高效液相色譜法改動(dòng)

高效液相色譜法改動(dòng)§20.1

概述§20.2

高效液相色譜法的分類與基本原理

20.2.1

高效液相色譜法的分類

20.2.2

基本原理§20.3

各類高效液相色譜法

20.3.1液－固吸附色譜法

20.3.2液－液分配色譜法

20.3.3化學(xué)鍵合相色譜法

20.3.4其他色譜法第2頁,共79頁，2024年2月25日，星期天§20.4固定相

20.4.1液－固色譜固定相

20.4.2化學(xué)鍵合相

20.4.3其他固定相§20.5流動(dòng)相（溶劑系統(tǒng)）

20.5.1分離方程式

20.5.2Snyder溶劑分類

20.5.3正相洗脫與反相洗脫

20.5.4洗脫方式第3頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

20.5.5流動(dòng)相最優(yōu)化方法簡(jiǎn)介§20.6高效液相色譜儀

20.6.1輸液泵

20.6.2

色譜柱與進(jìn)樣器

20.6.3

檢測(cè)器

20.6.4

超高效液相色譜儀§20.7

定性、定量分析方法

20.7.1

定性分析方法

20.7.2

定量分析方法第4頁,共79頁，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法概述第5頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

高效液相色譜法

HPLC

（highperformanceliquidchromatograph）高壓輸液泵高效固定相高靈敏度檢測(cè)器第6頁,共79頁，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較見表第7頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共79頁，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法與GC的比較見表第10頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

高效液相色譜法的分類與基本原理第13頁,共79頁，2024年2月25日，星期天20.2.1高效液相色譜法的分類按固定相的聚集狀態(tài)：LLC和LSC按分離機(jī)制：分配、吸附、離子交換（IEC）、空間排阻（SEC）、親合（AC）、手性（CC）、膠束（MC）、電色譜法（EC）。第14頁,共79頁，2024年2月25日，星期天HPLCLSCLLCNLLC和RLLCBPC（狹）RBPCNBPCISC一般RBPCPICIEC一般IECICAA（氨基酸分析法）SECGPC和GFCAC（親和）MC（膠束）CC（手性）第15頁,共79頁，2024年2月25日，星期天20.2.2高效液相色譜法的基本原理HPLC的范氏方程：第16頁,共79頁，2024年2月25日，星期天討論：

渦流擴(kuò)散項(xiàng)：填料和填充均勻程度高效液相色譜柱的裝填第17頁,共79頁，2024年2月25日，星期天縱向擴(kuò)散項(xiàng)第18頁,共79頁，2024年2月25日，星期天傳質(zhì)阻力項(xiàng)第19頁,共79頁，2024年2月25日，星期天溫度一般為室溫

選甲醇、乙腈粘度小的溶劑粒徑第20頁,共79頁，2024年2月25日，星期天綜上所述，HPLC應(yīng)采用：1)采用小粒徑、窄粒度分布的球形固定相，首選化學(xué)鍵合相，用均漿法裝柱；2）采用低粘度流動(dòng)相，低流速（1ml/min)；3）柱溫一般以25～35度為宜。太低，則流動(dòng)相的粘度增加，溫度高易產(chǎn)生氣泡。第21頁,共79頁，2024年2月25日，星期天流速分析型HPLC一般流量為1mL/min。第22頁,共79頁，2024年2月25日，星期天各類高效液相色譜法第23頁,共79頁，2024年2月25日，星期天20.3.1液－固吸附色譜法分離機(jī)理

溶質(zhì)分子與流動(dòng)相分子競(jìng)爭(zhēng)吸附吸附劑表面吸附活性中心，靠溶質(zhì)分子的分配系數(shù)（容量因子）不同而分離。影響容量因子的因素

溶質(zhì)分子的極性溶劑的極性硅膠的活性第24頁,共79頁，2024年2月25日，星期天若以硅膠為固定相：洗脫劑：以烷烴為底劑，加適量極性調(diào)整劑組成的二元或三元流動(dòng)相。流動(dòng)相應(yīng)該不含水。第25頁,共79頁，2024年2月25日，星期天20.3.2液－液分配色譜法分離機(jī)理靠樣品組分溶入固定相與流動(dòng)相達(dá)到“平衡”后分配系數(shù)的差別而分離。正、反相液－液色譜法

