土壤中纖維素分解菌的分離

關(guān)于土壤中纖維素分解菌的分離一、課題目標(biāo)

簡(jiǎn)述纖維素酶的種類(lèi)及作用，從土壤中分離出分解纖維素的微生物，討論這類(lèi)微生物的應(yīng)用價(jià)值。

二、課題重點(diǎn)與難點(diǎn)從土壤中分離分解纖維素的微生物。

（1）纖維素酶分解纖維素生化原理（2）區(qū)別選擇培養(yǎng)與鑒別培養(yǎng)概念（3）比較纖維素粉培養(yǎng)法與剛果紅染色法原理第2頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、基礎(chǔ)知識(shí)

（一）纖維素與纖維素酶1.纖維素在生物圈的分布；

人類(lèi)以淀粉為主要能量來(lái)源，但完全不能消化纖維素，而反芻動(dòng)物和大量的微生物則主要以纖維素為能量來(lái)源。這是因?yàn)椋诜雌c動(dòng)物的瘤胃中生活著大量的可以分解纖維素的微生物。

纖維素是地球上含量最豐富的多糖類(lèi)物質(zhì).植物的根莖葉等器官都含有大量的維生素.地球上的植物每年產(chǎn)生的纖維素超過(guò)70億噸.第3頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.纖維素酶的結(jié)構(gòu)和作用原理纖維素與淀粉都是由葡萄糖組成的，但組成兩者的葡萄糖的連接方式不同，因而使兩者的形態(tài)完全不同。纖維素是由葡萄糖分子按β-1,4糖苷鍵連接而成的，淀粉是由葡萄糖分子按α-1,4糖苷鍵連接而成的。纖維素酶(復(fù)合酶)內(nèi)切酶（Cx酶）外切酶（C1酶）葡萄糖苷酶內(nèi)切酶作用于無(wú)定型的纖維素區(qū)域，使纖維素?cái)嗔殉善斡纸欣w維二糖水解酶，它可以作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)或小片段纖維素，從糖鏈末端開(kāi)始切掉兩個(gè)葡萄糖分子，產(chǎn)生纖維二糖將纖維二糖分解成葡萄糖。

第4頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）纖維素分解菌的篩選1.剛果紅染色法；2.剛果紅染色法的原理。四、實(shí)驗(yàn)案例

土壤中纖維素分解菌的分離

第5頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下:

1.土樣采集

土樣采集的方法與本專(zhuān)題課題2類(lèi)似。土樣的采集要選擇富含纖維素的環(huán)境，這是因?yàn)樵诶w維素含量豐富的環(huán)境，通常會(huì)聚集較多的分解纖維素的微生物。如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，過(guò)一個(gè)月左右也會(huì)有能分解纖維素的微生物生長(zhǎng)。2.選擇培養(yǎng)

選擇培養(yǎng)需要的儀器有：250mL錐形瓶、無(wú)菌稱(chēng)量瓶、藥匙、1mL和10mL的移液管、天平、搖床、溫度計(jì)等。第6頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在250mL錐形瓶中裝入30mL培養(yǎng)基，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層包裝紙（或報(bào)紙），用線繩扎緊，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。

選擇培養(yǎng)的操作：稱(chēng)取土樣20g，在無(wú)菌條件下加入裝有30mL培養(yǎng)基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30℃下振蕩培養(yǎng)1～2d，至培養(yǎng)基變混濁。此時(shí)可以吸取0.1mL培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板，也可以按課本中所述，重復(fù)選擇培養(yǎng)的步驟一次，然后再進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板。第7頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.剛果紅染色法分離

纖維素分解菌這一步所需要的儀器有：無(wú)菌培養(yǎng)皿、涂布器、1mL移液管，裝有9mL無(wú)菌水的20mL大試管，溫箱等。培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在500mL三角瓶中裝入200mL培養(yǎng)基，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。倒平板操作：將滅菌后的固體培養(yǎng)基熔化，按無(wú)菌操作的要求，在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中倒入15～20mL培養(yǎng)基，凝固后待用。第8頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天制備菌懸液：按照本專(zhuān)題課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋?zhuān)♂屪畲蟊稊?shù)至106。涂布平板：

