微生物學(xué)檢驗基本技術(shù)

1.葡萄糖代謝類型鑒別試驗(O/F或Hugh-Leifson,HL)

下層：蛋白陳1克氯化鈉0.5克

葡萄糖0.2克水100毫升1.6%浪甲酚紫(Brom。cresolpurple)乙

醇溶液0.1-0.2mL

PH=7.6注意：調(diào)完pH值后再加葡萄糖.

(1)原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加，稱為氧化型；能進(jìn)行無氧降

解的為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細(xì)菌為產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細(xì)菌無論在有氧或無氧環(huán)境中都

能分解葡萄糖，而氧化型細(xì)菌在無氧環(huán)境中則不能分解葡萄糖。本試驗又稱氧化發(fā)酵(O/F

或Hugh—Leifson,HL)試驗，可用于區(qū)別細(xì)菌的代謝類型。

(2)方法：挑取少許純培養(yǎng)物(不要從選擇性平板中挑取)接種2支HL培養(yǎng)管中，在其

中一管加入高度至少為0.5cm的無菌液體石蠟以隔絕空氣(作為密封管)，另一管不加

(作為開放管)。置30c孵箱孵育48h以上。

(3)結(jié)果：兩管培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸(顏色不變)為產(chǎn)堿型；兩管都產(chǎn)酸(變黃)為發(fā)酵型；

加液體石蠟管不產(chǎn)酸，不加液體石蠟管產(chǎn)酸為氧化型。

(4)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與其它非發(fā)酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細(xì)菌為發(fā)酵型，

非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌(發(fā)酵型)與微球菌(氧化型)。

2.氧化酶試驗

(1)原理：氧化酶乂稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)中的最終呼吸酶。此酶并

不直接與氧化酶試劑起反應(yīng)，而是先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使

對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。因此，本試驗結(jié)果與細(xì)胞色素C的存在有關(guān)。

(2)方法：取潔凈濾紙條，沾取菌落少許，加氧化酶試劑(10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水

溶液或10g/L鹽酸二甲基對苯二胺水溶液)1滴，Imin內(nèi)觀察結(jié)果。也可將試劑滴加到

菌落上進(jìn)行試驗。

(3)結(jié)果：陽性者立即變粉紅色，5-10s內(nèi)呈深紫色。無色為陰性。

(4)應(yīng)用：用于奈瑟菌屬的菌種鑒定，該屬細(xì)菌均陽性。此外，也用于氣單胞菌和假單胞

菌屬與腸桿菌科細(xì)菌的區(qū)別，氣單胞菌和假單胞菌屬為陽性，而腸桿菌科細(xì)菌陰性。莫

拉菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等均為陽性。

注意事項：①試驗時應(yīng)避免接觸含鐵物質(zhì)，以免出現(xiàn)假陽性。②10g/L鹽酸四甲基對苯

二胺或10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液為無色溶液，在空氣中易被氧化而失效，故應(yīng)

經(jīng)常更換新試劑，并盛于棕色瓶中，若試劑已變成深藍(lán)色，應(yīng)棄去不用。

3.克氏雙糖鐵或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基試驗

雙糖鐵培養(yǎng)基

成份：

下層：蛋白陳1克氯化鈉0.5克

葡萄糖0.2克瓊脂0.3-0.5克

水100毫升

將上述物質(zhì)混勻調(diào)PH7.6后加1.2%酚紅0.4毫升

上層：蛋白陳1克氯化鈉0.5克

乳糖1克硫代硫酸鈉0.03克

硫酸亞鐵0.02克瓊脂1克

水100毫升

制法：1將下層配好，分裝中號試管(1毫升)，塞好包扎，15磅高壓滅菌半小時，使凝

固后備用。

2制上層時，先將蛋白陳水制好，加入硫酸亞鐵，硫代硫酸鈉，加熱溶解PH8.1,

再加入酚紅分瓶，(每瓶300毫升，稱取瓊脂包扎滅菌，趁熱加入乳糖隔水煮沸30分鐘

或112℃消毒15分鐘)。

3取已制的下層管，每管用無菌法倒入上層液約1。5毫升，邊斜放置使成斜面，凝

固后備用。

標(biāo)準(zhǔn)：無菌試驗合格，接種大腸桿菌下層產(chǎn)酸產(chǎn)氣，上層產(chǎn)酸。

試驗過程與意義

(1)原理：克氏雙糖鐵(KIA)或三糖鐵瓊脂(TSI)培養(yǎng)基制成高層和短的斜面，其中葡萄糖

含量僅為乳糖或蔗糖的十分之一，若細(xì)菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄

糖產(chǎn)酸使pH降低，因此斜面和底層均先呈黃色，但因葡萄糖量較少，所生成的少量酸可

因接觸空氣而氧化，并因細(xì)菌生長繁殖利用含氮物質(zhì)生成堿性化合物，使斜面部分又變

成紅色；底層由于處于缺氧狀態(tài)，細(xì)菌分解葡萄糖所生成的酸類一時不被氧化而仍保持

黃色。細(xì)菌分解葡萄糖、乳糖或蔗糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使斜面與底層均呈黃色，且有氣泡。細(xì)

