畜禽繁殖技術(shù)-第六章-繁殖生物工

第六章繁殖生物工程技術(shù)隨著現(xiàn)代化畜牧業(yè)的迅速發(fā)展和科技進步，高度集約化的生產(chǎn)方式，要求最大限度地提高家畜繁殖力，與此相適應，家畜繁殖技術(shù)的研究也發(fā)展到了一個新階段，即繁殖生物工程階段，也就是有意識地干預或控制家畜的繁殖過程，達到縮短繁殖周期，提高家畜繁殖效能的目的。畜禽繁殖工程技術(shù)涉及到繁殖的各個環(huán)節(jié)，從性成熟、發(fā)情、配種、妊娠、分娩直到哺乳，均已研究出了一系列相應的控制方法，如目前業(yè)以中試、應用的誘導發(fā)情技術(shù)、同期發(fā)情技術(shù)、超數(shù)排卵技術(shù)、人工授精和精液冷凍保存技術(shù)、胚胎移植、誘發(fā)分娩、早期斷奶、人工哺乳等技術(shù)，以及正在研究中的卵母細胞體外培養(yǎng)成熟和受精、卵子和胚胎的冷凍保存、性別控制與早期胚胎性別鑒定、受精卵的細胞移植、細胞核移植(無性繁殖或單性繁殖)等一些新的繁殖控制技術(shù)，必將對生物科學乃至人類社會產(chǎn)生重大影響，也將導致畜牧業(yè)產(chǎn)生驚人的技術(shù)革命。本章擬重點對發(fā)情控制技術(shù)、胚胎移植技術(shù)以及配子、胚胎生物工程等技術(shù)作一介紹。其主要內(nèi)容包括：

1、發(fā)情控制技術(shù)

2、胚胎移植技術(shù)

3、配子、胚胎生物工程課題1發(fā)情控制技術(shù)【目的要求】1．熟悉同期發(fā)情、誘導發(fā)情和超數(shù)排卵的概念、意義。2．了解同期發(fā)情、誘導發(fā)情和超數(shù)排卵的機理。3．明確期發(fā)情、誘導發(fā)情和超數(shù)排卵的方法。【基本內(nèi)容】1、誘導發(fā)情技術(shù)

2、同期發(fā)情技術(shù)

3、超數(shù)排卵技術(shù)【重點難點】1、誘導發(fā)情的方法

2、同期發(fā)情的方法

3、超數(shù)排卵的方法【內(nèi)容講授】發(fā)情是母畜繁殖過程中的一個重要環(huán)節(jié)，如果能夠通過人為的方法改變母畜的發(fā)情活動，使一群母畜在特定的時間內(nèi)同時發(fā)情，使通常產(chǎn)單胎的家畜能產(chǎn)雙胎或得到更多的胚胎，從而人為地控制和調(diào)整發(fā)情、排卵規(guī)律，使母畜按照人們的要求，在一定的時間發(fā)情、排卵和配種，這就是家畜的繁殖控制。

(一)誘導發(fā)情技術(shù)

誘導發(fā)情是指對處于乏情狀態(tài)(無發(fā)情周期)的母畜，利用外源激素(如促性腺激素)和某些生理活性物質(zhì)(如初乳)以及環(huán)境條件的刺激，促使乏情母畜卵巢從相對靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闄C能性活躍狀態(tài)，以恢復母畜正常發(fā)情和排卵的技術(shù)。

1．誘導發(fā)情的意義利用誘導發(fā)情可以控制母畜的發(fā)情時間，縮短繁殖周期，增加胎次和產(chǎn)仔數(shù)，提高其繁殖力；可以調(diào)整產(chǎn)仔季節(jié)，使奶畜一年內(nèi)均衡產(chǎn)奶，使肉畜按計劃出欄，按市場需求供應畜產(chǎn)品，提高畜牧業(yè)經(jīng)濟效益。

2．誘導發(fā)情的機理家畜的一切性活動始終是在內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)的共同作用下進行的，用外源激素和神經(jīng)刺激通過內(nèi)分泌和神經(jīng)的作用，激發(fā)卵巢的機能，使卵巢從相對靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)為活躍狀態(tài)，促進卵泡的生長發(fā)育，繼而使母畜發(fā)情、排卵并予以配種。

3．家畜誘導發(fā)情的方法

(1)生殖激素處理

羊

在非發(fā)情季節(jié)，對乏情期母羊用孕激素處理6-9天，在停藥前：48小時按每千克體重注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)151U，母羊同期發(fā)情率可達95％以上，第一情期受胎率為70％左右；用促卵泡素(FSH)和氯地酚也可促使母羊發(fā)情排卵。產(chǎn)后1個月以上的泌乳母山羊，在其耳背皮下埋植60mgl8—甲基炔諾酮藥管維持9天。取除藥管前48小時，按每千克體重肌注PMSGl51U，與此同時，再以2mg溴隱停間隔12小時作兩次注射，當母羊發(fā)情時再以促黃體素(LH)每只10微克作靜脈注射后給予配種。利用這種方法可使誘導發(fā)情率達90％以上。

馬非發(fā)情季節(jié)的母馬，每日注射雌激素5-10mg，連續(xù)10-15天，總劑量為75-150mg，可在一定程度上恢復發(fā)情周期。

?？蓮漠a(chǎn)后2周開始，采用孕激素處理10天左右，每頭牛再注射PMSGl000IU，即可誘導發(fā)情?；蛘卟捎门３跞?0mL，同時注射新斯的明10mg，在發(fā)情配種時再肌注LHl00微克，可誘發(fā)80％-90％的母牛發(fā)情并排卵、受胎。

