(2012年)第十四章-維生素

第十四章維生素類藥物的分析TheAnalysisofVitamines

第一節(jié)概述第二節(jié)維生素A的分析第三節(jié)維生素B1的分析第四節(jié)維生素C的分析第五節(jié)維生素D的分析第六節(jié)維生素E的分析第七節(jié)復(fù)方制劑中多種維生素的分析

一、概念維生素：是維持人體正常代謝功能所必需的一類生物活性物質(zhì)。人體不能合成維生素，必須從食物中攝取。第一節(jié)概述如果人體缺少某種維生素，就會(huì)引起維生素缺乏癥，而影響人體的正常生理機(jī)能。例如:VA

缺乏—夜盲癥

VB1缺乏—腳氣病二、分類

VitA、D2、D3、E、K1

等

脂溶性水溶性

VitB族(B1、B2、B6、B12)

VitC、葉酸、煙酸、泛酸等。

公元前3500年-古埃及人發(fā)現(xiàn)能防治夜盲癥的物質(zhì)，也就是后來(lái)的維A。

1600年-醫(yī)生鼓勵(lì)以多吃動(dòng)物肝臟來(lái)治夜盲癥。

1747年-蘇格蘭醫(yī)生林德發(fā)現(xiàn)檸檬能治壞血病，也就是后來(lái)的維C。

1831年-胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)。

1905年-甲狀腺腫大被碘治愈。

1911年-波蘭化學(xué)家豐克為維生素命名。

1916年-維生素B被分離出來(lái)。

1917年-英國(guó)醫(yī)生發(fā)現(xiàn)魚(yú)肝油可治愈佝僂病，隨后斷定這種病是缺乏維D引起的。

維生素發(fā)展史1920年-發(fā)現(xiàn)人體可將胡蘿卜轉(zhuǎn)化為維生素A。

1922年-維E被發(fā)現(xiàn)。

1928年-科學(xué)家發(fā)現(xiàn)維B至少有兩種類型。

1933年-維E首次用于治療。

1948年-大劑量維C用于治療炎癥。

1954年-自由基與人體老化的關(guān)系被揭開(kāi)。

1969年-體內(nèi)超級(jí)抗氧化酶被發(fā)現(xiàn)。

1970年-維C被用于治療感冒。

1993年-哈佛大學(xué)發(fā)表維生素E與心臟病關(guān)系的研究結(jié)果。第二節(jié)維生素A的分析-H維生素A醇；維生素A1；視黃醇-COCH3維生素A醋酸酯(Ch.P)-COC15H31維生素A棕櫚酸酯R:

1.共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯

一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)具有UV吸收維生素A的最大吸收波長(zhǎng)在325~328nm，利用這一性質(zhì)可以對(duì)維生素A進(jìn)行鑒別或含量測(cè)定。具有多種立體異構(gòu)體天然的維生素A側(cè)鏈上的所有雙鍵都為全反式的。維生素.ppt#133.幻燈片133VitA2VitA3易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應(yīng)VitA1鯨醇(無(wú)活性)△或有金屬離子存在時(shí)氧化↑2.共軛多烯側(cè)鏈－－－性質(zhì)非常活潑環(huán)氧化物VitA醛VitA酸3.溶解性

水中不溶，與氯仿、乙醚、環(huán)己烷或石油醚能任意混合，乙醇中微溶。4.與三氯化銻呈色應(yīng)用：鑒別、含量測(cè)定條件無(wú)水無(wú)醇CHCl3二、鑒別反應(yīng)（一）三氯化銻反應(yīng)藍(lán)色紫紅方法取維生素A油溶液1滴，加三氯甲烷10ml振搖使溶解；取出2滴，加三氯甲烷2ml與25％三氯化銻的三氯甲烷溶液0.5ml，即顯藍(lán)色，漸變?yōu)樽霞t色。（二）紫外分光光度法

無(wú)水乙醇－鹽酸（100：1）

維生素A

326nm△350～390nm有3個(gè)吸收峰

脫水維生素A去水VitA（VitA3）↓VitAUSP

顯色劑磷鉬酸規(guī)定斑點(diǎn)顏色和Rf值BP

對(duì)照品法顯色劑三氯化銻（三）薄層色譜法與對(duì)照品比較，確認(rèn)本品是醇還是酯，是醋酸酯還是棕櫚酸酯。三、含量測(cè)定

（一）紫外分光光度法

（二）三氯化銻比色法（三）HPLC立體異構(gòu)體氧化降解產(chǎn)物合成中間體副產(chǎn)物（一）UV法維生素A2維生素A3環(huán)氧化物維生素A醛維生素A酸（一）紫外分光光度法---三點(diǎn)校正法

