遺傳的物質(zhì)基礎

遺傳的物質(zhì)基礎Office:Room218,ChemicalBuilding,PhoneNumberab:

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fnnakong@

孔凡娜第2頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第一章遺傳的物質(zhì)基礎第3頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)遺傳物質(zhì)的本質(zhì)-核酸第二節(jié)核酸的化學組成、結(jié)構(gòu)特征與性質(zhì)主要內(nèi)容第4頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)遺傳物質(zhì)的本質(zhì)-核酸第5頁,共167頁，2024年2月25日，星期天遺傳物質(zhì)必須具備哪些特點？1）在體細胞中含量穩(wěn)定；2)在生殖細胞中含量減半；3)能攜帶遺傳信息；4)

能精確地自我復制；5)能發(fā)生變異；第6頁,共167頁，2024年2月25日，星期天1928年Griffith

小鼠肺炎—肺炎鏈球菌表面光滑S型—多糖—發(fā)病表面粗糙R型—不含多糖—無致病力

毒力因子——細胞表面夾膜多糖1.肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗1-1Griffith的轉(zhuǎn)化實驗第7頁,共167頁，2024年2月25日，星期天1944年,O.T.Avery細菌中遺傳物質(zhì)為DNAThetransformingprincipleisDNA1-2Avery體外轉(zhuǎn)化實驗第8頁,共167頁，2024年2月25日，星期天人們?nèi)圆幌嘈臘NA是遺傳物質(zhì),這是由于：（1）認為蛋白分子量大，結(jié)構(gòu)復雜，二十種氨基酸的排列組合將是個天文數(shù)字，可作為一種遺傳信息。而DNA分子量小，只含4種不同的堿基，人們一度認為不同種的有機體的核酸只有微小的差異。（2）認為轉(zhuǎn)化實驗中DNA并未能提得很純，還附有其它物質(zhì)。（3）即使轉(zhuǎn)化因子確實是DNA，但也可能DNA只是對莢膜形成起著直接的化學效應，而不是充當遺傳信息的載體。第9頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.T2噬菌體轉(zhuǎn)導實驗

1952年,A.D.Hershey&M.Chase

第10頁,共167頁，2024年2月25日，星期天

32P——標記噬菌體DNA35S——標記噬菌體外殼蛋白感染后，大量32P標記的DNA進入大腸桿菌細胞，進行噬菌體復制與組裝35S主要位于細胞表面，在子代中含量很低DNA為T2噬菌體的遺傳物質(zhì)ThegeneticmaterialofphageT2isDNA第11頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3.真核細胞轉(zhuǎn)染實驗真核細胞通過轉(zhuǎn)染獲取外源DNA而獲得新的性狀EukaryoticcellscanacquireanewphenotypeastheresultoftransfectionbyaddedDNA.

真核細胞的遺傳物質(zhì)也是DNA第12頁,共167頁，2024年2月25日，星期天RNA也是遺傳物質(zhì)1956年A.Gierer和G.Schraman發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒（tobaccomosaicvirus,TMV），其遺傳物質(zhì)是RNA。1957年美國的HeinzFraenkel-Conrat和B.Singre用重建實驗證實了這一結(jié)論。第13頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共167頁，2024年2月25日，星期天DNA是多數(shù)細胞生命體的遺傳物質(zhì)ThegeneticmaterialoforganismsusuallyisDNA.DNA也是許多病毒的遺傳物質(zhì)，一些病毒使用RNA作為遺傳物質(zhì)Thegeneralprincipleofthenatureofthegeneticmaterial,then,isthatitisalwaysnucleicacid;infact,itisDNAexceptintheRNAviruses.

核酸是不是唯一的遺傳物質(zhì)？結(jié)論第15頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)核酸的化學組成、結(jié)構(gòu)特征與性質(zhì)第17頁,共167頁，2024年2月25日，星期天一、核酸的化學組成1、基本化學成分基本單位——核苷酸（nucleotide）；每分子核苷酸包含一個碳、氮原子的雜環(huán)化合物（堿基），一個環(huán)狀五碳糖（戊糖），和一個磷酸分子基團；堿基(Base)有兩種類型:嘌呤（purine）和嘧啶（pyrimidine）；戊糖也有兩種：2-脫氧核糖和核糖。第18頁,共167頁，2024年2月25日，星期天嘌呤堿基和嘧啶堿基第19頁,共167頁，2024年2月25日，星期天

此外，核酸分子中還發(fā)現(xiàn)數(shù)十種修飾堿基（modifiedcomponent),又稱稀有堿基(unusualcomponent)。它是指上述五種堿基環(huán)上的某一位置被一些化學基團（如甲基化、甲硫基化等）修飾后的衍生物。一般這些堿基在核酸中的含量稀少，在各種類型核酸中的分布也不均一。如DNA中的修飾堿基主要見于噬菌體DNA，RNA中以tRNA含修飾堿基最多。

第20頁,共167頁，2024年2月25日，星期天脫氧核糖與核糖DNA中戊糖是2-脫氧核糖，而在RNA中是核糖；不同在于糖環(huán)2位上是否存在羥基基團第21頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2、核苷酸的組成與連接核苷核苷酸第22頁,共167頁，2024年2月25日，星期天核苷三磷酸第23頁,共167頁，2024年2月25日，星期天核苷酸的連接Apolynucleotidechainconsistsofaseriesof5’-3’sugar-phosphatelinksthatformabackbonefromwhichthebasesprotrude.

