遺傳重組轉座敲除

遺傳重組轉座敲除重組的定義遺傳重組的類型同源重組的分子機制重組和酶位點特異性重組轉座轉座的機制遺傳重組的應用第2頁,共88頁，2024年2月25日，星期天6.0重組DNA分子的斷裂和重新連接導致遺傳信息的重新組合，稱為重組（recombination）。重組的產物稱為重組DNA（recombinantDNA），所有的DNA都是重組DNA。由于重組，一個DNA分子的遺傳信息可以和另一個DNA分子的遺傳信息結合在一起，也可以改變一條DNA分子上遺傳信息的排列方式。DNA重組廣泛存在于各類生物中，說明重組對物種生存具有重要意義。通過重組實現基因的重新組合使物種能夠更快地適應環(huán)境，加快進化的過程。此外，DNA重組還參與許多重要的生物學過程，比如重組在DNA損傷修復和突變中發(fā)揮重要作用。第3頁,共88頁，2024年2月25日，星期天6.1遺傳重組的類型

根據對DNA序列和所需蛋白因子的要求，可有三種類型的重組。其共同點是這些過程都涉及雙鏈DNA之間的物質交換，但其發(fā)生的情況有所不同。第4頁,共88頁，2024年2月25日，星期天遺傳重組的三種類型（1）同源重組

它的發(fā)生是依賴大范圍的DNA同源序列的聯會。在重組過程中，兩個染色體或DNA分子交換對等的部分。⒈需要重組的蛋白質參與，eg.大腸桿菌中的RecA蛋白、RecBCD蛋白；⒉蛋白質因子對DNA堿基序列的特異性要求不高；（存在重組熱點和序列長度的影響）⒊真核生物染色質的狀態(tài)影響重組的頻率。特點：第5頁,共88頁，2024年2月25日，星期天同源重組可能發(fā)生在兩條同源的DNA的任意位點第6頁,共88頁，2024年2月25日，星期天(3)異常重組

完全不依賴于序列間的同源性而使一段DNA序列插入另一段中，但在形成重組分子時往往是依賴于DNA復制而完成重組過程。eg.轉座作用，需要轉座酶和對轉座區(qū)域DNA的復制。(2)位點專一性重組

重組依賴于小范圍同源序列的聯會，發(fā)生精確的斷裂、連接，DNA分子并不對等交換

eg.λ-phageDNA對E.coli的整合(attP→attB)，需要有15bp的同源序列和專一性的蛋白質因子參與。

第7頁,共88頁，2024年2月25日，星期天位點專一重組發(fā)生在兩條特定的序列，兩條重組DNA的其他序列則是不同的。第8頁,共88頁，2024年2月25日，星期天位點專一重組能使二聚體環(huán)狀DNA分子產生兩個單體環(huán)狀DNA分子第9頁,共88頁，2024年2月25日，星期天6.2同源重組的分子機制同源重組（homologousrecombination）發(fā)生在兩個同源DNA分子之間。真核細胞減數分裂過程中，同源染色體彼此配對，同源染色體DNA片段發(fā)生交叉與互換。DarlingtonD.C.于1936年提出：減數分裂同源染色體聯會時，非姊妹染色單體由于纏繞而產生張力，兩個染色單體在同一位置斷裂、重接，以消除張力，從而產生重組。6.2.1斷裂與重接模型第10頁,共88頁，2024年2月25日，星期天FirstMeioticInterphase

(cellscontain4NDNAcontent)

Bivalentsisterchromatidsalignwitheachother,thisactistermedsynapsis.Synapsedsisterchromatidsaretermedasynaptonemalcomplex)

Figure5-55,page185第11頁,共88頁，2024年2月25日，星期天兩條同源DNA分子彼此并排對齊，相互配對DNA中兩個方向相同的單鏈在DNA內切酶的作用下,在相同位置上同時切開。在切口處發(fā)生鏈的交換，形成所謂的連接分子（jointmolecule），也稱Holliday結構（Hollidaystructure）。分支點可以發(fā)生移動，稱為分支遷移（branchmigration），分支遷移的結果是在兩個DNA分子中形成異源雙鏈區(qū)（heteroduplex）。1.Hollidaymodel第12頁,共88頁，2024年2月25日，星期天Synapsedchromatids第13頁,共88頁，2024年2月25日，星期天RecombinationjointHeteroduplexDNA第14頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共88頁，2024年2月25日，星期天

