SN∕T 3507-2013 進(jìn)出口紡織品中山羊絨和綿羊毛的鑒別 PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR法-PDF解密-PDF解密

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T3507—2013進(jìn)出口紡織品中山羊絨和綿羊毛的鑒別PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR法Identificati0n0fcashmereandw00lintextilesf0rimp0rtandexp0rt—PCRmeth0dandreal-timeflu0rescencePCRmeth0d2013-03-01發(fā)布2013-09-16實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局ISN/T3507—2013本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)福建出入境檢驗(yàn)檢疫局。1SN/T3507—2013進(jìn)出口紡織品中山羊絨和綿羊毛的鑒別PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了紡織品中山羊絨、綿羊毛鑒別的PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于紡織品中山羊絨、綿羊毛PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR法的定性鑒別。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction；PCR一種模擬天然DNA復(fù)制的體外擴(kuò)增法，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，以4種單核苷酸（dNTP）為底物，通過(guò)變性—退火—延伸的循環(huán)反應(yīng)，使極少量的DNA的特定片段，在短短幾小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增上百萬(wàn)倍。3.2實(shí)時(shí)熒光PCRreal-timefluorescencePCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量或定性分析的方法。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。Ct值:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（cyclethre松hold）DNA:脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）DTT:二硫疏糖醇。5原理用試劑盒法提取樣品DNA。針對(duì)山羊、綿羊的線粒體DNA序列設(shè)計(jì)引物和探針，通過(guò)單一PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，對(duì)DNA中的山羊成分、綿羊成分分別進(jìn)行特異性擴(kuò)增，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判定該樣品中是否含有山羊絨、綿羊毛。2SN/T3507—20136試劑6.1實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。6.2組織和毛發(fā)提取試劑盒（與DNAIQTM系統(tǒng)結(jié)合使用）:參見(jiàn)附錄A中A.1。1）6.32XTaqPCRMasterMix:0.1U/μLTaqDNA聚合酶，500μmol/LdNTP，20mmol/LTris-HCl（PH8.3100mmol/LKCl，3mmol/LMgCl2，其他穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑，—20節(jié)保存。6.4premi工E工TaqTM（PerfectRealTime2X）:見(jiàn)A.2。6.595%或100%乙醇。6.6瓊脂糖。6.7溴化乙錠。6.8DNAmarker。6.9TE溶液（PH8.0）。6.105XTBE緩沖液。7儀器與設(shè)備7.1冰箱:4節(jié)~—20節(jié)。7.2天平:感量0.001g。7.3分析研磨機(jī)。7.4剪刀。7.5微孔干浴器或水浴鍋。7.6瞬時(shí)離心機(jī)。7.7渦旋儀。7.81.5mL磁分離架。7.9微量可調(diào)移液器及槍頭:10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。7.101.5mL離心管。7.11PCR薄壁管。7.12實(shí)時(shí)熒光PCR光學(xué)反應(yīng)管。7.13超凈工作臺(tái)。7.14PCR儀。7.15實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。7.16電泳裝置。7.17凝膠成像儀。8取樣紗線:從不同的管紗、筒紗或絞紗上隨機(jī)取樣，共取約1g的紗樣?？椢?從不同位置剪取，共取約1g的織物。1）給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。3SN/T3507—20139制樣用剪刀將樣品剪碎，經(jīng)分析研磨機(jī)打散、混勻，再用剪刀盡量剪碎至纖維長(zhǎng)度2mm~3mm，再次用分析研磨機(jī)混勻。