到實驗室，對于長時間的運輸，為防止脫水可加入無菌鹽水，保持溫度在4～15℃（2）針對皮膚潰瘍，宜從病變組織周邊采集活檢標本。（3）福爾馬林溶液浸泡過的標本不能用于培養(yǎng)檢查。（4）極少量的活檢標本可以浸泡在少量無菌鹽溶液中。第19頁/共25頁5/9/202420結核分枝桿菌的核酸檢測教案7.血液（1）如果血液標本接種培養(yǎng)基之前需要運輸，肝素成檸檬酸鹽可以用于抗凝。EDTA抗凝和凝固的血不能做培養(yǎng)。（2）血液和腦脊液標本培養(yǎng)推使且MYCO／FLYTIC瓶（BD）血培養(yǎng)瓶。（暫時不做）8.大便標本大便標本涂片的敏感性只有32％～34％，不能根據(jù)涂片的結果決定是否進行培養(yǎng)。第20頁/共25頁5/9/202421結核分枝桿菌的核酸檢測教案9、病理組織切片（核酸檢測）在一只干凈的離心管中加入6-12片5-10μm厚的FFPE，勿切白片。

病理組織切片已固定，結核分枝桿菌已無活性，無法做培養(yǎng)。第21頁/共25頁5/9/202422結核分枝桿菌的核酸檢測教案DNA擴增技術檢測有哪些不足相比DNA檢測技術，RNA檢測更適合判斷病原體轉錄活性，DNA檢測技術不能判斷病原體轉錄活性，不能區(qū)分潛伏感染和活動性感染（活動性感染：指示RNA轉錄活躍，潛伏感染：指示RNA不轉錄）交叉污染問題變溫檢測，對儀器要求高抑制反應（Taq酶）第22頁/共25頁5/9/202423結核分枝桿菌的核酸檢測教案免疫斑點干擾素釋放試驗結核菌感染的免疫應答反應主要是細胞介導免疫反應；T-SPOT.TB定量檢測人外周抗凝全血中受結核桿菌特異混合多肽抗原（ESAT-6和CFP-10）刺激分泌細胞因子干擾素的效應T淋巴細胞數(shù)量。結核特異性抗原ESAT-6和CFP-10由結核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白；所以的卡介苗菌株均丟失該基因序列絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū)第23頁/共25頁5/9/202424結核分枝桿菌的核酸檢