09月18日細(xì)胞培養(yǎng)平臺課

李呼倫哈爾濱醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室前言根底研究工業(yè)化生產(chǎn)綿羊B乳腺細(xì)胞核易核卵融合卵綿羊C子宮多莉植入植入生產(chǎn)克隆多莉羊示意圖取出未受精卵去核電激體外胚胎發(fā)育綿羊A多莉克隆猴ParkIH,etal.Cell.2021Sep5;134(5):877-86.病毒組織培養(yǎng)疫苗生產(chǎn)

基因工程產(chǎn)品

層析和超濾別離、濃縮生物大分子常用的手段試管嬰兒靜止培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)生物反響器高密度培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)一、細(xì)胞培養(yǎng)方式二、體外培養(yǎng)的分類體外培養(yǎng)invitro細(xì)胞培養(yǎng)Cellculture組織培養(yǎng)Tissueculture器官培養(yǎng)Organculture

體外培養(yǎng)種類細(xì)胞培養(yǎng)〔Cellculture〕培養(yǎng)物是單細(xì)胞或群體細(xì)胞模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)?shù)臏囟群鸵欢ǖ臓I養(yǎng)條件下，使之生長生存維持結(jié)構(gòu)和功能的培養(yǎng)方法。組織培養(yǎng)〔Tissueculture〕方法同上，使用組織塊(0.5-1mm3)或薄片(0.2mm)器官培養(yǎng)〔Organculture〕三、組織與細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)缺點培養(yǎng)細(xì)胞攜帶有與體內(nèi)細(xì)胞同等的基因組，是分子生物學(xué)和基因工程學(xué)的研究對象和組成局部可同時提供大量生物性狀相似的實驗對象，耗資少，經(jīng)濟(jì)易于施加物理、化學(xué)和生物因素進(jìn)行實驗已成為生物制品、基因工程制品、單克隆抗體生產(chǎn)的必要手段局限性：組織和細(xì)胞離體以后，獨立生存在人工培養(yǎng)環(huán)境中，與體內(nèi)環(huán)境相比，仍有很大差異。故實驗結(jié)果不能推至體內(nèi)，輕易做出與體內(nèi)等同的結(jié)論四、組織與細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)特點體內(nèi)外細(xì)胞的差異：當(dāng)人工條件和體內(nèi)實際情況不完全相同時，細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，一旦失去神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，發(fā)生變化那么是必然。細(xì)胞最多見的表現(xiàn)是：返祖〔Atavism〕現(xiàn)象，即失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、分化減弱、細(xì)胞趨單一化、不死性、惡性狀態(tài)。細(xì)胞增殖和分化：是細(xì)胞生命進(jìn)化中所獲得的根本屬性，增殖使細(xì)胞數(shù)量增多；分化使機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能多樣化，最后演變成完整的有機(jī)體。五、培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)成纖維型細(xì)胞細(xì)胞體呈梭形或不規(guī)那么三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀成纖維細(xì)胞、心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞等上皮型細(xì)胞扁平不規(guī)那么多角形，中有圓形核，細(xì)胞緊密相連成單層膜消化管外皮細(xì)胞、肝、胰、肺泡上皮、血管內(nèi)皮等游走型細(xì)胞在支持物上散在生長，一般不連接成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活潑的游走或變形運動，速度快而且不規(guī)那么神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞多形型細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)

神經(jīng)組織細(xì)胞

懸浮型見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞和血液細(xì)胞胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長容易大量繁殖六、培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件營養(yǎng)生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-

滲透壓無污染無毒組織培養(yǎng)室的設(shè)施及條件壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒。用途廣電熱枯燥箱：干熱消毒〔160℃，2小時〕。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌。大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等外表消毒七、無菌操作無菌室的滅菌定期清掃無菌室實驗前滅菌實驗后滅菌實驗人員的無菌準(zhǔn)備肥皂洗手穿隔離衣酒精棉球擦手無菌操作中常犯的錯誤吸管、剪刀等碰到其他器皿無菌操作中常犯的錯誤正確的拿管姿勢錯誤的拿管姿勢拿吸管時手碰到無菌區(qū)無菌操作中常犯的錯誤培養(yǎng)基浸濕吸管底部的棉花八、細(xì)胞和組織培養(yǎng)將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。1、組織塊培養(yǎng)直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再參加培養(yǎng)基。2、細(xì)胞培養(yǎng)一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按要求以一定的量〔以每毫升細(xì)胞數(shù)表示〕接入培養(yǎng)器皿并直接參加培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長狀態(tài)。計數(shù)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)/ml=計數(shù)16格×稀釋倍數(shù)