10DNA的提取10.1稱取約5mg試樣，放入1.5mL離心管中，每個(gè)樣平行提取2管，加100μLDTT（1mol/L）和75μL蛋白酶K儲(chǔ)存液，混勻，56節(jié)溫浴過(guò)夜。10.2加350μL裂解液，上下顛倒混勻，瞬時(shí)離心，將上清液移至新的1.5mL離心管中。10.3加7μL完全懸浮的DNAIQTM樹(shù)脂，高速渦旋振蕩3s，室溫放置10min。10.4將離心管高速渦旋振蕩2s，將離心管置于磁分離架上。10.5待磁珠完全吸附至管壁后，小心吸去溶液，加入100μL裂解緩沖液，高速渦旋振蕩2s，將離心管置于磁分離架上。10.6吸去裂解液，加入100μL1X洗滌液，高速渦旋振蕩2s，將離心管置于磁分離架上，加100μL洗液重復(fù)洗滌3次，盡可能吸盡最后一次的洗滌液。10.7打開(kāi)蓋子，風(fēng)干5min。10.8加入70μL洗脫液，高速渦旋振蕩2s，65節(jié)溫浴5min。10.9取出離心管，高速渦旋振蕩2s，置于磁分離架上，小心吸取溶液（即DNA溶液）于新的1.5mL離心管中，—20節(jié)保存?zhèn)溆谩?1DNA的鑒別11.1質(zhì)量控制進(jìn)行PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照：擴(kuò)增山羊成分時(shí)用山羊絨DNA，擴(kuò)增綿羊成分時(shí)用綿羊毛DNA。陰性對(duì)照：擴(kuò)增山羊成分時(shí)用非山羊絨DNA，擴(kuò)增綿羊成分時(shí)用非綿羊毛DNA?？瞻讓?duì)照：實(shí)驗(yàn)用水。11.2PCR法所用引物信息見(jiàn)表1，用TE溶液（PH8.0）稀釋至10μmol/L，—20節(jié)保存?zhèn)溆?。?PCR擴(kuò)增所用引物擴(kuò)增成分引物名稱引物序列退火溫度節(jié)產(chǎn)物大小內(nèi)參基因Cyt-FCyt-R5，-GCG/ATACGCAATCTTACGATCAA-3，5，-CTGG/TCCTCCAATTCATGTGAG-3，54195山羊12SG-F12SG-R5，-CGCCCTCCAAATCAATAA-3，5，-CTATAGTGTATCAGCTGCA-3，543304SN/T3507—2013擴(kuò)增成分引物名稱引物序列退火溫度節(jié)產(chǎn)物大小綿羊12SS-F12SS-R5,-ATATCAACCACACGAGAGGAGAC-3,5,-TTTAAACTGGAGAGTGGGAGA-3,5217411.2.2PCR反應(yīng)體系2XTaqPCRMa松terMix12.5μL，10μmol/L引物各0.5μL，DNA模板5μL，ddH2O6.5μL。11.2.3PCR反應(yīng)條件注：不同儀器可根據(jù)儀器要求將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。11.2.4PCR產(chǎn)物的檢測(cè)將適量5XTBE稀釋成0.5XTBE溶液，配制2.0%瓊脂糖凝膠。取15μLPCR產(chǎn)物，點(diǎn)樣進(jìn)行電泳，并加DNAmarker點(diǎn)樣以判斷PCR產(chǎn)物的片段大小。電壓大小根據(jù)電泳槽長(zhǎng)度來(lái)確定，一般控制在3V/cm~5V/cm長(zhǎng)度，電泳時(shí)間根據(jù)溴酚藍(lán)的移動(dòng)位置來(lái)確定。電泳結(jié)束后，將凝膠置溴化乙錠溶液（10μg/μL）中浸泡30min。用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照、記錄與分析電泳結(jié)果。11.2.5PCR結(jié)果及判斷陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)條帶；待測(cè)樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，判斷結(jié)果為陰性。待測(cè)樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，判斷結(jié)果為可疑陽(yáng)性，需進(jìn)一步確證。11.2.6結(jié)果確證實(shí)驗(yàn)可疑陽(yáng)性結(jié)果的，可委托有資質(zhì)的生物技術(shù)公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，所獲得的序列與附錄B中的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，同源率達(dá)100%，可確證為陽(yáng)性結(jié)果，或采用實(shí)時(shí)熒光PCR法進(jìn)行確證。11.3實(shí)時(shí)熒光PCR法11.3.1引物及探針?biāo)玫囊?、探針?jiàn)表2，用TE溶液（pH8.0）稀釋至10μmol/L，—20節(jié)保存?zhèn)溆?。?