第24頁,共167頁，2024年2月25日，星期天核苷酸的連接5’-三磷酸核苷酸是核酸合成的前體。三磷酸的5’末端同多聚核苷酸鏈末端的3’-OH基團反應，釋放三磷酸的兩個末端磷酸基團（

和

），

磷酸與多聚核苷酸鏈末端的糖的3’-OH成鍵。

第25頁,共167頁，2024年2月25日，星期天核苷酸鏈酯鍵的斷裂第26頁,共167頁，2024年2月25日，星期天寡核苷酸（oligonucleotide)

一般是指二至十幾個核苷酸殘基以磷酸二酯鍵連接而成的線性多核苷酸片段。寡核苷酸可由自動合成，可作為DNA合成引物、基因探針等，在現(xiàn)代分子生物學研究中具有廣泛的用途。

核酸鏈的簡寫式5’pＡpＣpＴpＴpＧpＡpＡpＣpＧ3’DNA此式可進一步簡化為：5’pＡＣＴＴＧＡＡＣＧ3’第27頁,共167頁，2024年2月25日，星期天二、DNA結(jié)構(gòu)與性質(zhì)基本概念

Antiparalle，Basepairing，Complementary，Supercoiling掌握DNA一、二、三級結(jié)構(gòu)的主要特征了解DNA的一般理化特性第28頁,共167頁，2024年2月25日，星期天1、基本概念Antiparallelstrandsofthedoublehelixareorganizedinoppositeorientation,sothatthe5′endofonestrandisalignedwiththe3′endoftheotherstrand.Basepairingdescribesthespecific(complementary)interactionsofAdeninewithThymineorofCytosinewithGuanineinaDNAdoublehelix(ThymineisreplacedbyUracilindoublehelicalRNA).Complementarybasepairsaredefinedbythepairingreactionsindoublehelicalnucleicacids(AwithTinDNAorwithUinRNA,andCwithG).SupercoilingdescribesthecoilingofaclosedduplexDNAinspacesothatitcrossesoveritsownaxis.第29頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2、DNA一級結(jié)構(gòu)DNA一級結(jié)構(gòu)：指DNA分子中核苷酸的排列順序，由于核苷酸之間的差異僅僅是堿基的不同，故可稱為堿基順序?；颍哼z傳信息都包含在組成DNA的A,G,C,T這四種核苷酸的排列順序之中。DNA分子中不同排列順序的DNA區(qū)段構(gòu)成特定的功能單位，這就是基因?；虻墓δ苋Q于DNA的一級結(jié)構(gòu)，要想解釋基因的生物學含義，就必須弄清DNA順序。因此，DNA順序測定是分子生物學中一項既重要又基本的課題。

第30頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3、DNA二級結(jié)構(gòu)雙螺旋模型產(chǎn)生的背景（1）1938年W.T.Astbury&Bell用x衍射技術(shù)研究DNA。1947年拍攝了第一張DNA的衍射照片，并推斷DNA分子的結(jié)構(gòu)是：

①柱狀；②多核苷酸是一疊扁平的核苷酸；③核酸殘基取向和分子長軸垂直，間距為3.4A。第31頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2）1951年P(guān)auling和Corey運用化學的定律來推理，而不做具體的實驗，建立了蛋白質(zhì)的α-螺旋模型；第32頁,共167頁，2024年2月25日，星期天（3）晶體學者J.Donoh&Chargaff發(fā)現(xiàn)DNA堿基組成的共同規(guī)律。（4）R.Franklin&Wilkins在1952等用X射線衍射方法獲得的DNA結(jié)構(gòu)資料

第33頁,共167頁，2024年2月25日，星期天以摩爾含量表示，不同來源DNA都存在[A]=[T]和[C]=[G]；不同物種DNA堿基組成上有很大變化，表現(xiàn)在A+T/G+C比值不同，但同種生物不同組織DNA堿基組成相同；嘌呤堿基的總和與嘧啶堿基的總和相等。第34頁,共167頁，2024年2月25日，星期天1952年，Wilkins和Franklin用高度定向的DNA纖維作出高質(zhì)量的X-光衍射照片第35頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共167頁，2024年2月25日，星期天1953.Watsosn&Crick第37頁,共167頁，2024年2月25日，星期天

“Now,intheverymonthandyearofthe50thanniversaryofthatimportantdiscoverybyWatson&Crick,theInternationalHumanGenomeSequencingConsortiumhascom-pleteddecodingallthechaptersoftheinstru-ctionbookofhumanlife”-JointProclamationonHGP14April,2003

第38頁,共167頁，2024年2月25日，星期天1962年，Wilkins、Watson和Crick共獲諾貝爾化學獎。第39頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2）DNAisadoublehelix第40頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共167頁，2024年2月25日，星期天DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點主鏈（backbone）：脫氧核糖和磷酸基通過酯鍵交替連接而成。二條主鏈繞一共同軸心以右手方向盤旋、反向平行形成雙螺旋構(gòu)型。主鏈處于螺旋外則。堿基對（basepair）：堿基位于螺旋的內(nèi)則，以垂直于螺旋軸的取向通過糖苷鍵與主鏈糖基相連。同一平面的堿基在二條主鏈間形成堿基對。配對堿基總是A與T和G與C。堿基對以氫鍵維系，A與T間形成兩個氫鍵，G與C間形成兩個氫鍵。第42頁,共167頁，2024年2月25日，星期天大溝和小溝：大溝和小溝分別指雙螺旋表面凹下去的較大溝槽和較小溝槽。小溝位于雙螺旋的互補鏈之間,而大溝位于相毗鄰的雙股之間。這是由于連接于兩條主鏈糖基上的配對堿基并非直接相對,從而使得在主鏈間沿螺旋形成空隙不等的大溝和小溝。在大溝和小溝內(nèi)的堿基對中的N和O原子朝向分子表面。結(jié)構(gòu)參數(shù)：螺旋直徑2nm；螺旋周期包含10對堿基；螺距3.4nm；相鄰堿基對平面的間距0.34nm。第43頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)與DNA復制

