《非洲馬瘟診斷技術(shù)gbt+21675-2022》詳細解讀

《非洲馬瘟診斷技術(shù)gb/t21675-2022》詳細解讀contents目錄1范圍2規(guī)范性引用文件3術(shù)語和定義4縮略語5生物安全措施6臨床診斷contents目錄7樣品采集與處理8實驗室診斷9綜合判定附錄A(規(guī)范性)病毒分離相關(guān)溶液的配制附錄B(資料性)核酸檢測用引物、探針序列信息contents目錄附錄C(規(guī)范性)核酸檢測相關(guān)溶液的配制附錄D(規(guī)范性)酶聯(lián)免疫吸附試驗相關(guān)溶液的配制011范圍本標準規(guī)定了非洲馬瘟的診斷技術(shù)，適用于馬屬動物的非洲馬瘟診斷。適用于疑似感染非洲馬瘟病毒的馬屬動物的實驗室診斷。適用于對非洲馬瘟疫情的監(jiān)測和防控。1.1適用對象0102041.2診斷方法本標準包括了非洲馬瘟的病毒學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等多種方法。病毒學(xué)診斷主要通過病毒分離、鑒定和動物接種試驗等方法進行。血清學(xué)診斷主要通過檢測血清中的非洲馬瘟病毒特異性抗體進行。分子生物學(xué)診斷主要通過PCR等核酸擴增技術(shù)進行病毒核酸檢測。03本標準詳細規(guī)定了非洲馬瘟的診斷標準，包括疑似病例、確診病例和疫情判定的標準。疑似病例主要根據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)史進行判斷。確診病例需滿足實驗室檢測結(jié)果陽性，并結(jié)合臨床癥狀和流行病學(xué)史進行綜合判斷。疫情判定主要根據(jù)疫情發(fā)生地區(qū)、病例數(shù)量、傳播速度等因素進行綜合評估。010203041.3診斷標準022規(guī)范性引用文件0102文件范圍及目的引用本文件的目的是為了統(tǒng)一和規(guī)范非洲馬瘟的診斷方法，提高診斷的準確性和可靠性，為非洲馬瘟的防控提供技術(shù)支撐。本文件規(guī)定了非洲馬瘟診斷技術(shù)的術(shù)語和定義、診斷原則、診斷方法、判定規(guī)則和診斷試劑的制備及檢驗要求。GB/TXXXX-XXXX動物疫病診斷術(shù)語和定義01引用標準及文件GB/TXXXX-XXXX動物疫病診斷樣品采集、保存及運輸技術(shù)規(guī)范02GB/TXXXX-XXXX動物疫病實驗室檢驗通則03非洲馬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測方法（附錄A）04非洲馬瘟病毒抗體ELISA檢測方法（附錄B）05010203非洲馬瘟由非洲馬瘟病毒引起的馬屬動物的一種急性或亞急性蟲媒病毒病，以發(fā)熱、皮下水腫和病毒血癥為特征，嚴重時伴有組織和器官出血，馬屬動物中馬最易感，病死率可高達95%。實時熒光RT-PCR一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗，是一種常用的固相酶免疫測定方法。術(shù)語和定義033術(shù)語和定義非洲馬瘟是一種由非洲馬瘟病毒引起的馬屬動物的急性或亞急性蟲媒病毒病，主要通過庫蠓屬等吸血昆蟲叮咬傳播，臨床癥狀主要為發(fā)熱、皮下水腫和病毒血癥，嚴重時伴有組織和器官出血，馬屬動物中馬最易感，病死率可高達95%，騾驢次之。非洲馬瘟蟲媒病毒為一群節(jié)肢動物媒介病毒，分別歸類于披膜病毒科，黃病毒科，布尼亞病毒科和沙粒病毒科的病毒，歸類于披膜病毒科的主要有乙型腦炎病毒、登革病毒和森林腦炎病毒。蟲媒病毒實時熒光RT-PCR方法實時熒光RT-PCR方法是一種核酸檢測技術(shù)，它通過實時檢測PCR擴增過程中產(chǎn)生的熒光信號來定量或定性地檢測目標核酸。這種方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于病毒、細菌等病原體的檢測。血清學(xué)檢測方法是一類基于抗原抗體反應(yīng)的檢測方法，通過檢測血清中的特異性抗體來診斷疾病。常用的血清學(xué)檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、補體結(jié)合試驗（CF）等。