菌產(chǎn)生硫化氫時與培養(yǎng)基中的硫酸亞鐵作用，形成黑色的硫化鐵。

(2)方法：用接種針挑取待檢菌的菌落，先穿刺接種到KIA或TSI深層，距管底3?5mm

為止，再從原路退回，在斜面上自下而上劃線，置35℃孵育18?24h,觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：常見的KIA反應(yīng)有如下幾種：①斜面堿性/底層堿性：不發(fā)酵碳水化合物，系

不發(fā)酵菌的特征。如銅綠假單胞菌。②斜面堿性/底層酸性：葡萄糖發(fā)酵、乳糖(和TSI

中的蔗糖)不發(fā)酵，是不發(fā)酵乳糖菌的特征，如志賀菌。③斜面堿性/底層酸性(黑色)：

葡萄糖發(fā)酵、乳糖不發(fā)酵并產(chǎn)生硫化氫，是產(chǎn)生硫化氫不發(fā)酵乳糖菌的特征。如沙門菌、

亞利桑那菌、枸檬酸桿菌和變形桿菌等。④斜面酸性/底層酸性：葡萄糖和乳糖(和TSI

中的蔗糖)發(fā)酵，是發(fā)酵乳糖的大腸菌群的特征，如大腸埃希菌、克雷伯菌屬和腸桿菌

屬°

(4)應(yīng)用：鑒別腸道桿菌用。KIA或TSI對初分離出的、可疑為革蘭陰性桿菌鑒定特別有

用。其反應(yīng)模式是許多桿菌鑒定表的組成部分，也可作為觀察其他培養(yǎng)基反應(yīng)的有價值

的質(zhì)控依據(jù)。

4.0/129試驗

(1)原理：0/129(2,4二氨基-6,7-二異丙基喋唬)能抑制弧菌屬、發(fā)光桿菌屬和鄰單胞

菌屬細(xì)菌生長，而氣單胞菌屬和假單胞菌屬細(xì)菌則耐藥。

(2)方法：用棉拭子將待檢菌菌懸液均勻涂布于堿性瓊脂平板上，將10圈/片及150圖/片

的0/129診斷紙片貼于平板上，置35c孵育18-24h,觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：出現(xiàn)抑菌圈者表示敏感，無抑菌圈者為耐藥。

(4)應(yīng)用：主要用于弧菌屬、鄰單胞菌屬與氣單胞菌屬的鑒別，弧菌屬和鄰單胞菌屬菌為

敏感，氣單胞菌屬菌為耐藥。其它菌屬有發(fā)光桿菌屬為敏感，假單胞菌屬為耐藥。

5.觸酶試驗(H2O2)

(1)原理：觸酶又稱過氧化氫酶，具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫成為水和原子

態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。

(2)方法：取潔凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細(xì)菌，加3%H2O21滴，立即觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：若立即出現(xiàn)大量氣泡為陽性。無氣泡為陰性。

(4)應(yīng)用：大多需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故常用此試驗來

鑒定。此外，金氏桿菌屬的細(xì)菌也為陰性。分枝桿菌的鑒別則用耐熱觸酶試驗，結(jié)核分

枝桿菌為陰性，戈氏分枝桿菌和地分枝桿菌為陽性。

注意事項：①3%H2O2溶液要新鮮配制。②不宜用血瓊脂平板上生長的菌落，因紅細(xì)

胞含有觸酶，可致假陽性反應(yīng)，③取對數(shù)生長期的細(xì)菌。

4.苯丙氨酸脫氨酶試驗(phenylalanine)

(1)原理：測定細(xì)菌是否產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶。細(xì)菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫

氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。若延長時間，會引起退色。

⑵方法：將待檢菌大量接種入苯丙氨酸培養(yǎng)基中，35c孵育18?24h,滴加100g/L三氯

化鐵試劑4?5滴，立即觀察菌落生長處有無綠色出現(xiàn)。

⑶結(jié)果：有綠色出現(xiàn)為陽性。

(4)應(yīng)用：變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽性，腸桿菌科其它細(xì)菌均為陰性。