Watson和Crick認為DNA結(jié)構(gòu)中的二條鏈是一對互補的模板（親本），復制時堿基對間的氫鍵斷開，兩條鏈分開，每條鏈都作為模板指導合成與自身互補的新鏈（復本），最后從原有的兩條鏈得到兩對鏈而完成復制。在嚴格堿基配對基礎上的互補合成保證了復制的高度保真性，也就是將親鏈的堿基序列復制給了子鏈。因為復制得到的每對鏈中只有一條鏈是親鏈，即保留了一半親鏈，故這種復制方式又稱為半保留復制（semi-conservativereplication）。第44頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共167頁，2024年2月25日，星期天4、DNA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性

第46頁,共167頁，2024年2月25日，星期天DNA構(gòu)象的改變的因素：核苷酸順序、堿基組成、鹽的種類、相對濕度。B-DNA：最常見的天然構(gòu)象；A-DNA：脫水DNA中，還出現(xiàn)在RNA分子中的雙螺旋區(qū)域和DNA－RNA雜交分子中；B-DNA,A-DNA,C-DNA,D-DNA,S-DNA共同特征：右手雙螺旋；兩條反向平行的核苷酸鏈通過Ｗatson-Crick堿基配對結(jié)合在一起；鏈的重復單位是單核苷酸；這些螺旋中都有兩個螺旋溝，分為大溝與小溝，只是它們的寬窄和深淺程度有所不同。

第47頁,共167頁，2024年2月25日，星期天嘌呤與嘧啶交替排列(GGCGCG);左手雙螺旋;只有一個螺旋溝，狹而深;細胞DNA分子中確實存在Z-DNA區(qū);胞嘧啶第五位碳原子的甲基化，可使B-DNA不穩(wěn)定而轉(zhuǎn)變?yōu)閆-DNA。Z-DNAZ-DNA第48頁,共167頁，2024年2月25日，星期天ABZ大溝寬小溝窄小溝窄大溝變深小溝寬深大溝不存在小溝窄而深第49頁,共167頁，2024年2月25日，星期天

Z-DNA的生物學意義

(1)可能提供某些調(diào)節(jié)蛋白的識別。嚙齒類動物病毒的復制起始部位有d（GC）有交替順序的存在；(2)在SV40的增強子中有三段8bp的Z-DNA存在。(3)原生動物纖毛蟲，它有大、小兩個核，大核有轉(zhuǎn)錄活性，小核和繁殖有關(guān)。Z-DNA抗體以螢光標記后，顯示僅和大核DNA結(jié)合，而不和小核的DNA結(jié)合，說明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和轉(zhuǎn)錄有關(guān)。第50頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第51頁,共167頁，2024年2月25日，星期天5、DNA三級結(jié)構(gòu)DNA的三級結(jié)構(gòu)，是指在一二級結(jié)構(gòu)基礎上的多聚核苷酸鏈上的卷曲。在一定意義上，是指雙螺旋基礎上的卷曲。三級結(jié)構(gòu)包括鏈的扭結(jié)和超螺旋或者是單鏈形成的環(huán)或是環(huán)狀DNA中的連環(huán)體第52頁,共167頁，2024年2月25日，星期天1）DNA的超螺旋雙螺旋的進一步扭曲折疊便構(gòu)成DNA的三級結(jié)構(gòu)，即超螺旋結(jié)構(gòu)。超螺旋在自然界中廣泛存在。全部腫瘤病毒DNA，人和其它動物的線粒體的DNA，植物的葉綠體DNA，質(zhì)粒等。第53頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共167頁，2024年2月25日，星期天超螺旋結(jié)構(gòu)示意圖超螺旋按照方向的不同分為正超螺旋和負超螺旋第55頁,共167頁，2024年2月25日，星期天360o/helix360o-26o/helix/0neofEBinserted負Superhelix

OC,L,DNA

正Superhelix

體外可產(chǎn)生正超螺旋—溴化乙錠（EB）放線菌素D第56頁,共167頁，2024年2月25日，星期天

密度梯度離心凝膠電泳電鏡觀察檢測DNA三級結(jié)構(gòu)的方法：第57頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第58頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2）染色體的結(jié)構(gòu)

i)核小體——染色體的初級結(jié)構(gòu)第一級的包裝是將DNA變成串珠狀物質(zhì)，串珠狀顆粒稱核小體.第59頁,共167頁，2024年2月25日，星期天ii）螺線體10nm“珠串”的進一步壓縮，由每圈5-6個核小體盤旋而成直徑約30nm的纖絲。這一級包裝又將染色體壓縮了6倍，第60頁,共167頁，2024年2月25日，星期天iii）染色體環(huán)螺線體還可進一步形成更大的環(huán)。進一步壓縮成染色質(zhì)和染色體結(jié)構(gòu)需非組蛋白參與。間期染色質(zhì)和中期染色體均有大環(huán)的組織結(jié)構(gòu)，每一個環(huán)可以是獨立的超螺旋區(qū)，環(huán)上的堿基由DNA上的特異位點連接到中期骨架或核質(zhì)上。第61頁,共167頁，2024年2月25日，星期天從DNA到染色體的過程第62頁,共167頁，2024年2月25日，星期天染色體形成過程中長度與寬度的變化第63頁,共167頁，2024年2月25日，星期天6、DNA的主要性質(zhì)