1.三點(diǎn)校正法的建立維A共軛多烯的結(jié)構(gòu)：在325～328nm具有最大吸收。維A中的其他雜質(zhì)與稀釋用油：在紫外區(qū)也有吸收，對(duì)測(cè)定有影響。

2.測(cè)定原理（1）物質(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性，即

（2）維生素A中雜質(zhì)的無(wú)關(guān)吸收在

310~340nm范圍內(nèi)可看作是直線，且隨波長(zhǎng)的增大吸收度下降。

3.波長(zhǎng)的選擇：（1）

1

VitA的max（328nm）（2）

2

3

分別在

1的兩側(cè)各選一點(diǎn)測(cè)定對(duì)象(Ch.P)VitA醋酸酯第一法等波長(zhǎng)差法

=12nm第二法等吸光度法測(cè)定對(duì)象(Ch.P)

VitA醇

1=325nm,2=310nm,3=334nm4.測(cè)定方法

Ch.P收載2種方法第一法：直接測(cè)定法，適用于純度高的維生素A醋酸酯第二法：皂化法，適用于維生素A醇（1）第一法直接測(cè)定法

（適用于純度高的維生素A醋酸酯）

方法：①核對(duì)

max

判斷是否在326～329nm之間

max在326～329nm之間改用第二法（皂化法）

是否求算并與規(guī)定值比較

比值差值：

②計(jì)算吸收度比及比值差吸收度比：

藥典規(guī)定值比值差值規(guī)定±0.02

③判斷差值是否超過(guò)規(guī)定值的有一個(gè)以上超過(guò)無(wú)超過(guò)

計(jì)算A328（校正）

用A328計(jì)算03%－15%－3%第二法第二法如果最大吸收波長(zhǎng)在326~329nm之間;并分別計(jì)算5個(gè)波長(zhǎng)下的差值，如有一個(gè)或幾個(gè)超過(guò)±0.02，計(jì)算f值。分情況判斷：④求

A＝·C·L⑤求效價(jià)（IU/g

）:每克供試品中所含維生素A的國(guó)際單位數(shù)（IU/g）。對(duì)于維生素A醋酸酯：

IU/g＝x1900

對(duì)于維生素A醇：

IU/g＝x1830換算因子換算因子

換算因子的計(jì)算：以維生素A醋酸酯為例（環(huán)己烷）：

1IU＝0.344

g維生素A醋酸酯

1g的維生素A醋酸酯就相當(dāng)于多少國(guó)際單位

IU/g

換算因子＝

因此，維生素A醋酸酯換算因子：

⑥計(jì)算維生素A醋酸酯占標(biāo)示量的百分含量

例：VitAD膠丸中VitA的含量測(cè)定

精密稱取本品(規(guī)格10000VitAIU/丸)裝量差異項(xiàng)下（平均裝量0.07985g/丸）的內(nèi)容物0.1287g至10ml燒杯中，加環(huán)己烷溶解并定量轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)為328nm，并在下列波長(zhǎng)處測(cè)得吸收度為A300：0.374A316：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344

求本品中維生素A占標(biāo)示量的百分含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299

+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)=3.52(2×0.663–0.592–0.553)=0.637A328(校正)–A328(實(shí)測(cè))A328(實(shí)測(cè))×100=0.637–0.6630.663×100=-3.92E1%1cm(328nm)=A328(校正)100ms/D=0.637100×0.1287/1250=61.87供試品中維生素A效價(jià)=

E1%1cm(328nm)×1900=61.87×1900=117553（IU/g）標(biāo)示量%=VA效價(jià)(IU/g)×每丸內(nèi)容物平均裝量(g/丸)標(biāo)示量(IU/丸)×100%=117553×0.0798510000×100%=93.9%注意p252頁(yè)的練習(xí)題（2）第二法（皂化法，等吸收比法）（適用于維生素A醇）

