氧化苦參堿減輕大鼠肝纖維化的機(jī)制研究

氧化苦參堿減輕大鼠肝纖維化的機(jī)制研究

[摘要]目的探討氧化苦參堿（oxymatrine，OM）減輕四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化（hepaticfibrosis，HF）的機(jī)制。方法建立四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠HF模型，制備氧化苦參堿脂質(zhì)體（Oxymatrineliposomes，OM-liposome）、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arginine-Glycin-Asparticacid，RGD）三肽序列偶聯(lián)的OM及異硫氰酸熒光素（fluorescentisothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的OM-liposome和RGD-OM-liposome。分離HF大鼠的肝臟星狀細(xì)胞（hepaticstellatecells，HSCs）并體外培養(yǎng)：①將OM-liposome、RGD-OM-liposome和RGD偶聯(lián)的空白脂質(zhì)體（RGD-liposome）作用于HSCs，利用透射電鏡檢測(cè)HSCs的細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)（凋亡小體）變化，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HSCs的細(xì)胞周期，利用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)HSCs的細(xì)胞活性。②將FITC-OM-liposome和FITC-RGD-OM-liposome作用于HSCs，利用熒光顯微鏡技術(shù)比較兩種劑型OM在HSCs中的分布。結(jié)果①與RGD-liposome比較，OM-liposome可促進(jìn)HSCs凋亡小體形成，增加HSCs凋亡，降低HSCs的細(xì)胞活性；與OM-liposome比較，RGD-OM-liposome可進(jìn)一步增加HSCs內(nèi)凋亡小體，促進(jìn)HSCs凋亡，降低HSCs活性。②RGD可促進(jìn)OM-liposome在HSCs內(nèi)的分布。結(jié)論OM-liposome可在體外誘導(dǎo)HSCs凋亡，RGD可促進(jìn)OM-liposome在HSCs的分布，進(jìn)一步促進(jìn)HSCs的凋亡。誘導(dǎo)HSCs凋亡可能是OM減輕肝纖維化的重要機(jī)制。[關(guān)鍵詞]氧化苦參堿；脂質(zhì)體；精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸；肝纖維化；肝星狀細(xì)胞氧化苦參堿（oxymatrine，OM）是從傳統(tǒng)中藥豆根槐屬植物苦參或豆科植物苦豆子、山根豆中提取的主要活性成分，是一種四環(huán)喹嗪啶類生物堿。近年來研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿對(duì)乙型肝炎、丙型肝炎、肝纖維化（hepaticfibrosis，HF）及肝癌都具有較好的療效[1]，作用機(jī)制目前尚不清楚。各種慢性肝損傷均可發(fā)展至HF，目前認(rèn)為HF是對(duì)創(chuàng)傷的一個(gè)修復(fù)過程，在此損傷修復(fù)的反應(yīng)中，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）、肝星狀細(xì)胞（hepaticstellatecells，HSCs）和細(xì)胞因子共同參與發(fā)揮了纖維化的作用[2]。越來越多的研究證實(shí)，HSCs的活化、增殖在HF的形成和發(fā)展過程中起著重要作用，抑制HSCs的活化及誘導(dǎo)HSCs的凋亡對(duì)有效控制肝纖維化起到至關(guān)重要的作用。研究證實(shí)，OM對(duì)其他器官組織損傷、纖維化[3]及腫瘤都有一定的治療效果，其中，OM抑制細(xì)胞凋亡是其減輕胰腺癌的重要機(jī)制[4]。因此，筆者猜測(cè)OM抑制HSCs活化、誘導(dǎo)HSCs凋亡可能是其治療HF的重要機(jī)制，現(xiàn)將研究報(bào)道如下：1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量約200g（第四軍醫(yī)大學(xué)），大豆卵磷脂（天津遠(yuǎn)航化學(xué)品有限公司），膽固醇（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司），甲醇（西安化學(xué)試劑廠），氯仿（西安化學(xué)試劑廠），98.9%氧化苦參堿（西安大河藥業(yè)有限責(zé)任公司），異硫氰酸熒光素（FITC，陜西博微生物試劑公司），精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列（陜西博微生物試劑公司），碘化丙啶（PI，陜西博微生物試劑公司），膠原酶Ⅳ（美國(guó)Sigma公司），密度梯度離心介質(zhì)Nycodenz（美國(guó)Sigma公司），DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司），小牛血清（美國(guó)Gibco公司），胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）。