鏈交換所形成的連接分子必須進行拆分，才能形成兩個獨立的雙鏈分子。這需要再產生兩個切口。反應結果要看切開的是哪一對鏈，如果切口發(fā)生在當初未切的兩條鏈上，那么原來的4個鏈就全被切開，就會釋放出剪接重組DNA(splicerecombinantDNA)分子。第17頁,共88頁，2024年2月25日，星期天ABB’A’ABA’B’ABB’A’HollidayintermediatesABB’A’ABA’B’AB’A’BEndonucleasesaka.resolvases(e.g.RuvC)ProductsbeforeDNArepairHollidayIntermediate(seePhotoinLehningerpg962)第18頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共88頁，2024年2月25日，星期天

如果切口發(fā)生在當初被切的兩條鏈上，連接分子拆分后將形成補丁重組體（patchrecombinant）。分開的兩個DNA分子除保留了一段異源雙鏈DNA外，均完整無缺。因此，連接DNA分子無論如何拆分，所形成的兩個獨立的DNA分子總有一段異源雙鏈區(qū)，但是異源雙鏈區(qū)兩側的重組未必同時發(fā)生。第20頁,共88頁，2024年2月25日，星期天Termed“patchrecombinants”第21頁,共88頁，2024年2月25日，星期天兩條雙鏈體DNA分子間的重組關鍵是單鏈的交換。當雙鏈體DNA的單鏈與相對應的另一雙鏈體中的單鏈發(fā)生置換時，會產生一個分叉結構。交換產生異源雙鏈體DNA片斷，兩條單鏈分別來自父本和母本。聯合分子可以通過切開相接的鏈從而形成兩條分開的雙鏈體分子。第22頁,共88頁，2024年2月25日，星期天DNA雙鏈體配對同源鏈被切出缺口在雙鏈體之間，斷裂鏈交換靠分叉遷移，使交叉點移動在雙鏈體間第二鏈交叉，切口被封閉兩條配對雙鏈體DNA的重組包括相互的單鏈交換、分叉交換和缺口的切出。第23頁,共88頁，2024年2月25日，星期天Holliday模型HollidayR.于1964年提出第24頁,共88頁，2024年2月25日，星期天旋轉顯示Holliday接頭結構

切口控制結果根據鏈被切出缺口的位置,Holliday結構的結果可產生親本雙鏈體或重組雙鏈體.兩種類型的產物都有一段異源雙鏈體DNA.第25頁,共88頁，2024年2月25日，星期天

Holliday模型能夠較好解釋同源重組現象，但也存在問題。該模型認為進行重組的兩個DNA分子在開始時需要在對應鏈相同位置上發(fā)生斷裂。DNA分子單鏈斷裂是經常發(fā)生的事，但很難設想兩個分子何以能在同一位置發(fā)生斷裂。第26頁,共88頁，2024年2月25日，星期天6.2.3Meselson-Radding模型Holliday模型中為對稱的雜合雙鏈，而實際情況有不均等分離現象。1975年，MatthewMeselson和CharlesRadding對Holliday模型進行了修改。第27頁,共88頁，2024年2月25日，星期天Holliday模型要求在兩個并排對齊的同源DNA分子的對應位點形成單鏈切口，從而產生游離的單鏈末端。然而，在Meselson-Radding遺傳重組模型中，僅在一個雙螺旋上產生單鏈切口。利用切口處3’-OH合成的新鏈把原有的鏈逐步置換出來，使之成為以5’－P為末端的單鏈區(qū)。隨后游離的DNA單鏈侵入另一條DNA雙螺旋中，取代它的同源單鏈并與其互補鏈配對形成異源雙鏈區(qū)，被置換的單鏈形成D－環(huán)（D-loop）。D－環(huán)單鏈區(qū)隨后被切除,兩個DNA分子在DNA連接酶的作用下形成Holliday交叉。與Holliday不同，此時只在一條DNA分子上出現異源雙鏈區(qū)。如果發(fā)生分支遷移，在兩條雙螺旋上均出現異源雙鏈區(qū)。隨后發(fā)生的連接分子的拆解與Holliday模型一樣。第28頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共88頁，2024年2月25日，星期天但是更多的事實表明，重組是由雙鏈斷裂所啟動。現在認為，同源重組是減數分裂的原因，而不是減數分裂的結果。DNA分子雙鏈斷裂才能與同源分子發(fā)生鏈的交換，藉以將同源染色體分配到子代細胞中去。因此，雙鏈斷裂啟動重組，也啟動了減數分裂。第30頁,共88頁，2024年2月25日，星期天6.2.4雙鏈斷裂重組模型