第一法無(wú)法消除雜質(zhì)干擾時(shí)用此法水溶性脂溶性

判斷

max是否在323～327nm之間取未皂化樣品采用色譜法純化后再測(cè)定計(jì)算是否

判斷A300/A325是否小于等于0.73是否取未皂化樣品采用色譜法純化后再測(cè)定計(jì)算A325(校正)03%－3%基本步驟:

第一步A的選擇選擇依據(jù)：所選A值中雜質(zhì)的干擾已被基本消除第二步求注意：C為混合樣品的濃度第三步求效價(jià)換算因數(shù)由純品計(jì)算而得：第四步：求標(biāo)示量％5.討論(1)VA醋酸酯的吸收度校正公式是用直線方程式法（即代數(shù)法）推導(dǎo)而來(lái)；VA醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（幾何法或稱6/7定位法）推導(dǎo)而來(lái)。(2)在應(yīng)用三點(diǎn)校正法時(shí)，除其中一點(diǎn)在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定外，其余兩點(diǎn)均在最大吸收峰的兩側(cè)進(jìn)行測(cè)定。在測(cè)定前務(wù)必要校正波長(zhǎng)。測(cè)定的樣品應(yīng)不得少于兩份。

（3）VA遇光易氧化變質(zhì)，操作應(yīng)半暗室中快速進(jìn)行，所用試劑不得含氧化性物質(zhì)，以防VA被紫外線或氧化性物質(zhì)破壞。練習(xí)題

維生素A醋酸酯膠丸的含量測(cè)定。操作如下：取內(nèi)容物39.1mg，加環(huán)己烷溶解并稀釋至100ml，在規(guī)定波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度如下：

已知膠丸內(nèi)容物平均重量為0.08736g，其每丸標(biāo)示量為3000IU，計(jì)算占標(biāo)示量的百分含量？中國(guó)藥典規(guī)定的吸光度比值見(jiàn)下表。

解：由表可知328nm的吸收度最大。計(jì)算各波長(zhǎng)的吸收度與328nm波長(zhǎng)處的吸收度比值（Ai/A328），與藥典規(guī)定值比較，其中比值A(chǔ)300/A328與規(guī)定比值之差為0.026，比值A(chǔ)360/A328與規(guī)定比值之差為0.0348，超過(guò)規(guī)定的(±0.02)限度，故需計(jì)算校正吸收度A328（校正）。A328（校正）=3.52(2A328-A316-A340)代入數(shù)值計(jì)算得：A328（校正）=3.52(2×0.671-0.607-0.55)=0.6512因?yàn)?A328（校正）-A328)/A328=2.95%<3.0%故應(yīng)以A328計(jì)算含量其中A328=0.671，供試品稀釋倍數(shù)D=100，膠丸的平均內(nèi)容物重量=0.08736g=87.36mg，稱取的內(nèi)容物重量W=39.1mg，比色池厚度L=1mL，標(biāo)示量為3000IU將數(shù)值代入計(jì)算公式得：標(biāo)示量%=94.95%因此每丸膠丸內(nèi)容物占標(biāo)示量的百分含量為94.95%。（二）三氯化銻比色法

1.原理

2.方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法

3.討論：（1）操作迅速，因產(chǎn)生的藍(lán)色不穩(wěn)定（2）反應(yīng)介質(zhì)需無(wú)水（3）溫度影響較大(與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差≤1℃)

（4）方法專屬性（5）三氯化銻的腐蝕性λmax618nm～620nm（三）高效液相色譜法RP-HPLC同時(shí)測(cè)定人血清中VitA和VitE的含量1、儀器與分析條件：HPLC-UV、C18(300×3.9mm）、甲醇－水（96：4）、流速：1.2ml/min、檢測(cè)波長(zhǎng)：0～8min(330nm),8min后(292nm）內(nèi)標(biāo)：維生素A醋酸酯血清樣品的制備：LLE法制備分析方法的建立：線性、LOD、Recovery、Precision

一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

（一）化學(xué)結(jié)構(gòu)

維生素B1（鹽酸硫胺）是由氨基嘧啶和噻唑環(huán)通過(guò)次甲基連接而成的季銨化合物。

第三節(jié)維生素B1的分析氨基嘧啶環(huán)－CH2－噻唑環(huán)(季銨堿)（二）性質(zhì)