1）DNA的堿基組成GC含量：DNA的堿基組成通常用GC百分含量表示，注意所謂百分含量是指摩爾百分比。2）DNA分子的形狀與大小形狀：DNA分子以線形或環(huán)狀形式存在，大多數(shù)是雙鏈的，少數(shù)是單鏈的。高等動物、植物的DNA一般是雙鏈線狀，原核生物DNA多數(shù)為雙鏈環(huán)狀，少數(shù)病毒DNA可能是單鏈環(huán)狀或單鏈線狀。大?。翰町悜沂?，大小可相差幾十億倍。第64頁,共167頁，2024年2月25日，星期天不同基因組DNA中GC的相對含量RatiosofGtoCandAtoTarefixedinanyspecificorganismThetotalpercentageofG+Cvariesoverarangeto22to73%Suchdifferencesarereflectedindifferencesinphysicalproperties第65頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第66頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3）變性（Denaturation）或解鏈（melting）穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子由于維持穩(wěn)定性的氫鍵和疏水鍵的斷裂，松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象；條件：凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等。第67頁,共167頁，2024年2月25日，星期天

DenaturationofDNAA-TrichregionsdenaturefirstCooperativeunwindingoftheDNAstrandsExtremesinpHorhightemperature

第68頁,共167頁，2024年2月25日，星期天斷裂可以是部分的或全部的，是可逆的或是非可逆的；DNA變性不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變；變性過程的表現(xiàn)¤導致一些理化性質(zhì)發(fā)生變化¤是爆發(fā)式的協(xié)同過程，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍第69頁,共167頁，2024年2月25日，星期天

粘度降低

變性后緊密的DNA雙螺旋變成松散的無規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，粘度明顯下降。

旋光性改變

變性后DNA分子的對稱性及分子局部構(gòu)性改變,使DNA溶液旋光性發(fā)生變化。

增色效應或高色效應(hyperchromiceffect)

核酸在紫外光260nm具有強烈的吸收峰。結(jié)構(gòu)越有序，吸收的光越少。即游離的核苷酸比單鏈的RNA或DNA吸收更多的光，而單鏈RNA或DNA的吸收又比雙鏈DNA分子強。當DNA變性時，其光吸收值增加，這種現(xiàn)象即為增色效應；反之為減色效應。變性導致的理化及生物學性質(zhì)的改變第70頁,共167頁，2024年2月25日，星期天DNA變性曲線變性溫度或融解溫度(Tm)：變性過程中在非常狹窄的溫度范圍內(nèi)，紫外增色效應會出現(xiàn)一個飛躍。紫外吸收值發(fā)生跳躍的溫度稱為DNA的融點。Tm值實際上是目標DNA的一半變性時的溫度，它受DNA堿基組成和變性條件的影響。第71頁,共167頁，2024年2月25日，星期天影響Tm值的因素

DNA溶劑；DNA本身性質(zhì)：DNA的均一性：1）DNA分子中堿基組成的均一性；2）待測樣品DNA的組成是否均一；DNA的(G+C)含量Tm與(G+C)含量的關(guān)系經(jīng)驗公式：X%(G+C)=2.44(Tm-69.3)（DNA溶于0.2mol/LNaCl中）第72頁,共167頁，2024年2月25日，星期天不同GC含量的DNA分子變性曲線對比第73頁,共167頁，2024年2月25日，星期天不同來源的DNA的GC含量和密度的關(guān)系第74頁,共167頁，2024年2月25日，星期天4）復性（Renaturation)

指變性DNA在適當條件下,二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象,它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復性,此過程稱為“退火”(annealing)。

DenaturationRenaturationannealing復性過程依賴于單鏈分子間的隨機碰撞第75頁,共167頁，2024年2月25日，星期天雙螺旋呼吸雙鏈DNA配對堿基的氫鍵不斷處于斷裂和再生狀態(tài)中，特別是在穩(wěn)定性較低的富含A-T的區(qū)段。在微觀上，常常出現(xiàn)瞬間的單鏈泡狀結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象稱為雙螺旋的呼吸作用。一些蛋白質(zhì)可識別這種結(jié)構(gòu)，并在單鏈結(jié)構(gòu)下閱讀和識別DNA內(nèi)部所含信息.第76頁,共167頁，2024年2月25日，星期天影響DNA復性的因素溫度：從熱運動角度考慮，Tm以下較高溫度有利于復性，比Tm低25℃左右的溫度是復性最佳條件。低溫（<4℃）下分子熱運動減弱互補鏈結(jié)合機會大大減少。時間：降溫時間太短以及溫差大均不利于復性。溫度下降須緩慢，若迅速冷卻至低溫，復性幾乎是及不可能的。DNA濃度：溶液中DNA分子越多，相互結(jié)合機會越大。復性第一步是兩個單鏈分子間相互作用“成核”，其速度與DNA濃度平方成正比。

