SNT 5364.2-2021 出口食品中致病菌檢測(cè)方法 微滴式數(shù)字PCR法 第2部分：霍亂弧菌-PDF解密

ICS07.100.30CCSX04中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T5364.2—2021出口食品中致病菌檢測(cè)方法微滴式數(shù)字PCR法第2部分:霍亂弧菌DropletdigitalPCRmethodfordetectionofpathogensinexportfood—Part2:Vibriocholerae2021-11-22發(fā)布2022-06-01實(shí)施中華人民共和國(guó)海關(guān)總署發(fā)布ⅠSN/T5364.2—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。SN/T5364—2021《出口食品中致病菌檢測(cè)方法微滴式數(shù)字PCR法》共分為8個(gè)部分:第1部分:副溶血性弧菌第2部分:霍亂弧菌第3部分:溶藻弧菌第4部分:創(chuàng)傷弧菌第5部分:金黃色葡萄球菌第6部分:單核細(xì)胞增生李斯特氏菌第7部分:產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌第8部分:克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)本文件為SN/T5364—2021的第2部分。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國(guó)海關(guān)總署提出并歸口。本文件起草單位:中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心、中華人民共和國(guó)天津海關(guān)、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院。1SN/T5364.2—2021出口食品中致病菌檢測(cè)方法微滴式數(shù)字PCR法第2部分:霍亂弧菌1范圍本文件規(guī)定了食品中總霍亂弧菌和含毒力基因霍亂弧菌的微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法。本文件適用于食品中總霍亂弧菌和含毒力基因霍亂弧菌的快速定性檢測(cè)。本文件的檢出限為1CFU/25g~5CFU/25g(或1CFU/25mL~5CFU/25mL)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403—2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)SN/T1022進(jìn)出口食品中霍亂弧菌檢驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DNA(deoxyribonuleicacid):脫氧核糖核酸。ddPCR(dropletdigitalpolymerasechainreaction):微滴式數(shù)字PCR。gbpA(GlcNAc-bindingproteingene):N-乙酰葡糖胺結(jié)合蛋白A的編碼基因。PCR(polymerasechainreaction):聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。tcpA(toxincoregulatedpilingene):毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛編碼基因。5方法原理分別針對(duì)霍亂弧菌種屬特異性gbpA基因及毒力基因tcpA設(shè)計(jì)引物/探針,將一定濃度的引物、探針與模板DNA及數(shù)字PCR反應(yīng)預(yù)混液混合,配成雙重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)體系。將該雙重?cái)?shù)字PCR體系分布到10000~20000個(gè)微滴中,使大部分微滴中模板DNA分子的數(shù)量為1或0,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。gbpA基因及tcpA基因探針5’端分別標(biāo)記FAM和VIC熒光基團(tuán),利用數(shù)字PCR系統(tǒng)的雙通道檢測(cè),可同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因的熒光信號(hào)進(jìn)行采集分析。根據(jù)gbpA基因及tcpA基因所對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性微滴2SN/T5364.2—2021的有無(wú)判定樣品中是否含有霍亂弧菌和含毒力基因的霍亂弧菌。6主要設(shè)備及耗材6.1天平:感量0.1g。6.2均質(zhì)器。6.3恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。6.4高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(離心力12000g)。6.5渦旋振蕩儀。6.6核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。6.7生物安全柜。6.8ddPCR擴(kuò)增儀及相關(guān)配套設(shè)備。6.9不同量程移液器:100μL~1000μL、20μL~200μL、10μL~100μL、0.5μL~10μL。6.10離心管:2mL、1.5mL和0.2mL。7材料與試劑7.1僅使用分析純?cè)噭┖头螱B/T6682規(guī)定的一級(jí)水。7.2細(xì)菌基因組提取試劑盒。7.3ddPCR反應(yīng)配套試劑。7.4去游離核酸酶:伯樂(lè)1)。7.5陽(yáng)性對(duì)照:霍亂弧菌參照菌株DNA,或含目的片段的DNA亦可。7.6霍亂弧菌N-乙酰葡糖胺結(jié)合蛋白A的編碼基因(gbpA)序列片段參見(jiàn)附錄A.1,引物探針如下:gbpA-F:5’-CAAACCAAACTGGAACCCAAA-3’;gbpA-R:5’-TCAACGACACAGAACGGATTG-3’;gbpA-P:5’-FAM-CCATTGTCGCGTGATGCATTTGACC-BHQ1-3’。7.7霍亂弧菌毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛編碼基因(tcpA)序列片段參見(jiàn)附錄A.2,引物探針如下:tcpA-F:5’-GGGATATGTTTCCATTTATCAACGT-3’;tcpA-R:5’-GCGACACTCGTTTCGAAATCA-3’;tcpA-P:5’-FAM-TGCTTTCGCTGCTGTCGCTGATCTT-BHQ1-3’。8檢測(cè)程序食品中霍亂弧菌ddPCR檢測(cè)程序見(jiàn)圖1。1)給出這一信息是為了方便本文件使用者,并不表示只認(rèn)可該產(chǎn)品。