1.溶解性

在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。

水溶液顯酸性。

2.UV共軛雙鍵λmax=246nm3.硫胺顯堿性在硫胺的分子中具有兩個(gè)堿性基團(tuán)。噻唑環(huán)上的季銨嘧啶環(huán)上的氨基因此，硫胺可以和酸成鹽。

4.硫色素反應(yīng)維生素B1分子中的噻唑環(huán)在堿性條件下開(kāi)環(huán)，再與嘧啶環(huán)上的氨基縮合，經(jīng)鐵氰化鉀K3Fe(CN)6等氧化劑氧化成具有熒光的硫色素，溶于正丁醇中呈藍(lán)色熒光。5.沉淀反應(yīng)維生素B1分子中的含氮雜環(huán)，能夠和生物堿沉淀試劑反應(yīng)產(chǎn)生沉淀。6.氯化物的反應(yīng)維生素B1是一種鹽酸鹽。呈氯化物的反應(yīng)，用于鑒別。二、鑒別試驗(yàn)

（一）硫色素反應(yīng)（VB1專屬性反應(yīng)，用于鑒別和含測(cè)Ch.P）

1.原理硫色素＋2H2.方法：見(jiàn)書p258VitB1H+H+H+（二）沉淀反應(yīng)（三）氯化物的反應(yīng)（四）硝酸鉛的反應(yīng)(S的反應(yīng))

維生素B1與NaOH共熱，分解產(chǎn)生NaS，可與硝酸鉛反應(yīng)生成PbS的黑色沉淀。三、含量測(cè)定

非水滴定法紫外分光光度法硫色素?zé)晒夥ǎㄒ唬┓撬味ǚ?.原理:VB1分子中含有已成鹽的伯胺和季銨基團(tuán),在非水溶液中（在醋酸汞存在下），均可與高氯酸作用。喹哪啶紅-亞甲藍(lán)（紫紅→天藍(lán)）2.方法:

溶劑:冰醋酸、醋酸汞指示劑:喹哪啶紅-亞甲藍(lán)混合指示劑滴定液:高氯酸終點(diǎn):天藍(lán)色空白試驗(yàn)

3.討論：（1）為何加入醋酸汞試液？（2）反應(yīng)摩爾比為1：2。為什么？（3）方法為Ch.P收載的VB1原料藥的含測(cè)方法。（二）紫外分光光度法

1.原理共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，在紫外區(qū)有吸收。

2.方法

VB1片的測(cè)定（吸收系數(shù)法，Ch.P方法）

=421A=ECLg/100ml規(guī)格g/片VB1注射劑的測(cè)定（吸收系數(shù)法，Ch.P方法）規(guī)格g/ml體積稀釋倍數(shù)3.討論：維生素B1的紫外吸收峰隨溶液的pH變化而變化。(三)硫色素?zé)晒夥?/p>

1.原理

2.方法【USP(24)】40ml具塞試管3支→對(duì)照品溶液5ml；其中2支加入氧化試劑3.0ml，再迅速加入異丁醇20ml，振搖。第三支試管中加入3.5mol/l的NaOH，同法操作為空白。另取三支試管加入供試品同法操作。各試管中加入無(wú)水乙醇2ml，分取異丁醇，進(jìn)行熒光測(cè)定。

3.討論：（1）硫色素反應(yīng)為VB1的專屬性反應(yīng)，一定條件下形成的硫色素與VB1濃度成正比。（2）靈敏度高（3）不受氧化破壞產(chǎn)物干擾。（4）可用BrCN為氧化劑，反應(yīng)定量完全，適合于生物樣本分析。

一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

（一）結(jié)構(gòu)

1.有烯二醇結(jié)構(gòu)，具有很強(qiáng)的還原性，能夠被一些氧化劑氧化。

2.具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu),堿性條件下水解。

3.有2個(gè)手性碳，具有旋光性。

第四節(jié)維生素C的分析L－抗壞血酸（二）性質(zhì)

1.溶解性

水中易溶，水溶液呈酸性；乙醇中略溶，在氯仿或乙醚中不溶。

2.酸性

維生素C的分子中具有烯二醇的結(jié)構(gòu)