DNA順序的復雜性：簡單順序的DNA分子互補堿基的配對較易實現(xiàn)，而順序復雜的DNA序列要實現(xiàn)互補則困難得多。

第77頁,共167頁，2024年2月25日，星期天復性動力學公式

C11C021+KC0t1/2

==根據(jù)復性動力學公式我們可以知到些什么？第78頁,共167頁，2024年2月25日，星期天

遵循二級反應動力學dCt/dt=-KC02

反應初始t=0

單鏈DNA的隨機碰撞過程（randomlycollision）單鏈DNA濃度=C0反應達t時單鏈DNA濃度=CtK＝復性速度常數(shù)第79頁,共167頁，2024年2月25日，星期天dCt/dt=-KC02積分Ct/C0=1/(1+KC0t)當Ct/C0=1/2時Ct/C0=1/2=1/(1+KC0t(1/2))K=1/Cot(1/2)Cot(1/2)

=1/K(mol.Sec/L)常數(shù)

Ct/C0是C0t的函數(shù)按此公式作圖得C0t曲線C0t(1/2)值對DNA具有特征性，其中與DNA的堿基對數(shù)目成反相關(guān)第80頁,共167頁，2024年2月25日，星期天C0t1/2：標準條件下（一般為0.18ml/L陽離子濃度）測得的復性率達1/2時的C0t值。該值與核苷酸對的復雜性成正比。對于原核生物，此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對的復雜程度。真核基因組中因含有許多不同程度的重復序列(repetitivesequence)，所得到的Cot曲線更為復雜。第81頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第82頁,共167頁，2024年2月25日，星期天分子雜交（簡稱雜交，hybridization）是核酸研究中一項最基本的實驗技術(shù)。其基本原理就是應用核酸分子的變性和復性的性質(zhì)，使來源不同的DNA（或RNA）片段，按堿基互補關(guān)系形成雜交雙鏈分子（heteroduplex）。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間，也可在RNA與DNA鏈之間形成。雜交的本質(zhì)就是在一定條件下（加熱或堿處理）使雙螺旋解開成為單鏈,使互補核酸鏈實現(xiàn)復性。因此,變性技術(shù)也是核酸雜交的一個環(huán)節(jié)。5）核酸分子雜交：第83頁,共167頁，2024年2月25日，星期天原位雜交（insituhybridization）斑點雜交（dotblotting）Southernblotting--DNANorthernblotting--RNAWesternblotting—Protein雜交技術(shù)的種類第84頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第85頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第86頁,共167頁，2024年2月25日，星期天Southern第87頁,共167頁，2024年2月25日，星期天PCR技術(shù)(polymerasechainreaction)第88頁,共167頁，2024年2月25日，星期天內(nèi)容回顧驗證核酸是遺傳物質(zhì)的實驗DNA的結(jié)構(gòu)和特征二級結(jié)構(gòu)：ＤＮＡ雙螺旋（要點）ＤＮＡ的構(gòu)象：Ｂ-DNA,A-DNA,Z-DNA三級結(jié)構(gòu)：原核生物&真核生物DNA的性質(zhì)

變性和復性，Ｔｍ核酸雜交技術(shù)ＰＣＲ技術(shù)第89頁,共167頁，2024年2月25日，星期天6）DNA的檢測和測定

分子量檢測：電泳質(zhì)量或濃度檢測：

EB染色

分光光度技術(shù):260nm光吸收化學檢測放射性檢測第90頁,共167頁，2024年2月25日，星期天DNAElectrophoresis第91頁,共167頁，2024年2月25日，星期天HGP人類基因組計劃曼哈頓原子彈計劃阿波羅計劃第92頁,共167頁，2024年2月25日，星期天遺傳圖譜（geneticmap）又稱連鎖圖譜(linkagemap)，它是以具有遺傳多態(tài)性的遺傳標記為“路標”，以遺傳學距離（cM）為圖距的基因組圖。物理圖譜(physicalmap)是指特定的DNA片段在大片段DNA或基因組DNA中的位置關(guān)系和排列順序，包括DNA克隆片斷重疊群圖，大片段內(nèi)切酶位點圖、DNA序列路標圖等.序列圖譜(sequencemap)是指基因組DNA中核苷酸的排列順序。轉(zhuǎn)錄圖譜(transcriptionmap)是在識別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達模式等信息的圖譜。第93頁,共167頁，2024年2月25日，星期天VerysmallchangesintechnologyhavehadahugeimpactontheHGP….. Imaginewhatalargechange intechnologywoulddo…第94頁,共167頁，2024年2月25日，星期天CeleraGenomicsPublicConsortium第95頁,共167頁，2024年2月25日，星期天SequenceGenomesFindGenesEstablishFunctionandDiseaseMechanismGeneticMapping,MutationDetectionDrugCandidatesGeneTherapyDiagnostics/PrognosticsCure第96頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2000,4,5，以楊煥明為首的中國科學家在Science發(fā)表了水稻全基因組框架序列圖?；蚩倲?shù)：46022~55615，約為人類的2倍；其中10000個基因的功能已確定；水稻的“垃圾”序列多位于基因外，人類的“垃圾”序列多位于基因內(nèi)；水稻的基因平均長度為4500bp,人類基因平均長度為72000bp,擬南芥約有25000個基因，80%在水稻中都存在，二者之間有關(guān)信號傳導的基因差別最大第97頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第98頁,共167頁，2024年2月25日，星期天有關(guān)DNA雙鏈的幾個概念Transcription

issynthesisofRNAonaDNAtemplate.SeveraldifferenttypesofRNAaregeneratedbytranscription.Thethreeprincipalclassesinvolvedinthesynthesisofproteinsare:messengerRNA(mRNA)transferRNA(tRNA)andribosomalRNA(rRNA)。第99頁,共167頁，2024年2月25日，星期天CodingstrandorSensestrandThestrandbearsthesamesequenceasthemRNA(exceptforpossessingTinsteadofU)TemplatestrandorAntisensestrand