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果,則可使用等效產(chǎn)品。3SN/T5364.2—2021圖1食品中霍亂弧菌ddPCR檢測(cè)程序9實(shí)驗(yàn)操作步驟9.1樣品制備參照SN/T1022中方法進(jìn)行樣品制備和第一次選擇性增菌。9.2DNA提取直接取9.1獲得的增菌液2mL加到無(wú)菌離心管中,8000g離心2min,盡量吸棄上清;利用100μL磷酸鹽緩沖液重懸沉淀,加入20μL去游離核酸酶,置于37℃作用15min~30min,95℃加熱10min使酶失活。繼而利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA,操作方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。9.3DNA濃度和純度測(cè)定取適量DNA原液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后,使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm處的吸收值,按照式(1)計(jì)算DNA的濃度。式中:ρ=A260×N×50…………(1)ρ—DNA濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);A260—260nm處的吸光值;N—核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng)DNA濃度為0.1μg/mL~100μg/mL,A260/A280在1.8~2.0之間時(shí),適用ddPCR檢測(cè)。4SN/T5364.2—20219.4ddPCR檢測(cè)9.4.1對(duì)照和平行檢測(cè)過(guò)程中分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。以霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA或含目的片段的DNA作為陽(yáng)性對(duì)照,利用細(xì)菌基因組提取試劑盒按步驟9.2提取的大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA作為陰性對(duì)照,用等體積的雙蒸水代替DNA模板作為空白對(duì)照。每個(gè)待檢樣品提取的DNA溶液進(jìn)行3個(gè)平行ddPCR檢測(cè)。9.4.2反應(yīng)體系按照表1配制反應(yīng)體系。表1ddPCR反應(yīng)體系試劑名稱儲(chǔ)備液濃度終濃度體積數(shù)字PCR反應(yīng)預(yù)混液2×1×10μLgbpA-F10μmol/L0.75μmol/L1.5μLgbpA-R10μmol/L0.75μmol/L1.5μLgbpA-P10μmol/L0.25μmol/L0.5μLtcpA-F10μmol/L0.75μmol/L1.5μLtcpA-R10μmol/L0.75μmol/L1.5μLtcpA-P10μmol/L0.25μmol/L0.5μLDNA模板— 3μL體系總體積— 20μL9.4.3微滴生成將配制好的數(shù)字PCR反應(yīng)混合液,加入微滴生成裝置加樣孔中,按儀器操作說(shuō)明生成微滴。9.4.4ddPCR擴(kuò)增將生成的微滴緩慢轉(zhuǎn)移至96孔板中,封膜后置于PCR儀上,按以下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增:95℃10min(升降溫速度:1℃/s);94℃30s(升降溫速度:1℃/s),60℃1min(升降溫速度:1℃/s),45個(gè)循環(huán);98℃10min(升降溫速度:1℃/s),4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。注:PCR反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因擴(kuò)增儀型號(hào)的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。9.4.5熒光信號(hào)讀取擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,將96孔板放入ddPCR檢測(cè)儀中對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行熒光檢測(cè),采用FAM和VIC通道分別讀取gbpA基因及tcpA基因擴(kuò)增的熒光信號(hào)。10結(jié)果分析與表述10.1閾值的設(shè)定根據(jù)空白對(duì)照的終點(diǎn)熒光值設(shè)定閾值限,閾值限應(yīng)對(duì)空白和陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行明確的區(qū)分。5SN/T5364.2—202110.2質(zhì)量控制10.2.1體系分隔產(chǎn)生的有效微滴的總數(shù)量滿足所用ddPCR儀器型號(hào)要求。10.2.2陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)熒光信號(hào)檢出。10.2.3陽(yáng)性對(duì)照有熒光信號(hào)檢出且陰性微滴簇與陽(yáng)性微滴簇能夠截然分開(kāi)。10.2.4以上質(zhì)控條件有一項(xiàng)不符合者,實(shí)驗(yàn)結(jié)果視為無(wú)效,查找原因后再次進(jìn)行ddPCR檢測(cè)。10.3結(jié)果表述10.3.1待檢樣品所有微滴gbpA基因及tcpA基因?qū)?yīng)的熒光信號(hào)均低于閾值限,待測(cè)樣品中不含有霍亂弧菌,檢測(cè)結(jié)果表述為“未檢出霍亂弧菌”。10.3.2待檢樣品3個(gè)平行中至少1個(gè)平行g(shù)bpA基因有熒光信號(hào)高于閾值限的陽(yáng)性微滴,且陰性微滴簇與陽(yáng)性微滴簇能夠截然分開(kāi),該樣品結(jié)果為霍亂弧菌初篩陽(yáng)性,對(duì)樣品的增菌液進(jìn)一步按SN/T1022中的操作步驟進(jìn)行確認(rèn)后報(bào)告結(jié)果。10.3.3滿足8.3.2的情況下,若tcpA基因同時(shí)出現(xiàn)熒光信號(hào)高于閾值限的陽(yáng)性微滴,則該樣品結(jié)果為含有毒力基因的霍亂弧菌初篩陽(yáng)性,對(duì)樣品的增菌液進(jìn)一步按SN/T1022中的操作步驟進(jìn)行確認(rèn)后報(bào)告結(jié)果。11防污染措施檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。6SN/T5364.2—2021附錄A(資料性)霍亂弧菌特異性基因序列片段A.1霍亂弧菌gbpA基因序列(部分)及