C3上的羥基，由于受共軛效應(yīng)的影響，

酸性較強(qiáng)，pKa=4.17

C2上的羥基，由于鄰位羰基的影響，

酸性較弱，pKa=11.57

故維C一般表現(xiàn)為一元酸，能與NaHCO3作用生成鈉鹽。（一元酸）

3.還原性－－烯二醇基烯二醇基具有較強(qiáng)的還原性。烯二醇結(jié)構(gòu)二酮基結(jié)構(gòu)4.旋光性－－

2個(gè)手性碳原子，4個(gè)光學(xué)異構(gòu)體，以L（＋）－抗壞血酸活性最強(qiáng)。手性C（C4、C5）有活性有活性無(wú)活性5.水解性－－內(nèi)酯環(huán)強(qiáng)堿條件下，內(nèi)酯環(huán)水解，生成酮酸鹽。糖類的顯色反應(yīng)50℃結(jié)構(gòu)與糖類相似6.糖類的性質(zhì)－－7.紫外吸收二、鑒別試驗(yàn)

(一)與硝酸銀反應(yīng)（Ch.PBP）

VC的烯二醇具有還原性

(二)與2,6-二氯靛酚反應(yīng)（Ch.P

）

2,6-二氯靛酚＋維C被還原成酚亞胺

還原型無(wú)色氧化型藍(lán)色OHˉ玫瑰紅色（玫瑰色）（無(wú)色）（三）與其他氧化劑反應(yīng)亞甲藍(lán)或高錳酸鉀試劑褪色

堿性酒石酸銅磚紅色沉淀

磷鉬酸鉬藍(lán)

（四）糖類反應(yīng)（USP）維C具有糖類性質(zhì)50℃吡咯UV（五）（BP）0.01mol/LHCl三、雜質(zhì)檢查

（一）溶液的澄清度與顏色檢查中國(guó)藥典采用控制吸收度的方法

高于或低于pH5～6

VC水溶液內(nèi)酯環(huán)水解

空氣、光線、溫度

脫羧糠醛聚合呈色

（二）鐵、銅離子的檢查原子吸收分光光度法

四、含量測(cè)定

碘量法

2,6-二氯靛酚滴定法

HPLC

(一)碘量法

1.原理

去氫抗壞血酸

取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過(guò)的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6方法2.3.討論（1）為何在酸性環(huán)境？反應(yīng)在酸性溶液中進(jìn)行，因?yàn)樵谒嵝越橘|(zhì)中，維生素C受空氣中氧的氧化速度減慢。（2）加入新沸過(guò)的冷水的目的？是為了減少水中溶解的氧對(duì)測(cè)定的影響。（3）維生素C注射液測(cè)定時(shí)加入2ml丙酮？以消除注射液中抗氧劑亞硫酸氫鈉對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。（4)立即滴定?減少O2的干擾（二）2,6-二氯靛酚滴定法(USP、JP)1.原理

2,6-二氯靛酚＋維C被還原成酚亞胺酸性：玫瑰紅無(wú)色堿性：藍(lán)色

2.方法

酸性條件下，直接用2,6-二氯靛酚滴定，用滴定劑自身的顏色變化指示終點(diǎn)。終點(diǎn)顏色變化：無(wú)色玫瑰紅色3.討論：（1）并非維生素C的專一反應(yīng)，其他還原性物質(zhì)也有干擾?？焖俚味?min內(nèi)（2）可用2,6-二氯靛酚進(jìn)行剩余比色測(cè)定.

（3）2,6-二氯靛酚滴定液不夠穩(wěn)定，需常標(biāo)定，儲(chǔ)備液不宜超過(guò)一周。

（4）專屬性較碘量法為高。（定量過(guò)量）（測(cè)剩余染料）(三)高效液相色譜法人血漿中VitC濃度的HPLC法測(cè)定1、色譜條件2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備3、血漿樣品的處理：酸性溶液沉淀蛋白法4、方法學(xué)考察5、測(cè)定

一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

維生素D是甾醇的衍生物（一）結(jié)構(gòu)第五節(jié)維生素D的分析維生素D2－骨化醇維生素D3－膽骨化醇開(kāi)環(huán)的甾體：具有甾類化合物的顯色反應(yīng)，可用于鑒別。手性碳原子：具有旋光性，可用于鑒別。

多烯：可進(jìn)行紫外檢測(cè)。

（二）性質(zhì)

1.性狀

2.溶解性

3.不穩(wěn)定性：多個(gè)烯鍵

4.旋光性

5.顯色反應(yīng)：甾類化合物的共有反應(yīng)