豬哺乳母豬在產(chǎn)后1個月斷奶，將仔豬進行人工哺乳，母豬在1周左右即可發(fā)情，若在斷奶時注射PMSG，則發(fā)情效果更好。如果在母豬哺乳期內(nèi)實行部分斷奶，即從哺乳21天開始，每天哺乳12小時，3天后再注射PMSG，則可促使母豬發(fā)情。另外，用人工合成的公豬外激素噴灑于乏情期韻母豬鼻端，可使母豬在數(shù)日內(nèi)發(fā)情。

(2)改變光照期

羊母羊是由長日照過渡到短日照后開始表現(xiàn)發(fā)情的，在春、夏季利用人工縮短光照時間，模擬秋季的光照期，每日光照8小時，黑暗16小時，一般在處理后7—10周開始發(fā)情。

馬在馬廄內(nèi)離地面2．5m高處懸掛200-400W燈泡，從日落開始延長5-6小時的光照時間，母馬的卵巢機能可在翌年1月下旬到2月中旬提前恢復，表現(xiàn)出正常發(fā)情。

(3)公畜刺激在與公畜隔離的母畜群里，于發(fā)情季節(jié)到來之前，將公畜放人母畜群里，則會較好地刺激母畜，使其提前發(fā)情，即所謂的“公畜效應”(二)同期發(fā)情技術(shù)

同期發(fā)情就是采用激素或類激素的藥物處理母畜，使其在特定時間內(nèi)集中發(fā)情，并排出正常的卵細胞，以便達到共同配種和共同受胎的目的。

1．同期發(fā)情的意義

(1)可以促進冷凍精液更迅速更廣泛的應用:采用同期發(fā)情技術(shù)可以進一步擴大冷凍精液的應用范圍，提高冷凍精液設備的利用效率，使人工授精工作可以做到成批、集中、定時，不需作發(fā)情鑒定及試情工作。

(2)便于合理組織和安排畜牧業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)和進行科學的飼養(yǎng)管理:同期發(fā)情可以使一系列繁殖過程，如配種、妊娠、分娩、仔畜培育和斷奶等相繼得到同期化，這對節(jié)省勞動力和時間，合理組織管理和降低管理費用具有很大的經(jīng)濟意義。

(3)提高家畜繁殖率:同期發(fā)情不僅應用于發(fā)情周期正常的母畜，而且也可使乏情期的母畜出現(xiàn)性周期活動，縮短了母畜的繁殖周期，提高了繁殖率。

(4)為胚胎移植創(chuàng)造條件:家畜胚胎移植成功的關(guān)鍵是要求供體和受體母畜達到同期發(fā)情，這樣就能使其生殖器官處于相同的生理狀態(tài)，移植的胚胎才能正常發(fā)育。

2．同期發(fā)情的原理

在母畜卵巢機能和形態(tài)變化的過程中，黃體期的結(jié)束是卵泡期到來的前提條件，只要一群母畜的黃體期同時結(jié)束，‘即可引起它們同時發(fā)情。同期發(fā)情技術(shù)就是借助外源性激素直接或間接作用于卵巢，促使群體母畜卵巢的生理機能處于相同階段，為同期發(fā)情創(chuàng)造一個共同的基礎。

周期發(fā)情技術(shù)一般有兩種途徑。一種是給一群母畜同時施用孕激素類藥物，抑制卵泡的生長發(fā)育和發(fā)情表現(xiàn)。經(jīng)過一定時期后同時停藥，由于卵巢上的周期黃體退化，于是同時出現(xiàn)卵泡發(fā)育，引起母畜同時發(fā)情(圖5—45)。其實質(zhì)就是人為地延長了黃體期，推遲發(fā)情期到來的作用，為該群體母畜的下一個發(fā)情周期創(chuàng)造一個共同的起點，使發(fā)情同期化。

另一種途徑是利用性質(zhì)完全不同的前列腺素，加速功能性黃體的消退，使卵巢提前擺脫體內(nèi)孕激素的控制,于是群體母畜卵巢上的卵泡同時開始發(fā)育，以達到同期發(fā)情(圖5—46)。這種情況實際上是縮短了母畜的發(fā)情周期，使其發(fā)情期提早出現(xiàn)，它只適用于有正常發(fā)情周期活動的母畜。3．使家窘周期發(fā)情的藥物

(1)抑制卵泡發(fā)育的制劑。如孕酮、甲孕酮、氟孕酮、氯地孕酮、甲地孕酮及18-甲基炔諾酮等。這類藥物的用藥期可分為長期(14-21天)和短期(8-12天)：兩種，一般不超過一個正常發(fā)情周期。

(2)，諮解黃體的制劑。前列腺素如PCf2a和氯前列烯醇具有顯著的溶解黃體的作用，在用于同期發(fā)情處理時，只限于正處在黃體期的母畜。

(3)配合強化制劑。在使用同期發(fā)情藥物的同時，如果配合使用促性腺，則可以增強發(fā)情同期化和提高發(fā)情率，并促使卵泡更好地成熟和排卵。這類藥物常用的有孕馬血靖促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡素(FSH)、促黃體素(LH)、促黃體素釋放激素(LHRH)，另外還有促性腺索釋放激素(GnRH)和氯地酚。4．同期發(fā)情的處理方法

(1)牛前列腺素法對卵巢上有功能性黃體存在的母牛采用前列腺素類似物，劑量1－2mg，分兩次子宮內(nèi)灌注，再配合使用促性腺激素，6天內(nèi)排卵的母牛達90％以上，并且大多集中在用藥后3-5天內(nèi)排卵。