注意流出順序。目前，物理涂漬的液－液色譜幾乎已被化學(xué)鍵合相所取代。第26頁,共79頁，2024年2月25日，星期天20.3.3化學(xué)鍵合相色譜法

將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面，就構(gòu)成化學(xué)鍵合相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法（bondedphasechromatograph，BPC）第27頁,共79頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)鍵合相的優(yōu)點(diǎn)均一、穩(wěn)定；不易流失，使用周期長(zhǎng)；柱效高；重現(xiàn)性好。第28頁,共79頁，2024年2月25日，星期天反相鍵合相色譜法（RBPC或RHPLC）固定相：在載體表面鍵合含弱極性或中等極性的基團(tuán)，如十八烷基硅烷（C18）（ODS柱）、辛烷基（C8）、甲基（－CH3）、苯基等。第29頁,共79頁，2024年2月25日，星期天流動(dòng)相：以水做主體，加適量的極性調(diào)節(jié)劑增加選擇性如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。出峰順序：

極性強(qiáng)的組分先出柱，極性弱的組分后出柱。分析對(duì)象：

分離非極性至中等極性的各種分子型化合物。第30頁,共79頁，2024年2月25日，星期天影響保留時(shí)間的因素：

溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)：極性越弱，保留時(shí)間越長(zhǎng)。

流動(dòng)相的表面張力、介電常數(shù)和pH值：對(duì)于二元或多元體系改變?nèi)軇┑呐浔瓤筛淖兞鲃?dòng)相的表面張力和介電常數(shù)。通常，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑含量增加，k變小。例如：在水－甲醇體系中增加甲醇的量，可降低表面力和介電常數(shù)，使容量因子變小。第31頁,共79頁，2024年2月25日，星期天正相鍵合相色譜法

固定相：在載體表面鍵合含中等極性或較強(qiáng)極性的基團(tuán)，如氰基（－CN）、氨基（—NH3）、或二羥基等。

流動(dòng)相：以非極性或弱極性的溶劑如己烷、庚烷等為主體，加適量的極性調(diào)節(jié)劑增加選擇性如乙醚、氯仿、二氯甲烷等。第32頁,共79頁，2024年2月25日，星期天出峰順序：

極性弱的組分先出柱，極性強(qiáng)的組分后出柱。影響保留時(shí)間的因素：鍵合相的種類、流動(dòng)相的強(qiáng)度、試樣的性質(zhì)。流動(dòng)相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，保留時(shí)間縮短。第33頁,共79頁，2024年2月25日，星期天適應(yīng)范圍：

分離溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物。第34頁,共79頁，2024年2月25日，星期天反相離子對(duì)色譜法（RPIC）第35頁,共79頁，2024年2月25日，星期天寫成通式：第36頁,共79頁，2024年2月25日，星期天表：反相離子對(duì)色譜的離子對(duì)試劑序號(hào)反離子種類主要應(yīng)用對(duì)象1季銨鹽（如四丁基銨磷酸鹽TBA、溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）強(qiáng)酸、弱酸、磺酸染料、羧酸、氫化可的松及其鹽2叔銨（如三辛銨）磺酸鹽、羧酸等3烷基磺酸鹽（如甲基、戊基、己基、庚基、樟腦磺酸鹽）強(qiáng)堿、弱堿、兒茶酚胺、鴉片堿等4高氯酸胺5烷基磺酸鹽（如十二烷基磺酸鹽、正庚烷基磺酸鈉（PICB7)與3類似，選擇性不同第37頁,共79頁，2024年2月25日，星期天離子對(duì)色譜法的適用對(duì)象：