4.0一半乳糖甘酶試驗(ONPG試驗)

(1)原理：乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和「一半乳糖甘酶才能快速分解。有些細(xì)菌只

有半乳糖甘酶，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細(xì)菌均可快速

水解鄰硝基酚-0-D-半乳糖昔(O-nitrophenyl-P-D-galactopyranoside,ONPG)而生成黃色的

鄰硝基酚。用于枸檬酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。

(2)方法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35℃水浴或孵箱孵育18?24h,觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。

(4)應(yīng)用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細(xì)菌的快速鑒定，本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌均

可短時間內(nèi)呈現(xiàn)陽性。埃希菌屬、枸檬酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌

屬和腸桿菌屬等均為試驗陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。

檸檬酸鹽

1.枸椽酸鹽利用試驗

(1)原理：某些細(xì)菌能利用枸椽酸鹽作為唯一碳源，而在此培養(yǎng)基上生長，并分解枸椽酸

鹽生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性。

(2)方法：將待檢菌接種于枸椽酸鹽培養(yǎng)基上，置35℃孵育1?4d,逐日觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果：若用溪麝香草酚蘭指示劑，斜面出現(xiàn)菌落或菌苔，培養(yǎng)基變藍(lán)色為陽性；無菌

落生長，培養(yǎng)基綠色為陰性。

(4)應(yīng)用：可用此試驗作細(xì)菌種屬間鑒定。埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌

屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常陽性，粘質(zhì)和液化沙雷菌和某些變形桿菌及枸

檬酸桿菌陽性。此外，銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌和嗜水氣單胞菌也能利用枸檬

酸鹽。

Gramnegativerodsidentification

isolatedfromfish

Cytochromeoxidase

+-

GlucoseutilizationAlsonegativefor:lactose

phenylalaninedeaminase

OxidizerFermentercitrate

(nonfermenter)

0/129

Indoleand

SensitiveResistant

PseudomonasHydrogensulfide

/I

NovobiocinAeromonas

tarda4^

SensitiveResistantEdwardsiella

Motilityat30°C

VibrioPlesiomonasshigelloides

YersiniaruckeriEdwardsiellaictaluri

[T7

微生物學(xué)檢驗基本技術(shù)

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及相關(guān)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各學(xué)科相互交叉和滲透，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)檢驗技術(shù)

已深入到細(xì)胞、分子和基因水平，許多新技術(shù)、新方法已在臨床微生物實驗室得到廣泛

應(yīng)用。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗室的基本任務(wù)之一是利用微生物學(xué)檢驗技術(shù)，準(zhǔn)確、快速檢驗

和鑒定臨床標(biāo)本中的微生物，并對引起感染的微生物進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，為臨床對感染性

疾病診斷、治療、流行病學(xué)調(diào)查及研究等提供科學(xué)依據(jù)。

第一節(jié)微生物形態(tài)學(xué)檢查

細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查是細(xì)菌檢驗的重要方法之一，它是細(xì)菌分類和鑒定的基礎(chǔ)，可根據(jù)其形

態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色反應(yīng)性等，為進(jìn)一步鑒定提供參考依據(jù)。

一、顯微鏡檢查

由于細(xì)菌個體微小，肉眼不能看到，必須借助顯微鏡的放大才能看到。一般形態(tài)和結(jié)構(gòu)

可用光學(xué)顯微鏡觀察，其內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)則需用電子顯微鏡才能看清楚。常用顯微鏡有

如下兒種。

1.普通光學(xué)顯微鏡

采用自然光或燈光為光源，其波長約為0.%um顯微鏡的分辨率為波長的二分之一,

即0.2pim,而肉眼可見的最小形象為0.2mm。故用油（浸）鏡放大1000倍、能將0.2pm

的微粒放大成肉眼可見的0.2mm。普通光學(xué)顯微鏡可用于細(xì)菌、放線菌和真菌等的觀察。

2.暗視野顯微鏡

常用于觀察不染色微生物形態(tài)和運動。在普通顯微鏡安裝暗視野聚光器后，光線不能從

中間直接透入，視野呈暗色，當(dāng)標(biāo)本接受從聚光器邊緣斜射光后可發(fā)生散射，因此可在

暗視野背景下觀察到光亮的微生物如細(xì)菌或螺旋體等。

3.相差顯微鏡

相差顯微鏡利用相差板的光珊作用，改變直射光的光位相和振幅，將光相的差異轉(zhuǎn)換為

光強(qiáng)度差。在相差顯微鏡下，當(dāng)光線透過不染色標(biāo)本時，由于標(biāo)本不同部位的密度不一

致而引起光相的差異，可觀察到微生物形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和運動方式等。

4.熒光顯微鏡

熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡基本相同，主要區(qū)別在于光源、濾光片和聚光器。目前大