1.2方法1.2.1制備氧化苦參堿脂質(zhì)體（逆相蒸發(fā)法）將大豆卵磷脂5.0g、膽固醇2.5g，溶于50mL氯仿-甲醇混合液中，70℃水浴揮干溶劑，加入油酸0.5g，聚山梨酯2.5g，攪拌融化。另將氧化苦參堿1.5g、聚乙烯吡咯烷酮2.5g溶于pH7.4磷酸緩沖液中，水浴加熱至70℃。將兩者混合，恒溫?cái)嚢?，灌裝，密封，超聲乳化，所得乳劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸除有機(jī)溶劑，然后再進(jìn)行短時(shí)超聲，即得乳白色氧化苦參堿脂質(zhì)體（Oxymatrineliposomes，OM-liposome）。1.2.2制備精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸偶聯(lián)的氧化苦參堿脂質(zhì)體按10∶1摩爾比加入RGD，室溫震蕩過夜，得到RGD修飾的氧化苦參堿脂質(zhì)體（RGD-OM-liposome），冰浴下旋渦震蕩30min，通過凝膠柱（CL-4B），層析法除去未偶連的脂質(zhì)體。1.2.3制備RGD偶聯(lián)的脂質(zhì)體按照“1.2.1”中的方法制備脂質(zhì)體（不加入氧化苦參堿），隨后按照“1.2.2”中方法將RGD與脂質(zhì)體偶聯(lián)。[]1.2.4異硫氰酸熒光素標(biāo)記藥物用分析天平準(zhǔn)確稱取所需的FITC，按100∶1比例緩慢加入于RGD-OM-liposome及OM-liposome中，不停地?cái)嚢?～10min，避免將熒光素黏于三角燒瓶壁或攪拌玻璃棒上，然后繼續(xù)攪拌12～18h后，溶液以2500r/min離心20min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中再置于燒杯中，于4℃冰箱中過夜，得到FITC-RGD-OM-liposome及FITC-OM-liposome。1.2.5動(dòng)物模型的制備和肝星狀細(xì)胞的分離、培養(yǎng)[5]雄性SD大鼠，體重約200g，食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲自來水。四氯化碳肝纖維化模型制備：8周末，腹腔麻醉大鼠，皮膚消毒后切開，充分暴露肝臟，門靜脈插管，同時(shí)剪開下腔靜脈，用含肝素12500U的D-Hank's液灌注，待肝臟變?yōu)辄S白色時(shí)，灌以0.05%Ⅳ型膠原酶消化，約40min肝組織完全軟化后，停止灌注，離體肝臟并剪碎，以尼龍網(wǎng)過濾，D-Hank's液沖洗，將濾過的細(xì)胞懸液移入50mL離心管，吸管吹打，離心（450g，5min），棄上清，以D-Hank's液重懸，混以Nycodenz液，吸管吹打，轉(zhuǎn)至離心管，并覆以D-Hank's液離心（1450g，16min），取界面細(xì)胞，用DMEM重懸，再離心（500g，7min），棄上清，收集細(xì)胞。將剛分離的重懸細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，在5%CO2，37℃，95%潮濕空氣的CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48h后，換10%小牛血清，3d后首次換液，以后視情況每2～3天換液1次。胞密度為5×l05/mL，待貼壁后，以0.25%FBS-DMEM培養(yǎng)，95%潮濕空氣的CO2培養(yǎng)箱里過夜，實(shí)驗(yàn)前棄去原培養(yǎng)液，熒光顯微鏡觀察藥物在HSCs內(nèi)的分布。1.2.7細(xì)胞活性檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)消化后，反復(fù)吹打使其成為細(xì)胞懸液，稀釋到細(xì)胞濃度為106/mL，吸取約1mL細(xì)胞懸液至離心管中，加入1滴臺(tái)盼藍(lán)并輕輕搖勻，在約3min內(nèi)對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。死細(xì)胞被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，而活細(xì)胞則為無色，并根據(jù)公式計(jì)算活細(xì)胞率：活細(xì)胞率=（活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。1.2.8實(shí)驗(yàn)分組將生長(zhǎng)良好的HSCs用0.25%的胰蛋白酶消化后，接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/孔，每8個(gè)孔中分別加入0.5mg/mLRGD-OM-liposome；OM-liposome以及RGD修飾的空白脂脂質(zhì)體（RGD-liposome），并設(shè)對(duì)照組。