6.紫外吸收二、鑒別試驗(yàn)（一）顯色反應(yīng)醋酐-硫酸反應(yīng)D2

黃紅紫綠

D3

黃紅紫、藍(lán)綠綠三氯化銻反應(yīng)橙紅色漸變粉紅三氯化鐵反應(yīng)橙黃色二氯丙醇和乙酰氯反應(yīng)綠色（二）比旋度鑒別維生素D2維生素D3溶劑

濃度比旋度值無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5°～+107.5°+105°～+112°注意事項(xiàng)：應(yīng)于容器開(kāi)啟30分鐘內(nèi)取樣，在溶液配制后30分鐘內(nèi)測(cè)定。（三）其他鑒別方法

TLC、HPLC、制備衍生物測(cè)熔點(diǎn)（四）維生素D2、D3的區(qū)別反應(yīng)

96％乙醇乙醇，85％硫酸

維D2紅色（570nm）維生素D

維D3黃色（495nm）三、雜質(zhì)檢查

（一）麥角甾醇的檢查

Ch.P維生素D2檢查，維生素D3不檢查

維生素D2中麥角甾醇的檢查：加洋地黃皂苷溶液，混合，放置18h不得發(fā)生渾濁或沉淀。

（二）前維生素D的光照產(chǎn)物四、含量測(cè)定方法

中國(guó)藥典（2005年版）采用正相高效液相色譜法(NP-HPLC）測(cè)定維生素D的含量，定量方法為內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為鄰苯二甲酸二甲酯。根據(jù)樣品的具體情況按以下三個(gè)方法進(jìn)行分析。第一法：用于無(wú)維生素A醇及其它雜質(zhì)干擾的情況，步驟如下：

1．系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：測(cè)定重復(fù)性和分離度。

固定相：硅膠

流動(dòng)相：正己烷-正戊醇（997：3）

2．測(cè)定校正因子：

3．含量測(cè)定：

2,6-二叔丁基對(duì)甲酚＋加熱第二法：用于有雜質(zhì)的干擾的情況，步驟如下：

1．皂化處理：皂化、乙醚提取、洗滌提取液、蒸除乙醚、制備供試液A。

2．凈化：供試液A經(jīng)液相色譜分離，準(zhǔn)確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液，制備成供試液B。

固定相：ODS

流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（50：50：2）

3．含量測(cè)定：取供試液B按第一法測(cè)定。

第三法：用于經(jīng)第二法處理后仍有雜質(zhì)的干擾的情況。步驟如下：1．制備供試液：取供試液A，凈化，水浴加熱，正已烷溶解，得供試液C。

制備對(duì)照液：對(duì)照品儲(chǔ)備液（異辛烷溶解）：稀釋、加熱。

2．含量測(cè)定：在第一法的色譜條件下，交替精密進(jìn)樣對(duì)照液和供試液，按外標(biāo)法定量。討論1、采用的是正相高效液相色譜法2、測(cè)定過(guò)程中應(yīng)避免VitD的氧化3、皂化應(yīng)劇烈振搖，水浴溫度≤40℃，提取溶劑大多采用己烷或戊烷以消除苯的毒性4、若供試品中沒(méi)有VitA醇及其它雜質(zhì)干擾時(shí)，可以直接進(jìn)樣分析5、注意色譜系統(tǒng)適用性樣品VitD、前VitD的制備方法一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

（一）結(jié)構(gòu)

第六節(jié)維生素E的分析苯并－二氫吡喃醇名稱R1R2相對(duì)活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1苯環(huán)+二氫吡喃環(huán)+飽和烴鏈dl－α－生育酚醋酸酯（二）性質(zhì)

1.溶解性維生素E為微黃色或黃色透明的粘稠液體，水中不溶，在無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、石油醚中易溶。

2.水解性苯環(huán)上的乙?；姆恿u基,在酸性或堿性溶液中加熱可水解成游離生育酚，作為特殊雜質(zhì)檢查。

3.氧化性游離生育酚在有氧或氧化劑存在時(shí)，氧化成醌型化合物，堿性條件下，更易發(fā)生。4.紫外吸收特性二、鑒別試驗(yàn)

（一）硝酸反應(yīng)（Ch.P、JP）

硝酸