實(shí)時(shí)熒光PCR所用引物、探針擴(kuò)增成分引物名稱引物序列退火溫度節(jié)產(chǎn)物大小內(nèi)參基因12S-F12S-R12S-P5,-AAAGGACTTGGCGGTGCTT-3,5,-GGGTTTGCTGAAGATGGCG-3,5,-FAM-TAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCG-TAMARA-3,601715SN/T3507—2013擴(kuò)增成分引物名稱引物序列退火溫度節(jié)產(chǎn)物大小山羊12SG-F12SG-R12SG-P5,-CGCCCTCCAAATCAATAA-3,5,-CTATAGTGTATCAGCTGCA-3,5,-FAM-ACGTGTTAAAGCACTACATC-TAMARA-3,54330綿羊12SS-F12SS-R12SS-P5,-ATATCAACCACACGAGAGGAGAC-3,5,-TTTAAACTGGAGAGTGGGAGA-3,5,-FAM-AAACCAAGATATAGCTTAATT-TAMARA-3,5217411.3.2PCR反應(yīng)體系premi工E工TaqTM（PerfectRealTime2X）12.5μL，10μmol/L引物、探針各0.75μL，ROXReferenceDyeⅡ（50X）0.5μL，DNA模板5μL，ddH2O4.75μL。注：ROXReferenceDyeⅡ（50X）適用于ABI7500、7500Fast實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)，其他型號(hào)的熒光PCR儀請(qǐng)參照說(shuō)明書(shū)操作。11.3.3PCR反應(yīng)條件95節(jié)，30s；95節(jié)，5s，退火溫度（表235注：不同儀器可根據(jù)儀器要求和premi工E工TaqTM（PerfectRealTime）使用說(shuō)明書(shū)將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。11.3.4結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)設(shè)置無(wú)效基線范圍?；€范圍選擇在3~15個(gè)循環(huán)，如果有強(qiáng)陽(yáng)性樣本，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整基線范圍。閾值設(shè)置原則以基線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且Ct值—40為準(zhǔn)。設(shè)置閾值后，分析樣品的檢測(cè)結(jié)果。11.3.5結(jié)果判斷待測(cè)樣品山羊成分、綿羊成分檢測(cè)Ct值大于或等于40，內(nèi)參照基因檢測(cè)Ct值在20~30之間者，陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果正常者，則可判定該樣品未檢出山羊成分、綿羊成分。待測(cè)樣品山羊成分、綿羊成分檢測(cè)Ct值小于或等于36，內(nèi)參照基因檢測(cè)Ct值在20~30之間者，陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果正常者，則可判定該樣品檢出山羊成分、綿羊成分。待測(cè)樣品山羊成分、綿羊成分檢測(cè)Ct值在36~40之間，應(yīng)重做實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct值仍小于40者，且陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果正常，則可判定該樣品檢出山羊成分、綿羊成分；再次擴(kuò)增后結(jié)果Ct值大于40，且陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果正常，可判定該樣品未檢出山羊成分、綿羊成分。6SN/T3507—201311.4結(jié)果表述11.4.1未檢出山羊絨、綿羊毛。11.4.2檢出山羊絨、綿羊毛。12防止污染的措施檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施參照GB/T19495.2。7SN/T3507—2013附錄A（資料性附錄）試劑盒及試劑A.1組織和毛發(fā)提取試劑盒（與DNAIQTM系統(tǒng)結(jié)合使用推薦使用promega公司產(chǎn)品）50mL蛋白酶K（proteinaseK）100mg二硫疏糖醇（DTT）5.0g2X洗滌緩沖液（washbuffer）30mL40mL15mL0.9mLA.1.2試劑配制A.1.2.1蛋白酶K儲(chǔ)存液向凍干的蛋白酶K瓶中加入5.5mL溫育緩沖液，輕搖使之完全溶解。此蛋白酶K儲(chǔ)存液的終濃度為18mg/mL。將蛋白酶K儲(chǔ)存液分裝成小包裝，可在—20節(jié)保存至1年，反復(fù)凍融不要超過(guò)5次。使用前將蛋白酶K放置在冰上融化及保存。A.1.2.21mol/LDTT將5gDTT溶于無(wú)核酸酶的水中至終體積為32.4mL，則DTT的終濃度為1mol/L，分裝成小包裝使用并保存在—20節(jié)。A.1.2.31x洗滌緩沖液向2X洗滌緩沖液中加入15mL95%~100%的乙醇和15mL異丙醇，混勻，室溫保存。A.1.2.4裂解液確定所需的裂解液的總量，每100μL裂解緩沖液中加入1μL1mol/LDTT，顛倒幾次混勻，室溫保存一個(gè)月。A.2premixExTaqTM（perfectRealTime2x）試劑盒組成premi工E工TaqTM（perfectRealTime2X）1.0mLX5支ROXReferenceDye（50X）200μLX1支8SN/T3507—2013ROXReferenceDyeⅡ（50X）200μLX1支A.30.5mol/LEDTA（PH8.0）在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na.2H2O劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的PH值至8.0，然后定容至1L，分裝后高壓滅菌。A.45xTBE緩沖