埋植法應用孕激素藥物時多采用18—甲基炔諾酮作皮下埋植，一般用量為；18－25mg，經(jīng)10-12天后除去藥管，為提高效果，也可以配合使用促性腺激素。

陰道栓塞法：用孕激素陰道栓預處理7天，并于第6天結(jié)合使用PGF2a，第乍靈撤除孕激素陰道栓即可。

(2)羊

陰道栓塞法將一塊消毒過的泡沫塑料(直徑和厚度各2—3cm)拴上細線，浸以孕激素制劑溶液，制成陰道栓，在子宮頸外口處放置14-16天后取出，并肌注PMSG400-7501U，2-3天后大多數(shù)母羊發(fā)情，于發(fā)情當天和次日各輸精一次。其藥物種類和用量為：甲孕酮40-60mg，用地孕酮40-5mg噸，18—甲基炔諾酮30-40mg，氯地孕酮20-30mg，氟孕酮30－60mg；孕酮150-300mg.

前列腺素法在發(fā)情結(jié)束后數(shù)日，向母羊子宮注入或肌注前列腺素，用藥后2－3天內(nèi)大多數(shù)處理母羊發(fā)情，藥物用量為牛的1／4，類似于牛的同期發(fā)情處理方法。

(3)馬

一般使用前列腺素處理，其方法與牛相似，兩次處理的時間間隔為8天，結(jié)合使用促性腺激素時效果更好。

(4)豬斷奶配合激素對豬切實可行的方法是結(jié)合斷奶進行，如在產(chǎn)后4-6周，使一群母豬同時斷奶，可造成自然的同期發(fā)情。但在斷奶時同時注射：PMSG750-1500IU或在肌注PMSG的同時，再注射HCG5001U，效果較好。非激素制劑對各種生理狀態(tài)的母豬，利用氯地酚可引起同期發(fā)情。使用時，先用少量酒精溶解，然后加入生理鹽水，使氯地酚含量達到20mg／mL，每次注射氯地酚30-40mg，注射后4-7天，大多數(shù)母豬皆發(fā)情。各種家畜同期發(fā)情處理的效果如何，受多種因素的影響，如母畜的生理狀態(tài)、年齡、體況和藥物種類、質(zhì)量、劑量和施用方式等。如果被處理的母富有80-90％集中在處理后第2天4天內(nèi)表現(xiàn)發(fā)情，情期受胎率達50—60％或相當于當?shù)刈匀话l(fā)情的受胎率，同期發(fā)情技術(shù)便認為是成功的，可以在生產(chǎn)中廣泛應用。(三)超數(shù)排卵技術(shù)

應用外源性促性腺激素誘發(fā)母畜卵巢的多個卵泡同時發(fā)育，并排出具有受精能力的卵的方法稱為超數(shù)排卵，簡稱“超排”

1、超數(shù)排卵的意義

哺乳動物的初生卵巢上含有20萬-40萬個卵母細胞，但在自然條件下僅有數(shù)十個卵母細胞得l~AiE常發(fā)育并排卵。為了提高動物的繁殖效率，應用超排技術(shù)可以使每次排卵數(shù)由1-3個增加至10-20個：，或經(jīng)過超排處理后，人工由母畜卵巢回收卵母細胞并培養(yǎng)成熟，使之受精形成早期胚胎，以開發(fā)卵母細胞資源，充分挖掘優(yōu)良母畜的繁殖潛力，加速品種改良。

2．超數(shù)排卵的原理自然情況下，家畜卵巢上約有99％的有腔卵泡發(fā)生閉鎖而退化，只有1％能發(fā)育成熟而排卵。在家畜有腔卵泡閉鎖之前，注射FSH或PMSG可使大量卵泡不閉鎖而正常發(fā)育成熟，在排卵之前注射Ht或HCG補充內(nèi)源性LH的不足，可保證這些大量成熟卵泡同時排卵，形成超數(shù)排卵。3、各種家畜的超數(shù)排卵處理的方法

羊

成年母羊在預定發(fā)情到來之前的4天，即發(fā)情周期的第12-13天，皮下或肌注PMSG750-10001U，發(fā)情或配種當日肌注HCG500-7501U，則可達到超數(shù)排卵目的；也可以在同樣時間開始注射FSH代替PMSG，用LH代替HCG，F(xiàn)SH連續(xù)注射3天，每天上、下午各注射4-5mg，共200-3001U，LH100-1501U。

牛

在胚胎移植時采用，處理方法同羊。在預計發(fā)情到來之前的4天，即發(fā)情周期第14-16天注射PMSG或FSH，經(jīng)4天或發(fā)情后再注射HGG，其用量為羊的3-4倍。目前采用的方法多在發(fā)情周期的第9-11天開始用遞減法注射FSH，每日兩次：連續(xù)4

天，總劑量為32-40mg(或360-400IU)，開始注射后第3天或48小時肌注前列腺素PGF2a

2-4mg。

4．超數(shù)排卵的效果

(1)受胎率超數(shù)排卵處理的卵子受精率和母畜受胎率均低于自然發(fā)情的受精率和受胎率?；厥张咛サ臅r間越晚，變性胚胎的比例就越大，因此回收胚胎的時間應適宜。

(2)排卵數(shù)供體母畜一次超數(shù)排卵的數(shù)目不宜過多，兩側(cè)卵巢第一次排卵以10-15枚較好。

(3)發(fā)情率應用促性腺激素和PGF2a進行超排處理時，有60-80％的母畜有發(fā)情表現(xiàn)，有的供體雖不表現(xiàn)發(fā)情，卻能正常排卵。