（modelofdouble-strandbreaksrecombination）

一條染色體的兩條鏈都發(fā)生了斷裂，斷裂是由內切酶水解磷酸二酯鍵的結果。DNA斷裂之后由核酸外切酶擴大缺口,接著是斷裂鏈的游離3’端插入到具有完整雙鏈的同源染色體中，形成D-環(huán)結構。在DNA聚合酶的作用下，斷裂兩條鏈分別以完整鏈為模板開始合成,最后再通過斷裂重接過程完成重組。第31頁,共88頁，2024年2月25日，星期天在受體中形成雙鏈斷裂斷裂擴大為含有3’端的間隙3’端轉到其他的雙鏈體上3‘端的合成替換了間隙的一條鏈置換的鏈遷移到其他雙鏈體上DNA的合成發(fā)生于其他3’端間隙被供體序列替代相互移動產生了雙交換第32頁,共88頁，2024年2月25日，星期天6.3重組和酶在原核生物同源重組中存在8個堿基組成的Chi位點（重組熱點）——

5'GCTGGTGG3'3'CGACCACC5'

在E.coli中每隔約5~10kb有一個拷貝Rec和Ruv蛋白參與重組。第33頁,共88頁，2024年2月25日，星期天RecA蛋白RecA具有單鏈DNA和雙鏈DNA的結合活性，能啟動DNA單鏈和與之互補的雙鏈分子進行堿基配對——催化單鏈取代。

RecA能促進SOS反應中的蛋白酶活性。第34頁,共88頁，2024年2月25日，星期天

單鏈取代

(single-stranduptake)其中一個DNA分子要有單鏈區(qū)；其中一個DNA分子要有游離的3'末端；單鏈區(qū)和3‘末端可和另一DNA分子互補。

RecA具有的處理DNA活性使一條單鏈能與一條雙鏈體中的同源部分發(fā)生置換，這個反應稱為單鏈同化。這個置換反應可發(fā)生在幾種不同構型的DNA分子之間，但要具備3個條件：第35頁,共88頁，2024年2月25日，星期天在雙鏈體與單鏈分子之間RecA催化鏈交換只要其中的一條反應鏈有游離端,RecA就能促進入侵的單鏈同化于雙鏈體DNA中第36頁,共88頁，2024年2月25日，星期天RecA蛋白介導的DNA鏈交換模型第37頁,共88頁，2024年2月25日，星期天RecBCD復合體具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。在Chi位點產生單鏈3’游離未端.Chi位點能夠改變RecBCD的酶活性。一旦RecBCD識別出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便發(fā)生變化，其3’→5’外切酶活性受到抑制，5’→3’外切酶活性被激活，由原來優(yōu)先降解3’末端鏈，改變?yōu)橹唤到?’末端鏈。但是它的解旋酶活性未受到影響。RecBCD酶活性變化的結果是產生3’末端帶有Chi位點的ssDNA。RecBCD蛋白第38頁,共88頁，2024年2月25日，星期天RecBCD核酸酶從一邊開始向chi位點前進,當它前進時,它降解DNA,在chi位點,它進行核酸內切,而后失去RecD,并保留解旋酶活性.第39頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共88頁，2024年2月25日，星期天RuvA可識別Holliday的連接點結構RuvB是ATPase，可發(fā)動遷移反應RuvC是一種內切酶，可特異識別Holliday分枝，它在體外可切這個連接體，解離重組中間體。Ruv蛋白第41頁,共88頁，2024年2月25日，星期天RuvAB是個不對稱的復合體，它推進Holliday結合點的分叉遷移第42頁,共88頁，2024年2月25日，星期天損傷DNA的復制產生間隙RecA介導鏈交換第二鏈交換間隙由DNA合成來填補RuvAB介導分叉遷移RuvC切除Holliday連接點第43頁,共88頁，2024年2月25日，星期天6.4位點特異性重組位點特異性重組是發(fā)生在DNA上特定序列之間的重組，不依賴于DNA順序的同源性，由能識別特異DNA序列的蛋白質介導，并不需要RecA蛋白和單鏈DNA。第44頁,共88頁，2024年2月25日，星期天6.4位點特異性重組λ噬菌體DNA侵入大腸桿菌細胞后，面臨著裂解生長和溶原生長的選擇。要進入溶原狀態(tài)，游離的λ噬菌體DNA要插入到宿主的染色體DNA中去，這個過程稱為整合（integration）。由溶原生長進入裂解生長，λDNA又必須從宿主染色體上切除下來，這個過程稱為外切（excision）。整合和外切均需要通過細菌DNA和λDNA特定位點之間的重組來實現，這些位點稱為att位點（attachmentsite）。λ噬菌體的int編碼整和酶來催化整和反應。第45頁,共88頁，2024年2月25日，星期天位點專一性重組的核苷酸序列1.POP’:O為15bp(核心)富含A-T的非對稱序列；