ThestrandofDNAthatdirectssynthesisofthemRNAviacomplementarybasepairing(Thenon-templatestrandisidenticalinsequencetotheRNAproduct.)第100頁,共167頁，2024年2月25日，星期天三、RNA的結(jié)構(gòu)與功能Aminoacyl-tRNA\Anticodon\Loop&Stem\

NascentRNA\Monocistronic\Polycistronic\Codingregion\Leader\TrailertRNA的結(jié)構(gòu)與功能rRNA的種類原核和真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)特點miRNA與siRNA第101頁,共167頁，2024年2月25日，星期天Aminoacyl-tRNAistransferRNAcarryinganaminoacid;thecovalentlinkageisbetweentheNH2groupoftheaminoacidandeitherthe3’-or2’-OHgroupoftheterminalbaseofthetRNA.AnticodonisatrinucleotidesequenceintRNAwhichiscomplementarytothecodoninmRNAandenablesthetRNAtoplacetheappropriateaminoacidinresponsetothecodon.Loopisasingle-strandedregionattheendofahairpininRNA(orsingle-strandedDNA).Stemisthebase-pairedsegmentofahairpin.1、轉(zhuǎn)移RNA(transferRNA，tRNA)第102頁,共167頁，2024年2月25日，星期天1）tRNA的結(jié)構(gòu)特征tRNA通常由70-90個核苷酸組成，每種氨基酸至少有一個tRNA分子；tRNA有很多的稀有堿基，主要是甲基化堿基、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶等；tRNA的二級結(jié)構(gòu)為三葉草形（cloverleaf），其中互補配對堿基形成莖結(jié)構(gòu)，不配對的則形成環(huán)狀，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被稱為tRNA的臂；tRNA具有倒L型的三級結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)靠氫鍵維持。

第103頁,共167頁，2024年2月25日，星期天氨基酸接受臂：由鏈兩端序列堿基配對組成，在3’端有一個游離的CCA順序，氨基酸通過共價鍵與A上的2’-OH或3’-OH相連。此臂負責攜帶特異的氨基酸。TψC臂：ψ是假尿嘧啶。該臂常由5bp的莖和7Nt環(huán)組成,一般均存在TψC的順序

。反密碼子臂：常由5bp的莖區(qū)和7Nt的環(huán)區(qū)組成,在反密碼子環(huán)的中間是三聯(lián)的反密碼子。二氫尿嘧啶臂（D臂）：名稱由來源于環(huán)中含有二氫尿嘧啶,負責和氨基酰tRNA聚合酶結(jié)合。

額外臂：變化最大的區(qū)域，可分為兩類，一類僅含3-5個核苷酸，另一類含有一條較大的臂,其功能是在tRNA的L型三維結(jié)構(gòu)中負責連接兩個區(qū)域（D環(huán)－反密碼子環(huán)和TψC-受體臂）。tRNA特征性的三葉草型二級結(jié)構(gòu)第104頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第105頁,共167頁，2024年2月25日，星期天tRNAL形三級結(jié)構(gòu)第106頁,共167頁，2024年2月25日，星期天

酵母苯丙氨酸t(yī)RNA的三級氫鍵第107頁,共167頁，2024年2月25日，星期天(1)tRNA三級結(jié)構(gòu)呈L形，這種結(jié)構(gòu)是靠氫鍵來維持；(2)D環(huán)和TψC環(huán)形成了“L”的轉(zhuǎn)角,氨基酸受體臂位于L型的一側(cè)，距反密碼子環(huán)約70A。(3)在一些保守和半保守的堿基之間形成很多的三級氫鍵,使分子形成L形,并使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。(4)幾乎所有的堿基平面之間產(chǎn)生堆積作用。(5)在反密碼子莖中僅有很少的三級氫鍵。L型結(jié)構(gòu)第108頁,共167頁，2024年2月25日，星期天這種結(jié)構(gòu)與AA-tRNA合成酶對tRNA的識別有關(guān)；受體臂頂端的堿基位于“L”的一個端點，而反密碼子臂的套索狀結(jié)構(gòu)生成了“L”的另一端點，分子中兩個不同的功能基團是最大限度分離的。這個結(jié)構(gòu)形式滿足了肽鏈合成延伸位點與mRNA分別位于核糖體大、小亞基的空間結(jié)構(gòu)的要求。第109頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2）tRNA的功能tRNA作為連接子（adaptor）介導了mRNA中的三聯(lián)體密碼子與氨基酸之間的相互關(guān)聯(lián)。

tRNA具備作為“接頭”的雙重特性，既能識別氨基酸也能識別密碼子。3’末端的腺苷酸可與一氨基酸共價連接，反密碼子則與mRNA中的密碼子堿基配對。第110頁,共167頁，2024年2月25日，星期天tRNA的其它功能在逆轉(zhuǎn)錄中作為合成互補DNA鏈的引物；參與細菌細胞壁、葉綠素、脂多糖和氨酰磷脂酰甘油的合成。第111頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3）tRNA的種類起始tRNA和延伸tRNA：能特異地識別mRNA模板鏈上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA；其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。