(4)發(fā)情出現(xiàn)時間和胚胎回收率超數(shù)排卵處理時，供體母畜在注射PGF2a。后48小時以內(nèi)發(fā)情者胚胎的回收率最高，72小時以后發(fā)情者胚胎的回收率大為下降，而且大多為未受精卵。

(5)發(fā)情周期超數(shù)排卵后的母畜，血液中含有高濃度的孕激素，因而發(fā)情周期延長?！緩土曀伎肌?、名詞：誘導發(fā)情、同期發(fā)情、超數(shù)排卵2、誘導發(fā)情、同期發(fā)情、超數(shù)排卵的意義3、誘導發(fā)情、同期發(fā)情、超數(shù)排卵的方法【目的要求】

1．熟悉體外受精、性別控制、性別鑒定、卵核移植、動物克隆、胚胎分割與嵌合、基因?qū)氲燃夹g(shù)的的概念、意義。2．了解體外受精、性別控制、性別鑒定、卵核移植、動物克隆、胚胎分割與嵌合、基因?qū)氲燃夹g(shù)的基本原理。3．明確體外受精、性別控制、性別鑒定、卵核移植、動物克隆、胚胎分割與嵌合、基因?qū)氲燃夹g(shù)的實施程序?！净緝?nèi)容】

1、體外受精技術(shù)

2、胚胎性別控制及鑒定技術(shù)

3、核移植與動物克隆技術(shù)

4、胚胎分割與嵌合技術(shù)

5、基因?qū)爰夹g(shù)【重點難點】

本課題只作一般性介紹。課題2胚胎生物工程技術(shù)【內(nèi)容講授】

一、體外受精技術(shù)體外受精技術(shù)是動物胚胎工程的一項重要技術(shù)，是指通過人為操作使精子和卵在體外環(huán)境中完成受精過程。體外受精技術(shù)不僅對揭示卵母細胞成熟和受精機理具有重要的理論意義，而且對畜牧業(yè)的發(fā)展具有廣泛的應用前景。其操作技術(shù)如下：

1．精子采集與獲能處理精子的采集可采用射出精子或附睪尾精子。精子可在體內(nèi)子宮中獲能，也可在體外獲能。

2．卵母細胞采集與成熟培養(yǎng)將屠宰動物的卵巢取出，用生理鹽水沖洗后，放入盛有生理鹽水的保溫瓶內(nèi)運回實驗室，用注射器針頭抽取卵母細胞。然后將卵母細胞放在培養(yǎng)液中，在39cC和5％C02氣相條件下培養(yǎng)24小時左右。

3．精卵體外受精將成熟培養(yǎng)的卵母細胞先用受精液洗滌三次，然后加入獲能精子，置于C02培養(yǎng)箱孵育。

4．受精的判定在精子和卵母細胞進行體外受精的過程中，隔一定時間檢查受精情況，如在固定染色的整裝片上出現(xiàn)精子穿人卵內(nèi)、精子頭部膨大、精于頭部和尾部在卵細胞質(zhì)內(nèi)存在、第二極體的排出、原核的形成和正常的卵裂等即確定為受精。如將受精卵移植到同期發(fā)情的受體中，能產(chǎn)出正常的試管后代，這是判斷體外受精成功的最確鑿的證據(jù)。

5．體外受精卵(早期胚胎)的培養(yǎng)發(fā)育將受精卵移入培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，為了克服早期胚胎體外發(fā)育阻滯現(xiàn)象，并獲得較高的發(fā)育率，多采用與卵丘細胞、輸卵管上皮細胞等共同培養(yǎng)的方法，使其發(fā)育至桑葚期或囊胚期，然后即可用于胚胎移植或其他生物工程的操作。

1981年6月9日，世界上第一個體外受精的牛犢在美國產(chǎn)生。迄今為止，已有20余種哺乳動物體外受精獲得成功，我國在這一技術(shù)上研究起步較晚，但進展十分迅速，目前已在綿羊、奶牛、水牛、山羊、豬等家畜及多種動物上獲得成功，步人了世界先進行列，有的達到國際領(lǐng)先水平。

二、胚胎性別控制及性別鑒定技術(shù)

（一）胚胎性別控制技術(shù)

胚胎性別控制是指結(jié)合胚胎移植技術(shù)，選擇所需性別的胚胎，或?qū)⑺栊詣e的胚胎作為核移植的供體細胞，反復克隆，以無性繁殖的方式生產(chǎn)相應性別的胚胎，進而使母畜按人們的愿望繁殖所需性別的后代。方法主要有：1、X、Y精子的分離精于分離主要依據(jù)是X、Y精子在DNA含量、大小、比重、活力、膜電荷、酶類、細胞表面、移動速度、抵抗力上等均有差異，但差異甚小。其主要分離方法有沉降法、離心沉降法、密度梯度離心法、過濾法、層析法、電泳法及免疫學方法等。但目前均沒有取得穩(wěn)定可靠的結(jié)果。從研究現(xiàn)狀看，分離X、Y精子還存在相當大的困難，與生產(chǎn)應用尚有一定距離。