將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1mL，滴加在平板培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液涂布均勻，在30℃倒置培養(yǎng)，至菌落長(zhǎng)出。每個(gè)稀釋度下需涂布3個(gè)平板，并注意設(shè)置對(duì)照。剛果紅染色的具體操作步驟參照課本［資料三］。第9頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、課題成果評(píng)價(jià)

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：對(duì)照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)則說(shuō)明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說(shuō)明可能獲得了分解纖維素的微生物。（二）分離的結(jié)果是否一致：由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，學(xué)生也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。第10頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天思考題1.本實(shí)驗(yàn)的流程與課題2中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？答：本實(shí)驗(yàn)流程與課題2的流程的區(qū)別如下。課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為惟一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過(guò)選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。第11頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？

答：由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對(duì)提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。3.將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深？答：將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對(duì)聚集，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。

第12頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.想一想，兩種剛果紅染色法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？你打算選用哪一種方法？

方法一是傳統(tǒng)的方法，缺點(diǎn)是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會(huì)使菌落之間發(fā)生混雜；其優(yōu)點(diǎn)是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，不存在菌落混雜問(wèn)題，缺點(diǎn)是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類(lèi)物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。但這種只產(chǎn)生淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中纖維素占主要地位，因此可以與纖維素酶產(chǎn)生的透明圈相區(qū)分。方法二的另一缺點(diǎn)是：有些微生物具有降解色素的能力，它們?cè)陂L(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。第13頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？

答：在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。第14頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.學(xué)完這個(gè)專(zhuān)題后,你能否總結(jié)出分離培養(yǎng)微生物的一般方法?請(qǐng)用流程圖表示.土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將菌懸液涂布到有特定選擇作用的培養(yǎng)基上挑選單菌落發(fā)酵培養(yǎng)第15頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天本課題知識(shí)小結(jié):第16頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)用途分選擇培養(yǎng)基——在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng),促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)鑒別培養(yǎng)基——在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類(lèi)的微生物。例如：伊紅和美藍(lán),和大腸桿菌的代謝產(chǎn)物結(jié)合,使菌落呈黑色（老教材說(shuō)法：深紫色,帶有金屬光澤）,鑒別大腸桿菌第17頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天例1、(20分)某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機(jī)化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細(xì)菌(目的菌)。實(shí)驗(yàn)的主要步驟如圖所示。請(qǐng)分析回答問(wèn)題：（北京卷）(1)培養(yǎng)基中加入化合物A的目的是篩選

，這種培養(yǎng)基屬于

培養(yǎng)基。目的菌

選擇

【例題解析】第18頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天例1、(20分)某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機(jī)化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細(xì)菌(目的菌)。實(shí)驗(yàn)的主要步驟如圖所示。請(qǐng)分析回答問(wèn)題：（北京卷）(2)“目的菌”生長(zhǎng)所需的氮源和碳源是來(lái)自培養(yǎng)基中的

，實(shí)驗(yàn)需要振蕩培養(yǎng)，由此推測(cè)“目的菌”的代謝類(lèi)型是

?；衔顰異養(yǎng)需氧第19頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天例1、(20分)某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機(jī)化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細(xì)菌(目的菌)。實(shí)驗(yàn)的主要步驟如圖所示。請(qǐng)分析回答問(wèn)題：（北京卷）(3)培養(yǎng)若干天后，應(yīng)選擇培養(yǎng)瓶中化合物A含量

的培養(yǎng)液，接入新的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)，使“目的菌”的數(shù)量

。

減少

增加

第20頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天例1、(20分)某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機(jī)化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細(xì)菌(目的菌)。實(shí)驗(yàn)的主要步驟如圖所示。請(qǐng)分析回答問(wèn)題：（北京卷）(4)轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng)時(shí)，常采用

方法接種，獲得單菌落后繼續(xù)篩選。

劃線第21頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天例1、(20分)某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機(jī)化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細(xì)菌(目的菌)。實(shí)驗(yàn)的主要步驟如圖所示。請(qǐng)分析回答問(wèn)題：（北京卷）(5)若研究“目的菌”的生長(zhǎng)規(guī)律，將單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，可采用的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以

為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)第22頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天例1、(20分)