P為-160~0的160bp序列

P’為0~80的80bp序列2.BOB’:B為-11~0序列

B’為0~11序列λ噬菌體的整合和切除共240bp共23bp第46頁,共88頁，2024年2月25日，星期天通過在attB和attP之間的相互重組，噬菌體環(huán)狀DNA轉變成線性的前噬菌體；而通過在attL和attR之間的相互重組，前噬菌體能被外切出來。第47頁,共88頁，2024年2月25日，星期天λ-DNA對E.coli的整合：

POP’+BOB’→BOP’—POB’需要整合酶(Int—拓撲異構酶活性)和整合宿主因子(IHF)參與λ-DNA從E.coli的切離：

BOP’—POB’→POP’+BOB’需要整合酶(Int)、整合宿主因子(IHF)和切除酶(Xis)參與。所有這些蛋白質都結合到attL和attR的P和P’臂上，而attL和attR中央的核心序列并排對齊排列促進原噬菌體的切除。λ噬菌體的整合和切除第48頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第49頁,共88頁，2024年2月25日，星期天整合的過程:具有對特異性DNA強烈親和力的Int與attP和attB位點結合；

Int的拓撲異構酶活性，使兩條雙鏈各自斷開一條單鏈，瞬間旋轉然后交換連接，形成Holliday中間體，在另兩條單鏈之間發(fā)生同樣的斷裂重接，從而完成雙鏈間的重組。第50頁,共88頁，2024年2月25日，星期天Int和IHF結合到attP的不同位點，在核心區(qū)域的Int識別位點包括被切割位點第51頁,共88頁，2024年2月25日，星期天attB和attP的共同核心序列的交叉切割允許成十字架狀的連接，使相互之間能產生重組連接點。第52頁,共88頁，2024年2月25日，星期天轉座

在生物的基因組中存在一類特殊的DNA序列，它們能夠作為獨立的單位從基因組的一個位置移動到另一個位置，這種能夠改變自身位置的DNA序列被稱為轉座子（transposons）。第53頁,共88頁，2024年2月25日，星期天

所有的轉座子都有兩個基本特征。首先，轉座子的兩端為反向重復序列（invertedrepeat）。第二，轉座子至少含有一個編碼轉座酶（transposase）的基因。很多轉座子還攜帶有與轉座不相關的基因，例如抗生素抗性基因、毒性基因等。這些基因位于轉座子內，隨轉座子一起從一個DNA分子移動到另一個DNA分子，對基因組的進化產生了十分重要的影響。第54頁,共88頁，2024年2月25日，星期天DNA轉座子

（一）細菌的DNA轉座子1.插入序列(insertionsequences,IS)插入序列是最簡單的轉座子。典型的插入序列長750～1500bp，具有10～40bp長的末端反向重復序列。IS元件的兩個末端并非是十分精確的反向重復序列。所有的IS元件都含有一個編碼區(qū)，它編碼的轉座酶能識別IS元件的末端重復序列，為一種介導轉座過程關鍵蛋白質組分。轉座酶對IS元件兩個邊界的識別保證了IS元件作為一個整體在基因組中移動。第55頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第56頁,共88頁，2024年2月25日，星期天IS元件位于細菌的染色體上，也存在于噬菌體和質粒的DNA分子中。在大腸桿菌的染色體中發(fā)現了幾個拷貝的IS1、IS2和IS3。F因子中沒有IS1，但有一個拷貝的IS2和兩個拷貝的IS3。當質粒和染色體上具有相同的IS元件時，質?？梢酝ㄟ^同源重組整合到宿主細胞的染色體上。第57頁,共88頁，2024年2月25日，星期天復合轉座子