多數(shù)使用的是落射光裝置，常用高壓汞燈作為光源，可發(fā)出紫外光或藍(lán)紫光。濾光片有

激發(fā)濾光片和吸收濾光片二種。用藍(lán)光的熒光顯微鏡除可用一般明視野聚光器外，也可

用暗視野聚光器，以加強(qiáng)熒光與背景的對比。本法適用于對熒光色素染色或與熒光抗體

結(jié)合的細(xì)菌的檢測或鑒定。

5.電子顯微鏡

用電子流作為光源，波長與可見光相比差兒萬倍，大大提高了分辨力，并用磁性電圈作

為光學(xué)放大系統(tǒng)，放大倍數(shù)可達(dá)數(shù)萬倍或幾十萬倍，常用于病毒顆粒和細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的

觀察。

二、不染色標(biāo)本檢查

不染色標(biāo)本一般可用于觀察細(xì)菌形態(tài)、動力及運動情況。細(xì)菌未染色時無色透明，在顯

微鏡下主要靠細(xì)菌的折光率與周圍環(huán)境的不同來進(jìn)行觀察。有鞭毛的細(xì)菌運動活潑，無

鞭毛的細(xì)菌則呈不規(guī)則布朗運動。梅毒蒼白密螺旋體、鉤端螺旋體、彎曲桿菌等的活菌

各有特征鮮明的形態(tài)和運動方式，具有診斷意義。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細(xì)

管法等。

1.懸滴法

在潔凈凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液放在蓋玻片中央，再將凹

玻片的凹孔對準(zhǔn)蓋玻片中央的液滴并蓋上，然后迅速翻轉(zhuǎn)，輕壓蓋玻片，使其與凹孔邊

緣的凡士林粘緊封閉后置高倍鏡下（或暗視野）觀察。

2.壓滴法

用接種環(huán)取--環(huán)菌懸液置于潔凈玻片的中央，在菌懸液上輕輕蓋上一蓋玻片，注意避免

產(chǎn)生氣泡并防止菌懸液外溢，靜止數(shù)秒鐘后置高倍鏡下明視野（或暗視野）觀察。

3.毛細(xì)管法

主要用于厭養(yǎng)菌動力的檢查。通常選用60?70mm長。0.5?1.0mm孔徑的毛細(xì)管虹吸厭養(yǎng)

菌懸液后，用火焰將毛細(xì)管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細(xì)管固定在載玻片上，置高倍鏡

下暗視野觀察。

三、染色標(biāo)本檢查

細(xì)菌標(biāo)本經(jīng)染色后，由于細(xì)菌與周圍環(huán)境間在顏色上形成鮮明對比，故在普通光學(xué)顯微

鏡下可清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)特征（如細(xì)菌的大小、形狀、排列等）和某些特殊結(jié)構(gòu)

（如莢膜、鞭毛、芽袍等），并可根據(jù)染色反應(yīng)性對細(xì)菌加以分類鑒定。

（一）細(xì)菌染色的一般程序

細(xì)菌染色的一般程序是：涂片（干燥）一固定一染色（媒染）一（脫色）一（復(fù)染）。

1.涂片制備

血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養(yǎng)物，直接在載玻片上作薄膜涂片；尸檢或感

染動物組織，病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養(yǎng)基上的菌落或菌苔的制片,

先用接種環(huán)取環(huán)生理鹽水置載玻片中央，再用無菌接種環(huán)取少量的培養(yǎng)物在生理鹽水

中磨勻，涂布成lcm2大小的涂面，置室溫下自然干燥或遠(yuǎn)火慢慢烘干。

2.固定

目的是殺死細(xì)菌，凝固細(xì)菌蛋白及結(jié)構(gòu)，便于染色；促使細(xì)菌粘附在載玻片上，避免在

水洗過程中被水沖掉；改變細(xì)菌對染料的通透性，有利于菌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的染色。通常用

火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。

3.染色

根據(jù)檢驗?zāi)康牟煌?，選擇不同的染色方法進(jìn)行染色。染色時滴加染液，以復(fù)蓋標(biāo)本為度。

4.媒染

凡能增強(qiáng)染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細(xì)胞膜通透性改變的物

質(zhì)，稱媒染劑。常用的有明磯、糅酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進(jìn)著色。媒染劑

可用于初染與復(fù)染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

5.脫色

凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學(xué)試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。