2．改變受精環(huán)境雄性動物產(chǎn)生X或Y精子，有支配性別的決定權(quán)；而雌性動物有支配性別的選擇權(quán)，改變母畜受精的環(huán)境，有可能改變性比例。（1）酸性與堿性環(huán)境：酸性環(huán)境有利于雄性發(fā)育，而堿性有利于雌性發(fā)育。多喂谷物（酸性）雌雄比例為1：1.7，多喂青貯飼料（堿性）則相反。日本的學者利用5％精氨酸（堿性）預先處理子宮頸后輸精，使牛的母犢控制率達80％。（2）營養(yǎng)環(huán)境：伯羅斯和柯瓦列夫斯基發(fā)現(xiàn)戰(zhàn)爭、饑荒年代和營養(yǎng)不良的母親生男孩兒多。（3）氣候環(huán)境：婁根娜等人試驗觀察奶牛在較溫暖的春夏季節(jié)交配，比在秋冬時交配有較多的母犢。（4）雙親年齡：婁根娜等人發(fā)現(xiàn)中年雙親多生雌性，父比母大多生雄性。（5）交配次數(shù)：實驗表明，一天內(nèi)多次交配雄性較多。（6）受精時間：卵子剛排出時受精雌性多，相反雄性多。(二)胚胎的性別鑒定

對胚胎的性別進行鑒定，選擇(淘汰)某一性別的胚胎，仍不失為一種控制后代性別較為理想的方法。

1．細胞遺傳學方法

(1)性染色質(zhì)染色法雌性胚胎的兩個X染色體中。有一條處于暫時失活狀態(tài)并固縮，有特殊的染色反應，這種性染色質(zhì)小體稱為Barr小體。Gar&ar根據(jù)性染色質(zhì)鑒定家兔囊胚(6月齡)的性別，準確率為100％。但對其他大家畜來說，胚胎細胞的Barr小體不易觀察，所以未能普遍應用。

(2)染色體組型分析法從胚胎取出部分細胞直接進行染色體分析或阻斷培養(yǎng)至細胞分裂中期再進行染色體分析，對胚胎進行性別鑒定。據(jù)報道用此法鑒別牛胚胎性別準確率達70％一80％。

2．X染色體連鎖酶活性測定法在小鼠，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖激酶及。a—乳糖酶等與X染色體的數(shù)量有關(guān)。Rieger和Williams(1986)通過檢測X染色體連鎖酶來判別小鼠胚胎的性別，雌性胚胎鑒別準確率達72％。

3．Y染色體特異性基因探針法

Leonard(1987)首次報道用牛Y染色體特異性探針鑒定牛囊胚性別獲得成功，準確率為95％；Herr(1990)首先采用PCR技術(shù)擴增Y染色體特異性，重復序列鑒定了牛、羊胚胎性別；Peura(1991)用PCR技術(shù)對牛的部分胚胎進行了鑒定，準確率達90％一95％。

Sinclair等(1990)找到了位于哺乳動物Y染色體短臂上決定雌性的DNA，片斷，這一特定的DNA片斷，定名為SRY(性別決定區(qū)或叫性別決定因子)。SRY的發(fā)現(xiàn)和測定技術(shù)的成功，為胚胎性別鑒定提供了技術(shù)途徑，與聚合酶鏈反應(PCR)擴增技術(shù)相結(jié)合，用于胚胎的性別鑒定準確率可達100％，此法具有省時，靈敏度高，特異性專一等優(yōu)點。因此，是很有前途的方法。

4．免疫法

(1)細胞毒性法將胚胎與H-Y抗血清及補體混合培養(yǎng)，表達H-Y抗原的胚胎其細胞有一定程序的裂解，則判定為雄性。據(jù)Epstein(1990)報道，小鼠的8細胞胚胎放人補體和抗血清之后，半數(shù)致死、退化或出現(xiàn)死細胞，分析未受影響胚胎的染色體組型，92％為雌性。

(2)間接免疫熒光法將胚胎在H-Y抗血清或單克隆抗體中培養(yǎng)，然后再加入帶熒光素標記的第二抗體，在熒光顯微鏡下觀察胚胎是否呈現(xiàn)特異性熒光。判定標準是：H-Y陽性(即胚胎整個內(nèi)細胞上有光斑，均勻熒光為背景)判為雄性。H-Y陰性(即胚胎背景黑暗，無熒光斑，偶爾有少許亮點，無光斑)判為雌性。Wachtel(1984)用間接免疫熒光鑒別8枚牛胚胎，移植后產(chǎn)犢7頭與性別判定相符。White(1984、1987)成功用此法鑒定了羊、豬胚胎性別，在綿羊中產(chǎn)羔后驗證準確率為100％，在豬中雌性胚胎準確率為86％，雄性為77％。

三、核移植與動物克隆技術(shù)

核移植也稱克隆或無性繁殖，是將分離的胚胎卵裂球(核供體)或體細胞核與成熟并去核的卵母細胞或去核的原核期受精卵或2細胞期的去核胚胎(核受體)融合，不經(jīng)過有性繁殖過程，連續(xù)不斷地復制遺傳上相同的胚胎，并通過克隆胚胎的移植生產(chǎn)大量同基因型的克隆動物系或動物群的…項動物繁殖新技術(shù)。應用核移植技術(shù)可以控制家畜的性別；可以復制大量基因型相同的高產(chǎn)家畜；可以為家畜育種提供珍貴的遺傳材料；可以加速家畜遺傳改良的進程。細胞核供體一般采用早期胚胎或體細胞核，再用顯微操作儀將其注入到去核的卵母細胞的卵周隙內(nèi)，借助電刺激，使核供體的細胞核與核受體細胞質(zhì)融合，融合后的胚胎經(jīng)培養(yǎng)發(fā)育，移植到受體內(nèi)妊娠產(chǎn)仔。核受體除用成熟并去核的卵母細胞外，也可用去核的原核期的受精卵或2細胞期去核的早期胚胎。哺乳動物核移植首先1983年在小鼠獲得成功，隨后綿羊在1987年，牛1987年，兔1988年，豬1989年，羊1991年獲得成功。Stice等(1992)研究了牛細胞核連續(xù)移植技術(shù)，并獲得了第三世代的核移植后代。在理論上，核移植可獲得無限的克隆動物。種間核質(zhì)雜交是通過核移植將來源于不同種的供體細胞核與受體細胞質(zhì)重組在一起的方法。Nolfel(1992)獲得了不同屬間(多個牛X牛、羊X羊)的核雜交囊胚，但囊胚率都很低(1．7-2．3％)。四、胚胎分割

