《DB32T 3762.16-2021新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范 第16部分核酸數(shù)字PCR法》

ICS13.100

C50

DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3762.16—2021

新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

第16部分：核酸數(shù)字PCR法

TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detection

Part16:NovelcoronavirusnucleicaciddigitalPCRtestprocedure

2021-12-09發(fā)布2022-01-09實(shí)施

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3762.16—2021

I

DB32/T3762.16—2021

新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第16部分：核酸數(shù)字PCR法

1范圍

本文件規(guī)定了新型冠狀病毒核酸數(shù)字PCR檢測(cè)方法。

本文件適用于新冠病例、一般人群和重點(diǎn)人群的生物樣本，包括口咽拭子、鼻咽拭子、血標(biāo)本、肛

拭子等，以及其他需要檢測(cè)的樣本的核算數(shù)字PCR檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

DB32/T3762.3新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第3部分：核酸熒光PCR檢測(cè)程序

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。

數(shù)字PCR：數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digitalpolymerasechainreaction）

ORF1a/b：開(kāi)放閱讀框1a/b（openreadingframe）

dNTPs：脫氧核糖核酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

人RNaseP基因：人核糖體核酸酶基因（RibonucleaseP）

5原理

一種對(duì)核酸分子進(jìn)行絕對(duì)定量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過(guò)將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)

單元，每個(gè)單元至少包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子。在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)

增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)而計(jì)算出原始樣本中目標(biāo)分子濃度。

目前數(shù)字PCR技術(shù)包括芯片式和微滴式兩種，芯片式通過(guò)微流控芯片實(shí)現(xiàn)對(duì)原始反應(yīng)體系的分

割，該方法具有穩(wěn)定性好，均一性好的優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)成本相對(duì)較高。微滴式通過(guò)產(chǎn)生微小油包水體系實(shí)

現(xiàn)體系的分割，該方法有反應(yīng)速度快，檢測(cè)成本低的優(yōu)點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)新型冠狀病毒核酸數(shù)字PCR的定

量檢測(cè)，本標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)數(shù)字PCR的擴(kuò)增反應(yīng)直接得出新冠病毒ORF1a/b基因和N基因的拷貝數(shù)。

6基本要求

6.1實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)及級(jí)別

1

DB32/T3762.16—2021

檢測(cè)工作應(yīng)在BSL-2級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。生物安全要求遵照GB19489和DB32/T3762.3規(guī)定執(zhí)行。

6.2操作人員資質(zhì)及防護(hù)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的個(gè)人防護(hù)遵照GB19489第8條和DB32/T3762.3規(guī)定執(zhí)行。

7試劑與材料

7.1新冠病毒核酸提取試劑盒：應(yīng)當(dāng)選擇國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門(mén)批準(zhǔn)的試劑，建議選擇磁珠法、膜吸

附法等進(jìn)行核酸提取。

7.2新冠病毒數(shù)字PCR預(yù)混液：含有鎂離子，dNTPs、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶等組

分的數(shù)字PCR預(yù)混液，推薦根據(jù)不同的數(shù)字PCR方法和儀器選擇不同的試劑。

7.3引物序列和探針：檢測(cè)新冠病毒ORF1a/b基因和N基因的引物和探針序列見(jiàn)表1。

表1新冠病毒ORF1a/b基因和N基因的引物和探針序列

標(biāo)靶名稱序列

新型冠狀病毒上游引物CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

ORF1ab基因下游引物ACGATTGTGCATCAGCTGA

探針5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

新型冠狀病毒N基上游引物GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

因下游引物CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

探針5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

8儀器與設(shè)備

8.1生物安全柜。

8.2生物安全型離心機(jī)。

8.3渦旋振蕩器。

8.4恒溫金屬浴。

8.5核酸提取儀。

8.6數(shù)字PCR儀。

9操作步驟

9.1樣本前處理

2

DB32/T3762.16—2021

按照DB32/T3762.3中的7.1規(guī)定執(zhí)行。

9.2核酸提取

按照DB32/T3762.3中的7.2規(guī)定執(zhí)行。

9.3數(shù)字PCR擴(kuò)增方法

9.3.1數(shù)字PCR反應(yīng)體系

數(shù)字PCR儀反應(yīng)體系的總體積根據(jù)不同廠家、不同型號(hào)的儀器設(shè)備需進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，并保持各引

物探針組分終濃度不變。

9.3.2數(shù)字PCR反應(yīng)程序

數(shù)字PCR反應(yīng)程序如表2，不同方法和不同儀器設(shè)備及試劑反應(yīng)程序可能存在差異，需進(jìn)行調(diào)整。

表2數(shù)字PCR反應(yīng)程序

步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)

150℃60min1cycle

295℃10min1cycle

95℃30s

340cycles

55℃1min

498℃10min1cycle

54℃5min1cycle

9.3.3對(duì)照數(shù)字PCR反應(yīng)的設(shè)定

試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。用含2019-nCoVORF1ab基因特異片段的病毒樣顆粒、含

2019-nCoVN基因特異片段的病毒樣顆粒和含人RNaseP基因特異片段的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。用無(wú)核

酶水作為陰性對(duì)照。

9.4質(zhì)量控制與結(jié)果分析

9.4.1質(zhì)量控制

以下要求其中一條不符合，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)，重新進(jìn)行試驗(yàn)應(yīng)從核酸提取開(kāi)始：

a)樣本人RNaseP基因有熒光信號(hào)檢出；

b)陰性對(duì)照無(wú)熒光信號(hào)；

c)陽(yáng)性對(duì)照兩個(gè)靶標(biāo)（ORF1ab、N）熒光信號(hào)均超過(guò)設(shè)定閾值。

9.4.2陽(yáng)性判定

實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)陽(yáng)性病例需滿足以下兩個(gè)條件中的一個(gè)：

3

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a)同一份樣本中新型冠狀病毒2個(gè)靶標(biāo)（ORF1ab、N）數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果均＞100copies/mL。

如果出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)＞100copies/mL的檢測(cè)結(jié)果，則需要重新采樣，重新檢測(cè)。如果單靶標(biāo)仍

＞100copies/mL，判定為陽(yáng)性；

b)同一病例的兩種不同類型樣本數(shù)字PCR同時(shí)出