慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)

第第頁慢病毒包裝試驗(yàn)慢病毒包裝試驗(yàn)慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV1（人類免疫缺陷1型病毒）為基礎(chǔ)進(jìn)展起來的基因治療載體。慢病毒具有感染譜廣泛、可以有效感染分裂期和靜止期細(xì)胞、長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)，因此成為導(dǎo)入外源基因的有力工具?，F(xiàn)在慢病毒系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種細(xì)胞系的基因過表達(dá)、RNA干擾、microRNA討論以及活體動(dòng)物試驗(yàn)中。一、試驗(yàn)流程圖1、慢病毒包裝試驗(yàn)流程圖二、試驗(yàn)儀器與試驗(yàn)材料psPAX2質(zhì)粒，pMD2.G質(zhì)粒，pHBLVTM系列質(zhì)粒；293T細(xì)胞；wan全培育基；DH5α菌株；Stbl3菌株。三、試驗(yàn)步驟1.質(zhì)粒擴(kuò)增。將構(gòu)建好的慢病毒載體和包裝質(zhì)粒使用大抽試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的去內(nèi)毒素抽提，濃度建議不低于1μg/μl，A260/280在1.71.8間方可用于病毒包裝。推舉使用Qiagen大抽試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的大量去內(nèi)毒素抽提（質(zhì)粒質(zhì)量會(huì)極大影響后續(xù)轉(zhuǎn)染效率和病毒的滴度）。2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天，在10cm皿中接種生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，以第二天匯合度能達(dá)到30%～50%為宜。24h后轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前需要把DMEM和慢病毒包裝專用轉(zhuǎn)染試劑LentiFitTM恢復(fù)至室溫，使用前需搖勻。每個(gè)皿的質(zhì)粒成分如下：表1、慢病毒包裝轉(zhuǎn)染體系用于包裝的三個(gè)質(zhì)粒摩爾比通常為1:1:1，可以依據(jù)情況稍加調(diào)整。請(qǐng)參考LentiFitTM轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染后46h換新鮮培育基。3.病毒收集和離心。轉(zhuǎn)染后48h和72h分別兩次收集病毒上清（48h收集后置換新鮮培液），將收集的上清用0.45μm濾器過濾，然后放于超速離心管中，4℃，72000g離心120min。4.病毒重懸和保存。棄上清，500μl重懸液重懸病毒沉淀，一周內(nèi)使用則置于4℃保存，如需長時(shí)間存放需置于80℃或液氮罐保存。（注：實(shí)在重懸體積依據(jù)試驗(yàn)需求而定）5.滴度測定。在96孔板中鋪合適數(shù)量的293T細(xì)胞，第二天將慢病毒原液進(jìn)行梯度稀釋后分別感染293T細(xì)胞，感染24h后換成無病毒的培育液，感染72h后在熒光顯微鏡下察看結(jié)果，對(duì)熒光比例合適（10～30%之間）的孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。滴度計(jì)算公式為：滴度（TU/ml）=細(xì)胞數(shù)×熒光百分比×103/病毒原液體積四、注意事項(xiàng)1.慢病毒相關(guān)試驗(yàn)請(qǐng)?jiān)谏锇踩瘢˙L2級(jí)別）內(nèi)操作。2.操作病毒時(shí)請(qǐng)穿試驗(yàn)服，佩戴口罩和手套，盡量不要暴露雙手及手臂的皮膚。3.操作病毒時(shí)特別當(dāng)心病毒濺出。假如操作時(shí)超凈工作臺(tái)有bing毒污染，請(qǐng)立刻用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭、離心管、培育板、培育液請(qǐng)于84消毒液浸泡后統(tǒng)一處理。4.如需要離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，如有必要請(qǐng)用封口膜封口后離心。5.病毒相關(guān)的廢棄物需要特別收集，統(tǒng)一經(jīng)高溫滅菌處理。6.試驗(yàn)完畢用香皂清洗雙手。五、常見問題1.影響慢病毒出毒及滴度的原因有哪些？（1）質(zhì)粒。包毒前需要對(duì)包裝及表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行去內(nèi)毒素處理，濃度建議不低于1μg/μl，A260/280在1.71.8間；（2）轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒比例。要用轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性小的轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染時(shí)質(zhì)粒間比例得當(dāng)，建議三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)的摩爾比為1:1:1可依據(jù)目的基因大小進(jìn)行調(diào)整；（3）目的基因。一般慢病毒包裝的目的片段大小在3k以內(nèi)較為合適，大于3k會(huì)降低滴度或超過載體容量無法包裝、目的基因本身是否具有毒性也會(huì)影響慢病毒的出毒效率；（4）包裝細(xì)胞293T細(xì)胞的狀態(tài)。細(xì)胞出毒過程中的細(xì)胞活力是包裝成功及病毒滴度高處與低處的一個(gè)緊要環(huán)節(jié)，進(jìn)行包裝轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞前肯定要重視細(xì)胞是否干凈、飽滿立體感是否好、鋪板是否均勻，細(xì)胞密度在5060%時(shí)進(jìn)行包裝比較合適；（5）病毒收集：在24、48h察看細(xì)胞及熒光狀態(tài)，判定是否正常，轉(zhuǎn)染后48h和72h分別兩次收集病毒上清（48h收集后置換新鮮培液）。2.該如何選擇合適的慢病毒包裝質(zhì)粒？慢病毒常用的包裝系統(tǒng)是二代三質(zhì)粒系統(tǒng)，骨架質(zhì)粒pSPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G是明確的包裝質(zhì)粒。目的基因的表達(dá)質(zhì)粒需要依據(jù)試驗(yàn)需求進(jìn)行選擇，重要包括啟動(dòng)子、標(biāo)簽蛋白、熒光和抗性等元件。（1）目的基因的過表達(dá)通常選擇CMV/EF1a啟動(dòng)子，目的基因的干擾通常選擇U6啟動(dòng)子；（2）若需要穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選，則需攜帶PURO/BSD/NEO等抗性篩選基因；（3）后續(xù)需要察看慢病毒感染效率一般需要攜帶EGFP/mCherry等熒光蛋白