胚胎分割是通過對胚胎顯微操作，人工制造同卵雙胎或同卵宰胎的方法。胚胎分割是擴大胚胎來源的一條重要途徑和方法。Leibo(1987)分割422枚牛胚胎，移植842個牛胚，結(jié)果441頭妊娠，半胚移植妊娠率達52．4％，可獲得一卵雙生或多生，避免牛的異性孿生不育。通過分割胚的冷凍保存，可先移植一半，另一半冷凍保存，待移植的那半胚產(chǎn)仔證實是優(yōu)秀的個體后，再將冷凍保存的半胚解凍和移植。胚胎分割為性別鑒定也提供了可能性。早期胚胎的每個細胞都具有獨立發(fā)育成一個個體的能力，這是胚胎分割得以成功的理論依據(jù)。胚胎分割有兩種方法，一種是對2～16細胞期胚胎，用顯微操作儀上的玻璃針或刀片將每個卵裂球或2個卵裂球為一組或4個卵裂球為一組進行分割，分別放人一個空透明帶內(nèi)，然后進行移植。另一種方法是用上述相同的方法將桑椹胚或早期囊胚一分為二或一分為四，將每塊細胞團移人一個空透明帶內(nèi)，然后進行移植。目前將不移人透明帶內(nèi)的經(jīng)分割的細胞或細胞塊稱裸胚，直接移植也獲成功。得到了牛、綿羊、山羊、豬、兔等通過胚胎分割而產(chǎn)生的同卵雙生后代，四分胚在牛、綿羊上也相繼成功。冷凍胚胎分割在牛和綿羊也已成功。

五、胚胎嵌合

胚胎嵌合又稱胚胎，(受精卵)的融合，是近年來繼胚胎分割后又一種新的生物技術(shù)。生物學上所說的嵌合體(Chimera)系指由不同基因型的細胞和組織混合在同一個體，由2個或2個以上的受精卵發(fā)育而成的復合體，它具有2個以上親代的特性。動物胚胎嵌合不但對品種改良及新品種培育具有重大意義，而且為不同品種間的雜交改良開辟了新的渠道，對分析胚胎的發(fā)生機制和基因表達機制以及了解性別分化或免疫機理等均具有極廣泛的利用價值。

胚胎嵌合體的制造方法主要有分裂球融合法和細胞注入法兩種。分裂球融合法就是將2個以上胚胎的分裂球相互融合，形成一個胚胎。細胞注入法，就是把其他的細胞團注入到囊胚腔內(nèi)，使之與原來的內(nèi)細胞團融合在一起。在畜禽中已培育出山羊一綿羊以及鵪鶉一雞等嵌合體動物。

六、基因?qū)耄ㄞD(zhuǎn)基因）技術(shù)

基因?qū)胂抵竿ㄟ^顯微操作手段將外源的特定基因?qū)肱咛ブ?，從而獲得轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)。通過導入外源基因獲得轉(zhuǎn)基因家畜的意義主要有以下方面：

1．提高家畜的經(jīng)濟性狀給家畜導人外源生長激素基因，可提高生長速度、飼料轉(zhuǎn)化率或胴體品質(zhì)。如1987年美國康奈爾大學用導人外源生長激素基因的方法培育瘦肉型豬，取得成功，這種豬的生長速率比普通豬快15％～18％。

2．改變畜產(chǎn)品組成結(jié)構(gòu)通過導人外源基因可從遺傳性上改變畜產(chǎn)品(肉、蛋、奶、毛)的組成結(jié)構(gòu)，如能將乳蛋白基因、乳酪蛋白基因?qū)四膛Ｖ猩a(chǎn)新型乳制品’。

3．以家畜為宿主生產(chǎn)有用的生物活性物質(zhì)是將編碼有用的生物活性物質(zhì)的基因?qū)爰倚蠹毎?，使目的基因在家畜體內(nèi)表達，這樣有用的生物活性物質(zhì)作為血液或乳汁成分便可被大量、持續(xù)地生產(chǎn)出來。如美國科學家將編碼血液凝固基因?qū)司d羊，培育出轉(zhuǎn)基因綿羊，可從乳汁中大量采集血液凝固因子，將其用于血液病患者便可起到很大作用。

4．抗病育種例如將干擾素基因的結(jié)構(gòu)基因和肝臟中特異性表達的基因啟動子相連接并導人家畜中，有可能培育出干擾素產(chǎn)生能力強，且可以遺傳的轉(zhuǎn)基因家畜。現(xiàn)行外源基因?qū)朔椒ㄖ饕校?/p>

1．病毒感染法即將目的基因整合到反轉(zhuǎn)錄病毒的原病毒上，然后將基因直接注入胚胎，或給動物的培養(yǎng)細胞接毒并與胚胎一起培養(yǎng)，以使病毒感染胚胎.