這些方法在非洲馬瘟的診斷中也具有一定的應(yīng)用價值。血清學(xué)檢測方法044縮略語英文全稱Africanhorsesickness中文全稱非洲馬瘟解釋非洲馬瘟是一種由非洲馬瘟病毒引起的馬屬動物的急性或亞急性傳染病。4.1AHS英文全稱Africanhorsesicknessvirus中文全稱非洲馬瘟病毒解釋非洲馬瘟病毒是引起非洲馬瘟的病原體，屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬。4.2AHSV英文全稱GuoBiao/TuiJian中文全稱國家標準/推薦解釋GB/T是指推薦性國家標準，"T"在此讀"推"。推薦性國標是指生產(chǎn)、交換、使用等方面，通過經(jīng)濟手段或市場調(diào)節(jié)，而自愿采用的國家標準。4.3GB/T4.4診斷技術(shù)解釋診斷技術(shù)是指用于檢測和確認非洲馬瘟病例的各種方法和手段，包括臨床診斷、病理學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等。這些技術(shù)在《非洲馬瘟診斷技術(shù)GB/T21675-2022》標準中有詳細的規(guī)定和說明。055生物安全措施

5.1實驗室生物安全實驗室應(yīng)建立嚴格的生物安全管理制度，確保實驗人員遵守生物安全規(guī)定，防止非洲馬瘟病毒的傳播和擴散。實驗室應(yīng)配備符合生物安全要求的設(shè)施和設(shè)備，如生物安全柜、高壓滅菌器等，以確保實驗操作的安全性。實驗人員應(yīng)接受生物安全培訓(xùn)，了解非洲馬瘟病毒的危害和傳播途徑，掌握正確的實驗操作方法和個人防護措施。03樣本接收實驗室應(yīng)具備相應(yīng)的生物安全防護措施，確保樣本的安全處理和檢測。01樣本采集應(yīng)使用符合生物安全要求的采樣器具，避免交叉污染和病毒擴散。02樣本運輸應(yīng)使用符合生物安全要求的包裝和運輸方式，確保樣本在運輸過程中不發(fā)生泄漏和污染。5.2樣本采集與運輸安全相關(guān)部門應(yīng)建立非洲馬瘟疫情監(jiān)測體系，及時掌握疫情動態(tài)和流行趨勢。發(fā)現(xiàn)非洲馬瘟疑似病例時，應(yīng)按照法律法規(guī)的規(guī)定及時報告，并采取緊急控制和撲滅等強制性措施。疫情監(jiān)測和報告應(yīng)遵循保密原則，確保疫情信息不泄露，維護社會穩(wěn)定和公共衛(wèi)生安全。5.3疫情監(jiān)測與報告066臨床診斷年齡與性別不同年齡和性別的馬屬動物均可感染，但幼齡動物通常更易感。地區(qū)與季節(jié)非洲馬瘟主要在非洲大陸流行，但也可傳播到其他地區(qū)。本病一年四季均可發(fā)生，但通常在溫暖、潮濕的季節(jié)更為嚴重。馬屬動物非洲馬瘟主要感染馬、驢、騾等馬屬動物，其中馬最易感，騾、驢次之。6.1易感動物病馬出現(xiàn)高熱、呼吸困難、咳嗽、流泡沫樣鼻液等癥狀。嚴重病例可見前腿分開站立，頭頸伸直，鼻孔擴張，呼吸極度困難。肺型癥狀病初發(fā)熱，退熱前出現(xiàn)特征性水腫，常見于頭部、頸部和舌部。晚期可見結(jié)膜和舌腹側(cè)出血點，最終因心力衰竭而死亡。心型癥狀兼具肺型和心型的癥狀，病情更為嚴重，死亡率更高?；旌闲桶Y狀6.2臨床癥狀123主要病變在肺部，可見肺充血、水腫和出血。氣管和支氣管內(nèi)有大量黃色漿液和泡沫，肺門淋巴結(jié)腫大。肺型病理變化主要病變在心臟，可見心內(nèi)膜和心包膜有出血點和出血淤斑，心肌變性和壞死。水腫部位皮下組織膠樣浸潤。心型病理變化兼具肺型和心型的病理變化，病變更為廣泛和嚴重。混合型病理變化6.3病理變化根據(jù)臨床癥狀和病理變化可做出初步診斷，但確診需要進行實驗室檢測。實驗室檢測包括病毒分離、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測等方法，可檢測病毒抗原、抗體或核酸等指標。臨床判定應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化和實驗室檢測結(jié)果進行綜合分析和判斷。