1.2.9流式細(xì)胞儀分析HSCs凋亡情況各劑型藥物作用24h后，細(xì)胞以胰酶消化，PBS清洗，將細(xì)胞懸液離心（800～1000r/min，5min），棄上清液，加1mLPBS，緩慢加入-20℃預(yù)冷的95%乙醇15mL，使其終濃度為70%，冰浴30min，4℃過夜；加入等量PBS再洗2次，65mg/L碘化丙啶（PI）避光，4℃顯色1h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.2.10電鏡觀察HSCs形態(tài)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層生長(zhǎng)細(xì)胞，棄去瓶中培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化，將細(xì)胞移入10mL離心管中，加4℃預(yù)冷的PBS至10mL，吹打均勻，離心（2000r/min，15min）棄上清，加入4℃預(yù)冷的2%戊二醛4mL，4℃固定2h，PBS漂洗3次，每次10min，1%四氧化鋨4℃固定30min，PBS漂洗3次，用50%丙酮溶液室溫下脫水10min，棄脫水劑，加3mL包埋劑包埋（按體積1∶1），室溫下靜置30min，棄去包埋劑，加純包埋劑1mL，室溫過夜后，將明膠注滿混合包埋劑，60℃烤箱烘烤24h，使標(biāo)本固化為硬塊，切片后電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。2結(jié)果2.1各組凋亡小體形成情況將模型大鼠肝組織中分離獲得的HSCs在體外培養(yǎng)，分別加入RGD-liposome、OM-liposome和RGD-OM-liposome，利用透射電鏡觀察HSCs胞內(nèi)凋亡小體的形成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OM-liposome可促進(jìn)HSCs胞內(nèi)凋亡小體的形成；RGD則可進(jìn)一步增加OM-liposome誘導(dǎo)HSCs凋亡小體形成的作用（圖1）。2.2各組凋亡情況比較將模型大鼠肝組織中分離獲得的HSCs在體外培養(yǎng)，分別加入RGD-liposome、OM-liposome和RGD-OM-liposome，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HSCs細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OM-liposome可誘導(dǎo)HSCs凋亡，抑制DNA合成；RGD則可進(jìn)一步增加OM-liposome誘導(dǎo)HSCs凋亡、抑制DNA合成的作用（圖2）。2.3各組細(xì)胞活性觀察將模型大鼠肝組織中分離獲得的HSCs在體外培養(yǎng)，分別加入RGD-liposome、OM-liposome和RGD-OM-liposome，利用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的不斷升高，OM-liposome可顯著抑制HSCs的細(xì)胞活性；RGD則可增強(qiáng)OM-liposome抑制HSCs細(xì)胞活性的作用（圖3）。2.4OM-liposome和RGD-OM-liposome在HSCs中的分布情況觀察將模型大鼠肝組織中分離獲得的HSCs在體外培養(yǎng)，分別加入FITC-RGD-OM-liposome和FITC-OM-liposome，利用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGD可顯著增加OM-liposome在HSCs中的分布（圖4）。3討論OM對(duì)肝纖維化具有較好的療效[1]，然而其機(jī)制尚不清楚。HSCs和細(xì)胞因子共同參與發(fā)揮了致肝纖維化的作用[2]。越來越多的研究證實(shí)，抑制活化的HSCs、誘導(dǎo)HSCs凋亡對(duì)有效控制肝纖維化起著至關(guān)重要的作用。本研究中，筆者成功分離獲得了HF大鼠肝臟HSCs并在體外培養(yǎng)；構(gòu)建了OM-liposome，并將其作用于體外培養(yǎng)的HSCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSCs胞內(nèi)凋亡小體形成增加，處于DNA合成期的HSCs百分比數(shù)量明顯降低，細(xì)胞活性明顯下降，提示OM-liposome可誘導(dǎo)HSCs凋亡。新型人工合成的RGD肽是一類含有RGD的短肽，是整合素與其配體結(jié)合的識(shí)別位點(diǎn)。由于細(xì)胞表面的整合素介導(dǎo)ECM與HSCs細(xì)胞膜受體結(jié)合，影響HSCs的生物學(xué)功能，RGD能夠競(jìng)爭(zhēng)性與整合素結(jié)合，不但減少ECM與HSCs黏附，還可作為HSCs的特異性配體[6]。本研究建立了RGD-OM-liposome并將其作用于體外培養(yǎng)的HSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGD可顯著增加OM-liposome在HSCs中的分布。不僅如此，RGD亦可顯著增強(qiáng)OM-liposome增加HSCs胞內(nèi)凋亡小體、減少處于DNA合成期的HSCs百分比及抑制HSCs細(xì)胞活性的作用。綜上所述，本研究建立了OM-liposome和RGD-OM-liposome，通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)RGD可促進(jìn)OM-liposome在HSCs中的分布，從而增強(qiáng)其誘導(dǎo)HSCs凋亡的作用，提示OM可能通過誘導(dǎo)HSCs凋亡減輕肝纖維化。[IAPfamilies，andreleasingofcytochromec[J].JExpClinCancerRes，2011，30：66.[5]KimMR