2．微注射法即將目的基因通過顯微操作，直接注入受精卵的原核中。迄今所報道的轉(zhuǎn)基因小鼠大部分是用這種方法培育的。

3．胚胎干細胞法即將外源基因?qū)肱咛ジ杉毎校虻恼?、表達程度等都可在于細胞階段運行選擇，進而再產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。

4．精子載體法即將外源DNA與獲能精于一起孵背后，以精子作為載體，與卵子體外受精。該方法已在小鼠、綿羊獲得成功。盡管目前基因?qū)诉^程中尚有許多困難有待克服，將這項技術(shù)廣泛用于家畜尚存在很多技術(shù)性問題，但已得到了轉(zhuǎn)基因豬、兔、牛、羊、鼠的后代。隨著研究的不斷深入，預計隨著這項技術(shù)的日趨成熟，它將給畜牧業(yè)發(fā)展插上騰飛的翅膀。課題3胚胎移植技術(shù)【目的要求】1．明確胚胎移植技術(shù)的的概念、意義。2．熟悉胚胎移植技術(shù)的基本方法。3．掌握胚胎移植技術(shù)的實施程序?！净緝?nèi)容】1、概述

3、同期發(fā)情和超數(shù)排卵的實施

4、胚胎采集

5、胚胎的檢查與鑒定

6、胚胎保存

7、胚胎移植技術(shù)【重點難點】

本課題只作一般性介紹?！緝?nèi)容講述】一、概述

(一)含義

是將一頭優(yōu)良母畜配種后的早期胚胎取出，移植到另一頭同種的生理狀態(tài)相同的母畜體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個體，也叫借腹懷胎。提供胚胎的個體稱為供體，接受胚胎的個體稱為受體。供體決定其遺傳特性；受體只影響其體質(zhì)發(fā)育o(二)意義如果說人工授精技術(shù)是提高優(yōu)良公畜配種效率的有效方法，那么胚胎移植則是為提高優(yōu)良母畜的繁殖力提供了新的技術(shù)途徑。

1．充分發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力一則使優(yōu)良供體省去很長的懷孕期、縮短繁殖周期；二則實行超數(shù)排卵，一次可獲得更多的優(yōu)良胚胎，與提高優(yōu)良公畜的配種效能的人工授精技術(shù)相對應；如一次可獲得9頭以上的犢牛、10頭以上的羔羊。

2．縮短世代間隔，及早進行后裔測定短期內(nèi)重復進行超排處理，大大提高了后代總數(shù)，可盡早了解母畜遺傳力o3．提高生產(chǎn)效率誘發(fā)肉畜杯2胎，即向已配種的母畜(排卵的對側(cè)子宮角)移植一個胚胎，或者向未配種的母畜移植兩個胚胎。

4．代替種畜的引進胚胎的冷凍保存可以使胚胎移植跨地域和時空，大大節(jié)約購買和運輸活畜的費用。此外可以從養(yǎng)母得到免疫能力，更容易適應本地區(qū)的生態(tài)環(huán)境o5．保存晶種資源胚胎的冷凍保存，可以避免因遭受意外災害而滅絕。且費用遠遠低于活畜保存，并且它與冷凍精液可共同構(gòu)成動物優(yōu)良性狀的基因庫。

6．有利子防制疫病在養(yǎng)豬業(yè)中，為了建立S1)F豬群，向封閉豬群引進新個體時，為了控制疫病，往往采取胚胎移植技術(shù)代替剖腹取仔的方法。7．提供研究手段胚胎移植是研究受精作用、

(三)胚胎移植的基本原則

1．胚胎移植前后所處環(huán)境的同一性(1)供體和受體在分類學上的相同屬性，即兩者須屬于同一物種。(2)動物生理上的一致性。即受體和供體在發(fā)情時間上的同期性，一般要求相差24h以內(nèi)。(3)動物解剖部位的一致性。即移植后的胚胎與移植前，所處的空間環(huán)境相似性。2．胚胎發(fā)育的期限胚胎采集和移植的期限(胚胎的日齡)不能超過周期黃體的壽命，最遲要在周期黃體退化之前數(shù)日進行移植。通常在供體發(fā)情配種后3～8d收集胚胎，受體同時接受移植。3．胚胎的質(zhì)量胚胎不應受到任何不良因素(物理、化學、微生物等)的影響而危及生命力。必須經(jīng)過鑒定確認為正常者。4．供、受體的狀況供體的生產(chǎn)性能、經(jīng)濟價值均須大于受體；兩者均須健康無病。此外，還需強調(diào)的是胚胎移植只是空間位置的更換，而不是生理環(huán)境的改變；遠比器官移植簡單。但準確熟練的操作是必需的。

(四)胚胎移植的技術(shù)程序

主要包括1、供體的超數(shù)排卵。2、供體和受體的同期發(fā)情處理、3、供體的發(fā)情鑒定與配種。4、胚胎的收集、胚胎的檢查與鑒定。5、胚胎的培養(yǎng)與保存。6、胚胎移植(圖8—1)。三、同期發(fā)情和超數(shù)排卵的實施(一)供體和受體的選擇供體應具有高的育種價值，旺盛的生殖機能，對超排反應良好；受體的頭數(shù)應多于供體，具有良好的繁殖性能和健康狀態(tài)，體形中上等。二者發(fā)情時間相同或相近，前后不超過1d。(二)供體和受體的同期發(fā)情當前較理想的同期發(fā)情藥物是前列腺素及其類似物，其劑量根據(jù)藥物的種類和方法而不同。采用子宮灌注的劑量要低于肌肉注射的劑量。在注射PGF2。后2h，配合注射PMSG或FSH，可以明顯提高同期發(fā)情效果。(三)供體母畜的超數(shù)排卵