原核生物中，起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸（fMet）真核生物中，起始tRNA攜帶甲硫氨酸（Met）第112頁,共167頁，2024年2月25日，星期天同工tRNA：一種氨基酸可能有多個密碼子，為了識別也就有多個tRNA，即多個tRNA代表一種氨基酸，這些tRNA稱為同工tRNA。校正tRNA：由校正基因突變產(chǎn)生，通過改變反密碼子區(qū)校正無義突變和錯義突變。第113頁,共167頁，2024年2月25日，星期天無義突變錯義突變第114頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第115頁,共167頁，2024年2月25日，星期天抑制突變的特點1.不是所有抑制基因都能產(chǎn)生有功能的蛋白質(zhì)，關(guān)鍵是要看氨基酸取代的情況。2.校正的作用不可能是完全的。①校正tRNA分子必須和釋放因子或正常tRNA競爭；②無義突變的校正tRNA會抑制該基因3’端正常的終止密碼，導致翻譯通讀，合成更長的蛋白質(zhì)。③錯義突變的校正也可以使另一個基因錯誤翻譯。3.抑制基因的效率很低，通常為1-5%。第116頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2、核糖體RNA(ribosomalRNA，rRNA)核糖體RNA占細胞中RNA總量的80%以上；幾種核糖體rRNA與幾十種蛋白質(zhì)組成的亞細胞顆?！颂求w是細胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的工廠；rRNA組成了核糖體的大部分，在原核生物核糖體中占2/3，在真核生物中占3/5；原核生物、真核生物細胞質(zhì)和細胞器中的核糖體存在很大差異。第117頁,共167頁，2024年2月25日，星期天結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的真核生物核糖體。左，電鏡下看到的胰腺細胞粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；右，局部放大后的草圖。第118頁,共167頁，2024年2月25日，星期天核糖體的組成第119頁,共167頁，2024年2月25日，星期天幾種不同生物核糖體及rRNA的組成第120頁,共167頁，2024年2月25日，星期天原核生物rRNA1）5SrRNA位于大亞基；120個核苷酸（G

）或116個核苷酸（G

）；有兩個高度保守區(qū)，一個含有保守序列CGAAC，與tRNA的T

C環(huán)上的GT

CG序列作用，識別tRNA；另一保守區(qū)域與23SrRNA中一段互補，與核糖體大亞基相互作用。第121頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2）16SrRNA在核糖體小亞基中；序列與結(jié)構(gòu)均十分保守。3‘端有一段-ACCUCCUUA-的共同順序，與mRNA5’端順序互補，在翻譯起始中有重要作用；臨近3‘端有一段與23SrRNA互補的序列，在30S與50S亞基的結(jié)合中起作用。第122頁,共167頁，2024年2月25日，星期天30S小亞基的圖解第123頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3）23SrRNA存在一段順序(1984-2001核苷酸之間)與tRNAmet上的一段順序互補，使二者相互作用；靠近5'-端(143-157核苷酸之間)有一段12個核苷酸的順序與5SrRNA上的一段順序(72-83核苷酸)互補，促進RNA之間的相互作用。第124頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第125頁,共167頁，2024年2月25日，星期天真核生物rRNA1）5SrRNA與原核生物5SrRNA相似，但結(jié)構(gòu)上存在差異。沒有保守序列CGAAC，但其有GAUG序列與起始tRNA某些序列有互補作用；2）5.8SrRNA真核生物特有。含有與原核生物5SrRNA一致的順序CGAAC，可能與原核生物的5SrRNA具有相似的功能;3)18SrRNA

酵母18SrRNA的3‘端與原核生物16SrRNA中具有廣泛的同源性；4）28SrRNA結(jié)構(gòu)尚不清楚?？傊瑀RNA與tRNA、mRNA之間有密切的相互作用。第126頁,共167頁，2024年2月25日，星期天原核生物與真核生物rRNA基因排列方式第127頁,共167頁，2024年2月25日，星期天總RNA電泳檢測（A）甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳圖譜(B)煙草總RNA普通瓊脂糖凝膠電泳圖譜

總RNA制備第128頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3、信使RNA(messengerRNA，mRNA)nascentRNA:anRNAwhosesynthesishasnotyetbeencompleted.Monocistronic:mRNAsrepresentonlyasinglegene.Polycistronic:

sequencescodingforseveralproteins.Codingregionconsistsofaseriesofcodonsrepresentingtheaminoacidsequenceoftheprotein,starting(usually)withAUGandendingwithaterminationcodon.Leader:Anadditionalsequenceatthe5′end,precedingthestartofthecodingregion.Trailer:Anadditionalsequencefollowingtheterminationsignal,formingthe3′end.第129頁,共167頁，2024年2月25日，星期天原核生物基因的轉(zhuǎn)錄原核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生在同一細胞空間，而且兩個過程幾乎同時發(fā)生；真核生物是在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，細胞質(zhì)內(nèi)翻譯。第130頁,共167頁，2024年2月25日，星期天原核生物mRNA的特征半衰期短：僅幾分鐘；原核生物mRNA多為多順反子（操縱子）形式；

結(jié)構(gòu)：前導序列(leader)、編碼區(qū)、尾巴(trailer)通常以AUG為起始密碼子，有時是GUG或UUG在AUG上游7-12個核苷酸處有一5’AGGAGG3’序列，稱SD順序(Shine-DalgarnoSequence)。這段序列與16SrRNA3’末端反向互補，與mRNA和核糖體的結(jié)合相關(guān)，因此會影響蛋白質(zhì)的翻譯。第131頁,共167頁，2024年2月25日，星期天原核生物mRNA

轉(zhuǎn)錄-翻譯-降解Overview:mRNAistranscribed,translated,anddegradedsimultaneouslyinbacteria.