用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離，以及用離子交換色譜法無法分離的離子型和非離子型化合物的混合物的分離。第38頁,共79頁，2024年2月25日，星期天離子抑制色譜法（ionsuppressionchromatograph，ISC）在反相色譜法中，通過向流動(dòng)相加入少量弱酸（常用乙酸）、弱堿（常用氨水）或緩沖鹽（常用磷酸鹽及乙酸鹽）來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，抑制樣品組分的離解，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，這種技術(shù)稱為離子抑制色譜法。第39頁,共79頁，2024年2月25日，星期天調(diào)節(jié)pH范圍：2～7.5

pH>8.0

破壞鍵合相與載體的結(jié)合

pH<2.0

腐蝕柱子離子抑制色譜法適用：弱酸堿物質(zhì)

pKa=3～7弱酸；

pKa=7～8弱堿；兩性化合物。第40頁,共79頁，2024年2月25日，星期天20.3.4其他色譜法離子色譜法

IonChromatography，簡(jiǎn)稱IC

傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個(gè)難于解決的問題：

a.需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時(shí)間很長(zhǎng)；

b.洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測(cè)方法。第41頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

離子色譜的創(chuàng)始人是H.Small。

1975年提出抑制型離子色譜法。第42頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

以分析F-、Cl-等陰離子為例：交換柱裝OH型陰離子交換樹脂，抑制柱內(nèi)裝H型的強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。流動(dòng)相是氫氧化鈉或碳酸氫鈉組成的稀溶液。第43頁,共79頁，2024年2月25日，星期天手性色譜法（chiralchromatography）

～是利用手性固定相或手性流動(dòng)相添加劑分離分析手性化合物的對(duì)映異構(gòu)體的色譜法。第44頁,共79頁，2024年2月25日，星期天環(huán)糊精色譜法（CDC）根據(jù)環(huán)糊精與手性分子的鑲嵌關(guān)系分離異構(gòu)體。膠束色譜法（MC）

該系統(tǒng)具有固定相－流動(dòng)相－膠束－固定相，3個(gè)界面、3個(gè)分配系數(shù)，具有較好的選擇性。第45頁,共79頁，2024年2月25日，星期天親合色譜法（Affinitychromatograph）

利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。第46頁,共79頁，2024年2月25日，星期天固定相第47頁,共79頁，2024年2月25日，星期天20.4.1化學(xué)鍵合相色譜法的固定相

鍵合相（bondedphase；BP）：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相。載體的類型：硅膠又有表面多孔型（即薄殼型）和全多孔微粒型。第48頁,共79頁，2024年2月25日，星期天廠商：Porasil、Zorbel4、Lichrosorb系列，上海試劑一廠的堆積硅珠、青島海洋化工廠的YWG系列、天津試劑二廠的DG系列廠商：Zipax、CorasilⅠ和Ⅱ

Vydac、Pellosil以及上海試劑一廠的薄殼玻璃珠。無定形球形全多孔硅膠（廢棄）第49頁,共79頁，2024年2月25日，星期天b.其他金屬氧化物制備硅膠載體的好處。硅膠載體的不足：

在堿性介質(zhì)中（pH>8）不穩(wěn)定；在孔隙中大分子擴(kuò)散困難，降低柱效；硅膠表面上的剩余硅羥基對(duì)分離有影響。目前研制的基質(zhì)有：氧化鋁、氧化鋯、氧化釷和氧化鈦。第50頁,共79頁，2024年2月25日，星期天主要掌握正相和反相鍵合相：鍵合的基團(tuán)的極性及適用情況。

第51頁,共79頁，2024年2月25日，星期天表：反相HPLC常用的化學(xué)鍵合相類型牌號(hào)名稱官能團(tuán)粒度/μm形狀說明長(zhǎng)鏈YWG-C18H37C18硅烷10非球形PartisilODSC18硅烷5，10非球形5％CZprbaxODSC18硅烷6球形15％C短鏈LiChrosorbRP-8C8硅烷5，10非球形13％～14％CYWGC6H6苯基硅烷10非球形7％CLiChrosorbRP-2二甲基硅烷5，10非球形5％C第52頁,共79頁，2024年2月25日，星期天鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)

含碳量：指鍵合在硅膠表面上的烷基所含碳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，隨鏈長(zhǎng)增長(zhǎng)，從3％～22％。

覆蓋度：指硅膠被鍵合后，在硅膠中的有效羥基與硅烷試劑反應(yīng)的程度，在鍵合后有時(shí)還用短鏈的硅烷試劑與剩余和新產(chǎn)生的羥基反應(yīng)，使羥基全部被”帽蓋“（即封尾）而不起作用。第53頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