脫色劑可以查出細(xì)菌與染料結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。

6.復(fù)染

已脫色處理的細(xì)菌或其結(jié)構(gòu)常以復(fù)染液作復(fù)染以便于觀察。復(fù)染液與初染液的顏色不同

而成一鮮明對比。復(fù)染不宜太強(qiáng)，以免掩蓋初染的顏色。

（二）常用染色法（染液配方見第8章）

單染色法

只用一種染料染色。由于大多數(shù)細(xì)菌胞漿內(nèi)含有酸性物質(zhì)，可與堿性染料結(jié)合，故常用

呂氏美藍(lán)、結(jié)晶紫和稀釋石碳酸復(fù)紅等染液。此法可觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)與排列，不

能顯示細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與染色特性。

2.復(fù)染色法

用兩種或兩種以上不同染料可將細(xì)菌染成不同的顏色，除可觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)與排

列外，還反應(yīng)出細(xì)菌染色特性，具有鑒別細(xì)菌種類的價值。常用的有革蘭染色法和抗酸

染色法。

（1）革蘭染色：①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加結(jié)晶紫染液染Imin,清水沖去染液。②加

碘液媒染lmin,水洗，甩干。③用95%乙醇脫色，輕輕搖動約30s,至無紫色洗落為止,

水洗，甩干。④加稀釋石碳酸復(fù)紅或沙黃染液數(shù)滴進(jìn)行復(fù)染，約30s,水洗。⑤干后顯微

鏡下鏡檢觀察結(jié)果，革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。

（2）抗酸染色：萋-尼億iehl-Neelse）抗酸染色法：①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加石炭酸復(fù)

紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現(xiàn)，切不可沸騰。染液因蒸發(fā)減少時，應(yīng)隨時補(bǔ)充，防止

染液蒸干。持續(xù)染5min（奴卡菌需要加長時間），水洗，甩干。②滴加3%鹽酸乙醇脫

色，不時搖動玻片至無紅色脫落為止，水洗，甩干。③加呂氏美藍(lán)復(fù)染液數(shù)滴復(fù)染Imin,

水洗。④干后顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍(lán)色。

金胺O-羅丹明B染色法：①細(xì)菌涂片固定后加第1液30?90s。②棄去第1液后加第2

液染15min。③用第3液脫色1?2min,水洗。④滴加第4液染30s,水洗，⑤干后置熒

光顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果在淡藍(lán)色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。

3.特殊染色法

（1）鞭毛染色（改良Ryu法）：①玻片的處理將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時

取出，以干凈紗布擦干。②在玻片上滴蒸餌水1滴。③挑取培養(yǎng)物少許，輕觸蒸儲水滴

頂部，僅允許極少量細(xì)菌進(jìn)入水滴，不可攪動，以免鞭毛脫落。④置35℃孵箱自然干燥,

不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1?2min輕輕水洗。⑤干后顯微鏡鏡檢觀察結(jié)果鞭毛

和菌體呈紫色。

（2）異染顆粒染色（阿爾培托法）：①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加甲液染色3?5min。水洗。

②滴加乙液，染Imin。水洗。③干后顯微鏡鏡檢觀察結(jié)果菌體呈綠色，異染顆粒呈藍(lán)

黑色，用于白喉棒狀桿菌染色。

（3）莢膜染色：①奧爾特莢膜染色法：將已固定的細(xì)菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰

加溫染色，持續(xù)3min,冷卻后水洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法

主要用于碳疽芽胞桿菌。②Hiss氏硫酸銅法：染液：第一液為結(jié)晶紫乙醇飽和液5ml加

蒸你水95ml的混合液；第二液為20%硫酸銅水溶液。方法：細(xì)菌涂片自然干燥，乙醇固

定。滴加第一液，微加熱染Imin。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫

酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。結(jié)果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍(lán)色或不著色。

（4）芽胞染色：染液：第一液為萋一納氏石炭酸復(fù)紅液，第二液為95%乙醇，第三液為

堿性美藍(lán)液。方法：將已固定的細(xì)菌涂片滴加第一液，微加熱染5min,冷卻后水洗。用

第二液脫色2min,水洗。加第三液復(fù)染Imin,水洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈藍(lán)色，芽

胞呈紅色。

4.負(fù)染色法

背景蓊色而菌體本身不著色的染色為負(fù)染色法。最常見的是墨汁負(fù)染色法，用來觀察真

菌及細(xì)菌莢膜等。在標(biāo)本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片（勿產(chǎn)生氣泡），輕壓。在低

倍鏡下尋找有莢膜的菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)高倍鏡或油鏡確認(rèn)，如新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜,

背景為黑色。

5.熒光染色法

經(jīng)熒光素染色的細(xì)菌，或熒光素標(biāo)記的熒光抗體與相應(yīng)抗原的細(xì)菌、病毒結(jié)合形成的復(fù)