(compositetransposon)

中心區(qū)攜帶有抗藥性標記(Drugmarker)，兩側有被稱為模塊（module）的IS元件或類IS元件。

每個IS元件都有以倒轉重復序列為末端的一般結構，所以復合轉座子也是以同樣的倒轉重復序列為末端的。有些復合轉座子兩側IS序列是相同的,另一些例子中，模塊高度同源但不相同。與IS序列一樣，復合轉座子的轉座也會在靶基因組中產生短的正向重復。第58頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第59頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第60頁,共88頁，2024年2月25日，星期天Tn3

轉座子Tn3代表另一類更為復雜的轉座子。這類轉座子的兩個側翼序列不是IS或類IS序列，而是短的倒轉重復序列；Tn3的反向重復序列的長度是38bp。在兩個倒轉重復序列之間有3個基因。

第61頁,共88頁，2024年2月25日，星期天AmapoftransposonTn3.第62頁,共88頁，2024年2月25日，星期天轉座的分子機制

轉座子可以通過兩種機制進行轉座。一種是保守型轉座（conservativetranspositin），一種是復制型轉座（replicativetransposition）。在保守型轉座中，轉座元件從供體位點上切除，然后插到靶位點上，因此這個機制又叫做剪切－粘貼轉座（cut-and-pastetransposition）。在復制型轉座中，轉座子被復制，轉座的DNA序列是原座因子的一個拷貝，而不是它本身。因此，復制型轉座伴隨著轉座子拷貝數的增加。第63頁,共88頁，2024年2月25日，星期天1.保守轉座某些細菌轉座子，包括很多IS元件和復合轉座子，都是通過一種稱為剪切－粘貼機制進行轉座的。這種相對簡單的機制是一個保守的過程，即只有靶序列被復制，而原始的轉座子則不發(fā)生復制。第64頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第65頁,共88頁，2024年2月25日，星期天2.復制型轉座進行復制型轉座的轉座子除了具有編碼轉座酶的基因外，還具有編碼解離酶（resolvase）的基因以及解離酶的作用位點，即內部解離位點（internalresolutionsite,IRS）。第66頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第67頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第68頁,共88頁，2024年2月25日，星期天69(四)真核生物DNA轉座子

1.玉米胚乳顏色的控制因子第69頁,共88頁，2024年2月25日，星期天花斑色是由于突變造成的，而且這種突變不是常規(guī)突變，是與一種“控制因子”（controllingelement)的存在引起的。（2）解釋如果有C基因，胚乳合成色素，呈紫色；如果C突變（c），胚乳無色素，呈白色。在c胚乳的發(fā)育過程中，部分細胞發(fā)生恢復突變（C），形成色斑。突變發(fā)生的越早，色斑就越大。（1）雜交結論第70頁,共88頁，2024年2月25日，星期天McClintock認為原來的c突變是由一個“可移動的控制因子”（現在稱轉座子）引起的，稱為Ds，即解離因子（dissociator）。它可以插入到C基因中。另一個可移動的控制因子是Ac，稱激活因子（activator），它的存在能夠激活Ds轉座進入C基因或其它基因，也能使Ds從基因中轉出，使得突變基因回復突變成野生型基因，這就是著名的Ac-Ds系統(tǒng)。第71頁,共88頁，2024年2月25日，星期天（3）對突變的解釋：Ac-Ds系統(tǒng)為什么總是恢復突變、而且高頻率？McClintock認為C突變?yōu)閏是由于一個“可移動的控制因子”（transposablecontrollingelement）的插入引起的，她稱之為Ds（dissociator）。①解離因子Ds第72頁,共88頁，2024年2月25日，星期天另外還有一個控制因子Ac（activator），它能激活：②激活因子AcDs插入C基因（引起突變），或從C基因中轉出（恢復突變）。W:white（C基因）第73頁,共88頁，2024年2月25日，星期天在插入位點上造成8bp的正向重復（DR），并導致染色體斷裂。Ac引起Ds插入色素基因第74頁,共88頁，2024年2月25日，