鍵合相的特點(diǎn)：使用過程中不流失；化學(xué)穩(wěn)定性好；適于梯度洗脫；載樣量大。第54頁,共79頁，2024年2月25日，星期天流動(dòng)相（溶劑系統(tǒng)）第55頁,共79頁，2024年2月25日，星期天HPLC對(duì)流動(dòng)相的要求：不與固定相反應(yīng)；對(duì)試樣有適宜的溶解度，k在1～10之內(nèi)，最好在2～5之間；與檢測(cè)器相適應(yīng)；純度高，粘度小。使用前濾過，脫氣。第56頁,共79頁，2024年2月25日，星期天20.5.1分離方程式

討論：α主要受溶劑種類的影響；在溶劑組成確定后，k主要由溶劑的配比所左右。第57頁,共79頁，2024年2月25日，星期天20.5.2Snyder溶劑分類

Snyder選擇了3個(gè)參考物質(zhì)，用于檢驗(yàn)溶劑的3種分子間作用力，分別用Xe、Xd、Xn表述。

表：參考物與被檢溶劑間的作用力參考物乙醇（質(zhì)子給予體）二氧六環(huán)（質(zhì)子受體）硝基甲烷（強(qiáng)偶極）被檢溶劑的作用力類型質(zhì)子受體作用力(Xe)質(zhì)子給予體作用力(Xd)強(qiáng)偶極作用力(Xn)第58頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

描述溶劑極性用Snyder提出的溶劑極性參數(shù)P'來衡量。表：常用溶劑的極性參數(shù)和選擇性參數(shù)溶劑P'XeXdXn正戊烷0.0---乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53氯仿4.10.250.410.33甲醇5.10.480.220.31第59頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

可將81種色譜溶劑，按Xe、Xd、Xn在三角形坐標(biāo)圖上的相鄰關(guān)系分為8類。

選擇不同組別的溶劑，分子作用力不同，容易使α改變，利于分離。第60頁,共79頁，2024年2月25日，星期天20.5.3正相洗脫與反相洗脫

溶劑洗脫強(qiáng)度指流動(dòng)相中溶劑的洗脫能力,它不僅與流動(dòng)相，而且與固定相的極性有關(guān)。在正相色譜中,“溶劑洗脫強(qiáng)度”與溶劑極性成正比；而在反相色譜中，溶劑極性越大,洗脫能力越小。第61頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

反相鍵合相色譜法的溶劑強(qiáng)度用另一強(qiáng)度因子S表示。表：反相色譜常用溶劑的強(qiáng)度因子S水甲醇乙腈丙酮二噁烷乙醇異丙醇四氫呋喃03.03.23.43.53.64.24.5第62頁,共79頁，2024年2月25日，星期天混合液設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)技術(shù)：根據(jù)溶劑選擇性分組，選具有顯著選擇性差異的溶劑。反相：水為底劑，甲醇、乙腈和四氫呋喃為選擇性溶劑。正相：已烷或戊烷為底劑，乙醚、氯仿和二氯甲烷為選擇性溶劑。第63頁,共79頁，2024年2月25日，星期天混合溶劑的強(qiáng)度

第64頁,共79頁，2024年2月25日，星期天20.5.4洗脫方式等度洗脫：

在一個(gè)分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少、性質(zhì)差別不大的試樣。第65頁,共79頁，2024年2月25日，星期天梯度洗脫（程序洗脫）在一個(gè)分析周期內(nèi)程序程序控制改變流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，可使一個(gè)復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異很大的組分，能在各自適宜的分離條件（容量因子k適宜）下分離。梯度洗脫能縮短分析時(shí)間、提高分離度、改善峰形、提高檢測(cè)靈敏度。第66頁,共79頁，2024年2月25日，星期天高效液相色譜儀第67頁,共79頁，2024年2月25日，星期天總圖第68頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第69頁,共79頁，2024年2月25日，星期天高壓泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性第70頁,共79頁，2024年2月25日，星期天梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第71頁,共79頁，2024年2月25日，星