合物，在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。

微生物培養(yǎng)與分離方法

大多數(shù)細(xì)菌均可以通過人工方法培養(yǎng)，而衣原體和病毒的分離培養(yǎng)往往需要活組織、雞

胚、特殊細(xì)胞株及動物接種。只有將微生物培養(yǎng)出來才能對它進(jìn)行研究、鑒定和應(yīng)用。

一、接種與分離方法

根據(jù)待檢標(biāo)本的性質(zhì)、培養(yǎng)目的和所用培養(yǎng)基的種類，采用不同的接種方法。

1.平板劃線分離培養(yǎng)法

對混有多種細(xì)菌的臨床標(biāo)本，采用劃線分離和培養(yǎng)，使原來混雜在一起的細(xì)菌沿劃線在

瓊脂平板表面分離，得到分散的單個菌落，以獲得純種。臨床送檢的標(biāo)本如痰、咽試子、

泌尿生殖道的分泌物和糞便等細(xì)菌檢驗均需要借助瓊脂平板劃線分離目的菌。平板劃線

分離法通常有兩種方法：

（1）分區(qū)劃線分離法：此法常用于含菌量較多的標(biāo)本如痰、泌尿生殖道的分泌物和糞便

或混合細(xì)菌的分離。先用接種環(huán)挑取標(biāo)本涂布于瓊脂平板1區(qū)（占培養(yǎng)基總面積的％）并

作數(shù)條劃線，再于2、3、4區(qū)依次劃線。每劃完一個區(qū)域，均將接種環(huán)燒灼滅菌1次，

冷后再劃下一區(qū)域，每一區(qū)域的劃線均與上一區(qū)域的劃線交接1~3次。一個成功分區(qū)劃

線的平板，培養(yǎng)后分別觀察1區(qū)形成菌苔，2區(qū)菌落連成線，3區(qū)和4區(qū)可分離到單個菌

落。

（2）連續(xù)劃線分離法：此法常用于含菌量不多的標(biāo)本或培養(yǎng)物中的細(xì)菌分離培養(yǎng)。方法

是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕涂抹，然后再用接種環(huán)或拭子在平板表面曲線連

續(xù)劃線接種，直至劃滿瓊脂平板表面。

瓊脂斜面接種法

主要用于菌落的移種，以獲得純種進(jìn)行鑒定和保存菌種等。用接種環(huán)（針）挑取單個菌

落或培養(yǎng)物，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一條直線，然后再從底部沿直線向上曲折連續(xù)劃

線，直至斜面近頂端處止。生化鑒定培養(yǎng)基斜面接種，用接種針挑取待鑒定細(xì)菌的菌落,

從斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種。

3.穿刺接種法

此法多用于半固體培養(yǎng)基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養(yǎng)基接種，半固體培養(yǎng)基的穿

刺接種可用于觀察細(xì)菌的動力。接種時用接種針挑取菌落，由培養(yǎng)基中央垂直刺入至距

管底0.4cm處，再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養(yǎng)基，穿刺高

層部分，退出接種針后直接劃線接種斜面部分。

4.液體培養(yǎng)基接種法

用于各種液體培養(yǎng)基如肉湯、蛋白陳水、糖發(fā)酵管等的接種。用接種環(huán)挑取單個菌落，

傾斜液體培養(yǎng)管，在液面與管壁交界處研磨接種物（以試管直立后液體淹沒接種物為準(zhǔn)）。

此接種法應(yīng)避免接種環(huán)與液體過多接觸，更不應(yīng)在液體中混勻、攪拌，以免形成氣溶膠,

造成實驗室污染。

5.傾注平板法

本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等標(biāo)本中的細(xì)菌計數(shù)。取純培養(yǎng)物的稀釋或原標(biāo)

本1ml至無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再將已融化并冷卻至45?50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基15?20ml傾注

入該無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，混勻，待凝固后置37c培養(yǎng)，長出菌落后進(jìn)行菌落計數(shù)，以求出每

毫升標(biāo)本中所含菌數(shù)。先數(shù)6個方格（每格為lcm2）中菌落數(shù)，求出每格的平均菌落數(shù),

并算出平皿直徑，然后按下列公式計數(shù)，求出每毫升標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)。

全平板菌落數(shù)=每方格的平均菌落數(shù)x“r2

每ml標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)=全平板菌落數(shù)x稀釋倍數(shù)

6.涂布接種法

本法多用于紙片擴(kuò)散法藥敏試驗的細(xì)菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養(yǎng)基表