6.4臨床判定077樣品采集與處理疑似感染非洲馬瘟病毒的馬屬動物，在出現(xiàn)發(fā)熱、皮下水腫等臨床癥狀時采集樣品。采樣時間全血、血清、血漿、脾臟、淋巴結(jié)等組織樣品。采樣種類無菌操作采集血液樣品，組織樣品應(yīng)采集病變明顯的部位，避免污染。采樣方法樣品應(yīng)低溫保存并盡快送檢，運輸過程中應(yīng)避免反復(fù)凍融和污染。樣品保存與運輸7.1樣品采集血液樣品處理組織樣品處理核酸提取與檢測病毒分離與鑒定7.2樣品處理全血樣品經(jīng)離心分離血清或血漿，用于病毒分離、核酸檢測或抗體檢測。采用適宜的核酸提取方法提取樣品中的病毒RNA，進行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）等核酸檢測。組織樣品應(yīng)研磨成勻漿，經(jīng)離心處理取上清液，用于病毒分離、核酸檢測或病理學(xué)檢查。將處理后的樣品接種于易感細胞，觀察細胞病變效應(yīng)（CPE），并采用中和試驗等方法鑒定病毒。088實驗室診斷

8.1病原分離和鑒定采樣與處理從疑似感染非洲馬瘟的馬屬動物身上采集血液、脾臟、肺臟等組織樣本，進行無菌處理。病毒分離將處理后的樣本接種于易感細胞系，如馬胎腎細胞、馬肺細胞等，觀察細胞病變效應(yīng)（CPE），并通過傳代培養(yǎng)分離病毒。病毒鑒定采用電子顯微鏡觀察病毒粒子形態(tài)，結(jié)合血清學(xué)試驗和分子生物學(xué)方法進行病毒鑒定。利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)，將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過PCR擴增特定基因片段，從而檢測非洲馬瘟病毒。原理根據(jù)非洲馬瘟病毒基因組序列，設(shè)計特異性引物，用于擴增病毒核酸片段。引物設(shè)計提取樣本RNA，進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，觀察擴增結(jié)果并進行分析。操作步驟8.2RT-PCR方法原理使用通用型非洲馬瘟病毒核酸檢測試劑盒和實時熒光定量PCR儀。試劑與設(shè)備操作步驟按照試劑盒說明書進行操作，包括樣本處理、核酸提取、PCR擴增和結(jié)果分析等步驟。采用實時熒光定量PCR技術(shù)，通過特異性探針和熒光染料實時監(jiān)測PCR擴增過程，實現(xiàn)非洲馬瘟病毒的快速、靈敏檢測。8.3通用型Real-timeRT-PCR方法針對非洲馬瘟病毒不同血清型設(shè)計特異性引物和探針，通過實時熒光定量PCR技術(shù)實現(xiàn)型特異性檢測。原理適用于非洲馬瘟病毒不同血清型的鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查。應(yīng)用場景與通用型Real-timeRT-PCR方法類似，但需使用型特異性引物和探針。操作步驟8.4型特異性Real-timeRT-PCR方法123采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）技術(shù)，利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)檢測樣本中的非洲馬瘟病毒抗體。原理使用間接ELISA抗體檢測試劑盒和酶標儀等設(shè)備。試劑與設(shè)備按照試劑盒說明書進行操作，包括樣本處理、抗原包被、抗體孵育、酶標二抗孵育、底物顯色和結(jié)果判定等步驟。操作步驟8.5間接ELISA抗體檢測方法03操作步驟與間接ELISA方法類似，但需設(shè)置標準品對照和計算阻斷率等指標。01原理采用阻斷ELISA技術(shù)，通過比較樣本與標準品對特異性抗原的結(jié)合能力來檢測非洲馬瘟病毒抗體水平。02應(yīng)用場景適用于大規(guī)模血清學(xué)調(diào)查和疫苗免疫效果評估等領(lǐng)域。8.6阻斷ELISA抗體檢測方法099綜合判定123非洲馬瘟的判定應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化和實驗室檢測結(jié)果進行綜合分析。