第132頁,共167頁，2024年2月25日，星期天原核生物mRNA結(jié)構(gòu)BacterialmRNAincludesnon-translatedaswellastranslatedregions.Eachcodingregionhasitsowninitiationandterminationsignals.AtypicalmRNAmayhaveseveralcodingregions.第133頁,共167頁，2024年2月25日，星期天真核生物mRNA的特征穩(wěn)定：半衰期可達數(shù)小時至數(shù)天；mRNA多為單順反子；mRNA的5‘端都有一個帽子結(jié)構(gòu)；絕大多數(shù)真核生物mRNA具有poly(A)尾。真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)模式第134頁,共167頁，2024年2月25日，星期天mRNA具“帽子”結(jié)構(gòu)真核基因轉(zhuǎn)錄常從嘌呤核苷三磷酸(A,G)開始，第一個核苷酸保留5’三磷酸基團，以3’位與下一核苷酸5’位形成磷酸二酯鍵。轉(zhuǎn)錄起始序列可示為5’PPPAPNPNPNP...；轉(zhuǎn)錄后由鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶催化在5’加G，G與起始核苷酸是以5’-5’三磷酸鍵相連;這一結(jié)構(gòu)稱為“帽子”，5’GPPPAPNPNPNP...第135頁,共167頁，2024年2月25日，星期天“帽子”結(jié)構(gòu)甲基化第一個甲基位點在5‘端鳥嘌呤7位上，所有真核生物中均存在。具有該甲基化基團的帽子稱帽子0；甲基加到次末端堿基上，具有兩個甲基基團的帽子叫帽子1。；以帽子1為底物，在第三個堿基再加上一個甲基，則稱帽子2。在高等真核生物中，僅當該堿基是A的話，則在A的N6位上還有一個甲基第136頁,共167頁，2024年2月25日，星期天“帽子”結(jié)構(gòu)與甲基化的功能1）保護mRNA免遭5‘外切核酸酶的攻擊，增加mRNA穩(wěn)定性；2）使mRNA能與核糖體小亞基結(jié)合并開始合成蛋白質(zhì)，增加mRNA的可譯性；3）增加mRNA從核到細胞質(zhì)的運輸；4）增強mRNA的剪接效率。第137頁,共167頁，2024年2月25日，星期天mRNA具poly(A)尾大多數(shù)真核mRNA的3’端有多聚腺苷酸序列

；poly(A)序列不是DNA編碼，是轉(zhuǎn)錄后加上的；mRNA初進入細胞質(zhì)時，其poly(A)尾長度大致與核中長度相同，隨后逐漸縮短；單poly(A)尾長短并不影響其功能，poly(A)尾常結(jié)合了約78KDa的蛋白PABP。組蛋白mRNA不含poly(A)結(jié)構(gòu)。第138頁,共167頁，2024年2月25日，星期天mRNApoly(A)尾的功能防止mRNA降解，提高mRNA穩(wěn)定性；mRNA穿越核膜由細胞核進入細胞質(zhì)的必需形式。第139頁,共167頁，2024年2月25日，星期天poly(A)尾mRNA的分離Themostconvenienttechniqueistoimmobilizetheoligo(UordT)onasolidsupportmaterial.ThenwhenanRNApopulationisappliedtothecolumn,onlythepoly(A)+RNAisretained.ItcanberetrievedbytreatingthecolumnwithasolutionthatbreaksthebondingtoreleasetheRNA.第140頁,共167頁，2024年2月25日，星期天帽子結(jié)構(gòu)和PolyA尾巴的應用構(gòu)建全長cDNA文庫獲得基因的全長第141頁,共167頁，2024年2月25日，星期天cDNALibraryConstruction第142頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第143頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第144頁,共167頁，2024年2月25日，星期天總RNA編碼RNA占總量的4%前mRNA(hnRNA)mRNA非編碼RNA占總量的96%前rRNA前tRNA非編碼mRNAsnRNAsnoRNAscRNASmallRNAsiRNAmiRNApiRNA其他TypesofRNA第145頁,共167頁，2024年2月25日，星期天4、miRNA與siRNARNA干擾（RNAinterference,RNAi)作用是生物體內(nèi)一種通過雙鏈RNA分子在mRNA水平上誘導特異性序列基因沉默的過程。由于RNAi作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又成為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)第146頁,共167頁，2024年2月25日，星期天AnUnexpectedResultEctopicover-expressionofCHSandDFRgeneunexpectedlyobservedtocausesilencingofendogenoushomologousRNAs.這種現(xiàn)象被命名為協(xié)同抑制”cosuppression”或者是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing(PTGS)，1）RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)第147頁,共167頁，2024年2月25日，星期天AntisenseRNApar-1SueGuo,1995,

CornellUniversityMoleculeInjected %embryoniclethalityZC22(par-1)antisense 52ZC22(par-1)sense 54TSantisense 0Z1antisense 0H20 0第148頁,共167頁，2024年2月25日，星期天mex-3BdsRNANoinjectionNoprobeNoinjectionProbewithmex3AInjectmex3BantisenseProbewithmex-3AInjectmex3BdsRNAProbewithmex-3ADouble-strandedRNA-inducedRNAinterferencecausesdestructionofaspecificmRNAinC.elegans

Fire第149頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第150頁,共167頁，2024年2月25日，星期天DICERCleavesthelongdsRNAtomakesiRNAsRISCUsesthesiRNAsasguidestocleavetargetmRNAsWorkingModelforRNAiFromDyrxhoornetal,2003NatureReviews4,457

RDE-1andRDE-4als