×104細(xì)胞數(shù)/ml=計數(shù)16格個數(shù)/個數(shù)×稀釋倍數(shù)×104培養(yǎng)細(xì)胞的觀察每隔一定時間觀察一次是否生長良好形態(tài)是否正常有無污染培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿〔由酚紅指示劑指示〕定時檢查培養(yǎng)溫度和CO2濃度

概念原代培養(yǎng)直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)〔Subculture〕的細(xì)胞，便不再稱為原代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。傳代培養(yǎng)細(xì)胞長滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代〞。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株那么可無限地傳代下去。取材細(xì)胞培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作九、原代培養(yǎng)組織塊法新鮮取材的組織中細(xì)胞仍具有分裂增殖的能力。將組織切成小塊培養(yǎng)在模擬體內(nèi)的環(huán)境中，小塊組織的細(xì)胞可以游離出來，從培養(yǎng)液中吸取營養(yǎng)，繼續(xù)分裂生長。組織塊培養(yǎng)法適用范圍廣，常用于肝臟、皮膚、角膜、骨骼、韌帶、血管、神經(jīng)、心臟等器官和組織的培養(yǎng)。培養(yǎng)要點材料新鮮嚴(yán)格無菌操作剔除脂肪等附著組織組織塊剪小〔直徑﹤1mm〕擺放開〔間距﹥5mm〕常犯的錯誤操作中不換器械沖洗次數(shù)不夠組織碎片太大組織塊擺放太密培養(yǎng)液參加太多消化培養(yǎng)法培養(yǎng)要點組織剪碎至1mm3左右適宜的胰蛋白酶濃度〔通常為0.25%〕適宜的消化時間：消化時，待組織塊變得較疏松，顏色略白為止〔通常為37℃，20～40分鐘〕常犯的錯誤

水浴鍋未預(yù)熱組織塊太大胰蛋白酶消化缺乏或過度吹打用力過重常犯的錯誤

十、傳代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在原培養(yǎng)瓶內(nèi)別離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的操作叫傳代。為獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株，或大量的同種細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞形成致密的單層后需進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長的特點，傳代方法有3種懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心〔1000轉(zhuǎn)/分〕去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l/2～2/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代半懸浮生長細(xì)胞傳代此類細(xì)胞局部呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液貼壁生長細(xì)胞傳代方法吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液PBS洗一次參加1～2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn)〕靜置2～10min〔顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測〕吸去胰蛋白酶液，參加培養(yǎng)液用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液吸取1/10～1/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Trypsin消化細(xì)胞未消化細(xì)胞消化的細(xì)胞培養(yǎng)要點嚴(yán)格的無菌操作適度消化細(xì)胞培養(yǎng)中需要注意的問題培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長，不能盲目增加每單位體積的細(xì)胞濃度PH：初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4，培養(yǎng)過程應(yīng)不低于7.0培養(yǎng)瓶內(nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10細(xì)胞培養(yǎng)中需要注意的問題容積、深度、外表面積：培養(yǎng)液體積與外表面積的比例為0.2～0.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培養(yǎng)液〔2mm〕中生長較好；需要低濃度氧的,在深的培養(yǎng)液〔5mm〕中生長較好。去除死細(xì)胞溫度控制：動物細(xì)胞培養(yǎng)對溫度波動的敏感性很大。溫度低于36.5℃，細(xì)胞生長緩慢；溫度高于37.5℃，細(xì)胞存活力降低十一、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞凍存的意義

細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化

凍存細(xì)胞的理論根底當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶凍存和復(fù)蘇的原那么慢凍快融細(xì)胞凍存方法預(yù)先配制凍存液：90%血清10%DMSO〔二甲基亞砜〕取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，參加適量凍存液，用吸管吹打制成細(xì)胞懸液〔1×106～5×106細(xì)胞/ml)參加1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期慢凍程序細(xì)胞復(fù)蘇方法從液氮中取出凍存管，在37～38℃水浴中快速使其融化〔1分鐘左右〕5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上低速離心10分鐘去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞十二、ATCC入庫細(xì)胞要求

培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱

細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長特性

培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱〔一般要求不含抗生素〕、血清來源和含量

細(xì)胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等，融解后細(xì)胞生長特性

核型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無

無污染檢測：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等

物種檢測：檢測同工酶，主要為G6PD和LDH，以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測

免疫檢測：一兩種血清學(xué)檢測

細(xì)胞建立者：建立者姓名；檢測者姓