在疫情監(jiān)測和排查中，對符合非洲馬瘟特征的，應(yīng)判定為疑似病例。對疑似病例，必須按規(guī)定采集病料送指定實驗室進行病原學(xué)檢測，結(jié)果陽性的，可判定為確診病例。9.1判定原則符合非洲馬瘟流行病學(xué)特點，具有典型臨床癥狀和病理變化的馬屬動物。疑似病例經(jīng)實驗室病原學(xué)檢測，結(jié)果為陽性者。疑似病例確診病例9.2判定標準發(fā)現(xiàn)疑似病例后，應(yīng)立即向當?shù)匦竽莲F醫(yī)主管部門報告，并按照相關(guān)規(guī)定采取隔離、消毒等控制措施。當?shù)匦竽莲F醫(yī)主管部門接到報告后，應(yīng)迅速組織專家進行現(xiàn)場診斷和流行病學(xué)調(diào)查，并采集病料送指定實驗室進行病原學(xué)檢測。根據(jù)實驗室檢測結(jié)果和現(xiàn)場診斷情況，綜合判定是否為非洲馬瘟疫情，并按照相關(guān)規(guī)定采取相應(yīng)措施。9.3判定流程10附錄A(規(guī)范性)病毒分離相關(guān)溶液的配制試劑和溶劑選擇選擇高純度的化學(xué)試劑和符合要求的溶劑，以確保溶液的質(zhì)量和穩(wěn)定性。配制器具準備準備干凈的玻璃器皿、量筒、移液管等配制工具，并進行適當?shù)念A(yù)處理和滅菌。實驗室環(huán)境和設(shè)備要求確保實驗室具備適當?shù)纳锇踩墑e，使用經(jīng)過認證的潔凈工作臺和滅菌設(shè)備。溶液配制的準備工作按照一定比例將化學(xué)試劑A和溶劑混合，加熱攪拌至完全溶解，過濾除菌后備用。溶液A的配制溶液B的配制溶液C的配制將化學(xué)試劑B加入適量的溶劑中，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值至所需范圍，過濾除菌。將化學(xué)試劑C和D按一定比例混合，加入適量的溶劑中，加熱攪拌至完全溶解，過濾除菌。030201病毒分離相關(guān)溶液的配制步驟對配制好的溶液進行質(zhì)量檢測，包括濃度、pH值、無菌性等指標。溶液質(zhì)量檢查將檢測合格的溶液分裝至適當?shù)娜萜髦?，標明名稱、濃度、配制日期等信息，并儲存于符合要求的溫度和環(huán)境條件下。溶液儲存條件根據(jù)溶液的性質(zhì)和儲存條件確定溶液的有效期，并在使用前檢查溶液的外觀和性狀，如有異常應(yīng)停止使用。同時，使用時應(yīng)遵循實驗室安全規(guī)范和操作規(guī)程。溶液有效期和使用注意事項溶液配制后的處理和儲存11附錄B(資料性)核酸檢測用引物、探針序列信息03引物使用方法詳細說明引物的使用濃度、反應(yīng)條件等，確保實驗操作的規(guī)范性和一致性。01引物設(shè)計原則根據(jù)非洲馬瘟病毒的基因組特點，設(shè)計特異性引物，確保核酸檢測的準確性和靈敏度。02引物種類與序列提供多種引物序列，包括正向引物和反向引物，用于擴增病毒核酸片段。引物序列根據(jù)非洲馬瘟病毒的特異性序列，設(shè)計探針，確保與病毒核酸的特異性結(jié)合。探針設(shè)計原則提供多種探針序列，包括熒光探針、淬滅探針等，用于實時熒光定量PCR等檢測方法。探針種類與序列詳細說明探針的標記方法、使用濃度、反應(yīng)條件等，確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。探針使用方法探針序列12附錄C(規(guī)范性)核酸檢測相關(guān)溶液的配制實驗室環(huán)境和設(shè)備要求確保實驗室環(huán)境干凈、整潔，使用符合標準的生物安全柜和移液器等設(shè)備。試劑和耗材準備準備所需試劑，如核酸提取試劑、PCR擴增試劑等，以及相應(yīng)的耗材，如離心管、吸頭等。溶液配制的準備工作按照一定比例混合裂解液成分，確保充分溶解，用于裂解病毒顆粒并釋放核酸。裂解液的配制配制適當濃度的洗滌液，用于洗滌核酸提取過程中的雜質(zhì)和抑制劑。洗滌液的配制核酸提取溶液的配制PCR擴增溶液的配制引物和探針的稀釋將引物和探針稀釋至適當濃度，以便在PCR擴增過程中使用。PCR反應(yīng)液的配制按照一定比例