1．母牛用FSH超排，在發(fā)情的9一13d中的任何一天開始肌注FSH。以遞減劑量連續(xù)注射4d，每天注射2次(間隔12h)，總劑量按牛體重、胎次作適當調(diào)整，總劑量為300～400大鼠單位。在第一次注射FSH后48h及60h，各肌注一次PGF2a，每次2—4mg，若采用子宮灌注劑量可減半。進口PGF2a及其類似物，由于產(chǎn)地、廠家不同所用劑量不一，ICl80996一次劑量約為0．5mg。用PMSG超排，在發(fā)情周期的第11—13d中的任意一天肌注一次即可，按每千克體重51U確定PMSG總劑量，在注射PMSG后48h及60h分別肌注PGF2a。一次，劑量同F(xiàn)SH超排。母牛出現(xiàn)發(fā)情后12h再肌注抗PMSG，劑量以能中和PMSG的活性為準。

2．母羊用FSH超排，在發(fā)情周期第12或13d，開始肌注或皮下注射，以遞減劑量連續(xù)注射3d6次，每次間隔12h，總劑量為200—350大鼠單位，PGF2a。在第5d同時注射。FSH注射后隨即每天上下午進行試情，發(fā)情后立即靜脈注射LHl00—150大鼠單位或肌注200大鼠單位并配種。有的用60大鼠單位的GnRH代替LH，亦獲得同樣效果。用PMSG超排，在發(fā)情周期的12或13d，次肌注或皮下注射PMSG700—15001U，出現(xiàn)發(fā)情或當天再肌注HcG500～7501U。在PMSG注射之后，隔日注射PGF2a或其類似物。(四)供體的發(fā)情鑒定和配種

超排處理結(jié)束后，要密切觀察供體的發(fā)情癥狀。正常情況下，供體大多數(shù)在超排處理結(jié)束后12～48h發(fā)情。以牛為例，發(fā)情鑒定主要以接受其他牛爬跨且站立不動為主要判定標準。每天早中晚至少觀察3次。第一次觀察到接受爬跨且站立不動的時間，視為零時，由于超排處理后排卵數(shù)較正常發(fā)情牛多且排卵時間不一致，加上精子和卵子的運行受排卵處理的影響，為了確保卵子受精，采取增加輸精次數(shù)和加大輸精量的方法；新鮮精液優(yōu)于冷凍精液。一般在發(fā)情后8～12h輸?shù)谝淮尉?，以后間隔8～12h再輸精一次。

四、胚胎采集利用沖洗液將胚胎由生殖道中沖出，并收集在器皿中。分手術(shù)法和非手術(shù)法(牛、馬)兩種。

(一)胚胎采集前的準備

1．沖胚液、培養(yǎng)液的配制(表8—1)沖胚液和培養(yǎng)液在使用前都要加入血清白蛋白，含量一般為0.1～3.2％，也可用犢牛血清代替，需加熱(560C水浴30min)滅活其中的補體，以利胚胎存活。沖胚液血清含量一般為3％(1～5％)，培養(yǎng)液血清含量為20％(10～50％)。2．采集時間

不應早于排卵后的第1d，即最早要在發(fā)生第一次卵裂后(發(fā)育至4—8個細胞以上為宜)，否則不宜辨別卵子是否受精(表8—2)。一般是在配種后3～8d（牛：非手術(shù)法取胚在發(fā)情配種后7d；綿羊：從輸卵管取胚，適宜時間為發(fā)情后2．5d(56～76h），從子宮采胚大都在發(fā)情后6d。(二)胚胎采集方法

1．牛手術(shù)法收集胚胎在腹部適當部位(腹中線或肷窩)作一lOcm左右切口。輸卵管沖胚法：第一種方式用注射器的磨鈍針頭刺人子宮角尖端，注入沖卵液，然后從輸卵管的傘部接取(上行法)，這種方式適合于牛羊兔等(圖8-4上)；第二種方式與此相反(下行法)，傘部注入，子宮角上端接取(圖8-4中)，豬馬采用。上述兩種方法適合于胚胎還處于輸卵管或剛進入子宮角時(排卵后4d以內(nèi))。沖卵液用量lOml。（1）子宮角沖胚法：當一旦確認胚胎已進入子宮角內(nèi)，可采用此法。一種是從子宮角上端注入沖卵液，由基部接取(圖8-4下)；另一種是由子宮角基部注入、上端接取。這兩種方式適合手各種家畜。沖卵液用量一般為30－50ml(以子宮角容積而定)。（2）輸卵管一子宮角沖胚法：結(jié)合以上兩種方法，可以把輸卵管和子宮角的胚胎全部沖洗出來，采胚率高。

2．羊的手術(shù)采胚法

基本方法與牛相同。不同點是：采胚的手術(shù)部位比牛多，可選擇左右腹股溝部、肷窩及恥骨部；切口一般長4～6cm；沖胚液量比牛少，輸卵管沖胚2—4ml、子宮角沖胚10—20mlo手術(shù)法要求：操作迅速準確，防止對傷口及生殖道和沖洗液的污染；避免對動物有過多刺激和對生殖道造成損傷。此法最大的缺點易造成粘連和不孕。3．非手術(shù)法

目前在牛、馬大家畜都采用此法。一般在配種后7d進行。采用二路式導管沖卵器：將沖卵液通過內(nèi)管注入子宮角內(nèi)，然后導出沖卵液，外管前端連接一氣囊，當將沖卵器插入子宮內(nèi)時，充氣使氣囊脹大，堵住子宮頸內(nèi)口，以免沖卵液經(jīng)子宮頸流出(圖8—5