面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復(fù)涂布，使被接種液均勻分布于

瓊脂表面，然后貼上藥敏紙片，或直接培養(yǎng)，本法經(jīng)培養(yǎng)后細(xì)菌形成菌苔。

二、細(xì)菌的培養(yǎng)方法

根據(jù)不同的標(biāo)本及不同的培養(yǎng)目的，可選用不同的培養(yǎng)方法。通常把細(xì)菌的培養(yǎng)方

法分為需氧培養(yǎng)、二氧化碳培養(yǎng)、微需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)四種。

j需氧培養(yǎng)

是指需氧3或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養(yǎng)，將已接種好的平板、斜面、液體培養(yǎng)基

等在空氣中置35c孵育箱內(nèi)孵育18?24h,無特殊要求的細(xì)菌均可生長。少數(shù)生長緩慢的

細(xì)菌需要培養(yǎng)3-7d甚至1個月才能生長。為使孵育箱內(nèi)保持一定的濕度，可在其內(nèi)放置

一杯水。對培養(yǎng)時間較長的培養(yǎng)基，接種后應(yīng)將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士

林封固，以防培養(yǎng)基干裂。

2.二氧化碳培養(yǎng)

某些細(xì)菌，如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、布魯氏菌和流感嗜血桿菌等的

培養(yǎng)，特別是在初次分離時，須在5%?10%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)才能生長。常用的培養(yǎng)

法如下。

（1）二氧化碳培養(yǎng)箱法：二氧化碳孵箱能自動調(diào)節(jié)二氧化碳的含量、溫度和濕度，培養(yǎng)

物置于孵育箱內(nèi)閣，孵育一定時間后可直接觀察生長結(jié)果。

（2）燭缸培養(yǎng)法：取有蓋磨口標(biāo)本缸或玻璃干燥器，將接種好的培養(yǎng)基放入缸內(nèi)，點燃

蠟燭后放在缸內(nèi)稍高于培養(yǎng)物的位置上，缸蓋或缸口均涂以凡士林，加蓋密閉。因缸內(nèi)

蠟燭燃燒氧逐漸減少，數(shù)分鐘后蠟燭自行熄滅，此時容器內(nèi)二氧化碳含量約占5%?10%。

將缸置于35℃普通孵育箱內(nèi)孵育。

（3）氣袋法：選用無毒透明的塑料袋，將已接種標(biāo)本的培養(yǎng)皿放入袋內(nèi)，盡量祛除袋內(nèi)

空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉狀態(tài)，執(zhí)斷袋內(nèi)已置的二氧化碳

產(chǎn)氣管（安甑）產(chǎn)生二氧化碳，數(shù)分鐘內(nèi)就可達(dá)到需要的二氧化碳培養(yǎng)環(huán)境，置于35c

孵育箱內(nèi)孵育。

（4）化學(xué)法：常用碳酸氫鈉-鹽酸法。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比

例，分別置容器內(nèi)，連同容器置于玻璃缸內(nèi)，蓋緊密封，傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接

觸而生成二氧化碳。于35c孵育箱內(nèi)孵育。

3.微需氧培養(yǎng)

微需氧菌培養(yǎng)在大氣中及絕對無氧環(huán)境中均不能生長，在含有5%-6%氧氣，5%-10%-

氧化碳和85%氮氣的氣體環(huán)境中才可生長，將標(biāo)本接種到培養(yǎng)基上，置于上述氣體環(huán)境

中，35c進(jìn)行培養(yǎng)即微需氧培養(yǎng)法。

厭氧菌對氧敏感，培養(yǎng)過程中需造成低氧化還原電勢的厭氧環(huán)境。厭氧培養(yǎng)常用的方法

有：物理法、化學(xué)法、生物法。如厭氧罐培養(yǎng)法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生

厭氧法等。

三、細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長特性

1.固體培養(yǎng)基

標(biāo)本或液體培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基表面后，單個細(xì)菌經(jīng)分裂繁殖可形成一個肉眼

可見的細(xì)菌集團(tuán)，稱為菌落（colony）。

（1）菌落的形態(tài)特征：大小、形狀（露滴狀、圓形、菜花樣、不規(guī)則等）、突起或扁

平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等）、顏色（紅色、灰白色、黑色、綠

色、無色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和

粘度等。據(jù)細(xì)菌菌落表面特征不同，可將菌落分為3型：①光滑型菌落（S型菌落）：

菌落表面光滑、濕潤、邊緣整齊，新分離的細(xì)菌大多呈光滑型菌落。②粗糙型菌落（R

型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S

型細(xì)菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質(zhì)形成。R型細(xì)菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力

都比S型細(xì)菌弱。但也有少數(shù)細(xì)菌新分離的毒力株就是R型，如炭疽抱桿菌;結(jié)核分枝

菌等。③粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐

富粘液層的細(xì)菌、結(jié)核桿菌等。

（2）菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。①a溶血：又稱草綠色溶血，菌落周

圍培養(yǎng)基出現(xiàn)1?2mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致；②。溶血：又稱完全溶血，菌

落周圍形成一個完全清晰透明的溶血環(huán)，是細(xì)菌產(chǎn)生的溶血素使紅細(xì)胞完全溶解所致；

③y溶血：即不溶血，菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化，紅細(xì)胞沒有溶解或缺損。（3）色素：

有些細(xì)菌產(chǎn)生水溶性色素，使菌落和周圍的培養(yǎng)基出現(xiàn)綠色、金黃色、白色、橙色、檸

檬色等顏色，產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性。

（4）氣味：某些細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長繁殖后可產(chǎn)生特殊氣味，如銅綠假單胞菌（生姜氣味）、

變形桿菌（巧克力燒焦的臭味）、厭氧梭菌（腐敗的惡臭味）、白色假絲酵母菌（酵母

味）和放線菌（泥土味）等。

2.液體培養(yǎng)基

細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中有3種生長現(xiàn)象：大多數(shù)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基生長繁殖后呈均勻混濁;

少數(shù)鏈狀排列的細(xì)菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長；枯草芽胞桿菌、結(jié)核分

枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長，常形成菌膜。

3.半固體培養(yǎng)基

半固體培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌動力試驗，有鞭毛的細(xì)菌除了沿穿刺線生長外，在穿刺線兩

側(cè)也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長。無鞭毛的細(xì)菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長，穿

刺線兩邊的培養(yǎng)基仍然澄清透明，為動力試驗陰性。

細(xì)菌的生物化學(xué)試驗

各種細(xì)菌具有各自獨特的酶系統(tǒng)，因而對底物的分解能力不同，其代謝產(chǎn)物也不同。

用生物化學(xué)方法測定這些代謝產(chǎn)物，可用來區(qū)別和鑒定細(xì)菌的種類。利用生物化學(xué)方法

來鑒別不同細(xì)菌，稱為細(xì)菌的生物化學(xué)試驗或稱生化反應(yīng)。生物化學(xué)試驗的方法很多，

主要有以下兒類。

一、碳水化合物的代謝試驗

1.糖（醇、甘）類發(fā)酵試驗

（1）原理：不同種類細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖（醇、甘）類的酶，因而對各種糖（醇、

甘）類的代謝能力也有所不同，即使能分解某種糖（醇、甘）類，其代謝產(chǎn)物可因菌種

而異。檢查細(xì)菌對培養(yǎng)基中所含糖（醇、甘）降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，可用以鑒

定細(xì)菌種類。

（2）方法：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（如酚紅肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH7.4）加入0.5?1.0%（w/v）的

特定糖（醇、甘）類。所使用的糖（醇、甘）類有很多種，根據(jù)不同需要可選擇單糖、

多糖或低聚糖、多元醇和環(huán)醇等，見表6-4-1。將待鑒定的純培養(yǎng)細(xì)菌接種入試驗培養(yǎng)基

中，置35c孵育箱內(nèi)孵育數(shù)小時到兩周（視方法及菌種而定）后，觀察結(jié)果。若用微量

發(fā)酵管，或要求培養(yǎng)時間較長時，應(yīng)注意保持其周圍的濕度，以免培養(yǎng)基干燥。

（3）結(jié)果：能分解糖（醇、甘）產(chǎn)酸的細(xì)菌，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)（如酚紅

變?yōu)辄S色），產(chǎn)氣的細(xì)菌可在小倒管（Durham小管）中產(chǎn)生氣泡，固體培養(yǎng)基則產(chǎn)生裂

隙。不分解糖則無變化。

試驗，

主要的

驗中最

反應(yīng)試

生化

細(xì)菌的

是鑒定

驗，

酵試

）類發(fā)

醇、昔

糖（

用：

（4）應(yīng)

，大

乳糖

發(fā)酵

不能

，但

萄糖

酵葡

菌可發(fā)

如沙門

）類，

醇、甘

的糖（

酵不同

菌可發(fā)

不同細(xì)

結(jié)果也

其發(fā)酵

類，

一種糖

發(fā)酵同

菌均可

兩種細(xì)

即便是

乳糖。

萄糖和

發(fā)酵葡

則可

希菌

腸埃

產(chǎn)

酸、

則產(chǎn)

后者

，而

產(chǎn)酸

者僅

但