《DB32T 3762.13-2021新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范 第13部分疊氮溴化丙錠-熒光PCR檢測程序》

ICS11.020

C62

DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3762.13—2021

新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范

第13部分：疊氮溴化丙錠-熒光PCR

檢測程序

TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detection

Part13:PMA-qRT-PCRtestprocedure

2021-12-09發(fā)布2022-01-09實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3762.13—2021

I

DB32/T3762.13—2021

新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范第13部分：疊氮溴化丙錠-熒光PCR檢測程序

1范圍

本文件規(guī)定了新型冠狀病毒疊氮溴化丙錠-熒光PCR（PMA-qRT-PCR）檢測環(huán)境與設(shè)施、設(shè)備與耗

材、試劑與材料、樣本處理與核酸提取、擴(kuò)增體系配制與擴(kuò)增和結(jié)果判斷。

本文件適用于新型冠狀病毒PMA-qRT-PCR檢測，為判斷樣本中的新型冠狀病毒是否具有感染性提

供輔助手段。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）適用于本

文件。

DB32/T3762.3新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范第3部分：核酸熒光PCR檢測程序

新型冠狀病毒實驗室生物安全指南中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會

新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會

醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法原中華人民共和國衛(wèi)生部辦公廳

醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室工作導(dǎo)則原中華人民共和國衛(wèi)生部檢驗中心

3術(shù)語和定義

3.1

疊氮溴化丙錠propidiummonoazide；PMA

一種具有高親和力的光敏反應(yīng)DNA結(jié)合染料，光解后，染料上的光敏疊氮基轉(zhuǎn)變?yōu)楦叻磻?yīng)性的氮

烯自由基，極容易與結(jié)合部位核酸的碳?xì)浠衔镄纬衫喂蘎NA或DNA修飾，修飾后的核酸不能用作PCR

反應(yīng)模板被擴(kuò)增。由于PMA不能透過活細(xì)胞膜，因此將PMA與PCR聯(lián)合使用可用于區(qū)分死活細(xì)胞、細(xì)

菌和病毒等。

4環(huán)境與設(shè)施

同DB32/T3762.3第4章。

5設(shè)備與耗材

BLU-V曝光系統(tǒng)或鹵素?zé)簦?50W），余同DB32/T3762.3第5章。

6試劑與材料

6.1試劑

1

DB32/T3762.13—2021

6.1.1病毒核酸提取試劑盒。

6.1.2qRT-PCR擴(kuò)增試劑盒。

6.1.3二甲基亞砜（DMSO）。

6.1.4磷酸鹽緩沖液（PBS，PH=7.4）。

6.1.5疊氮溴化丙錠（PMA）。

6.2材料

6.2.1新型冠狀病毒核酸檢測質(zhì)控品。

6.2.2消毒劑：75%乙醇、有效氯5500mg/L的消毒液（需每天新鮮配制）。

7試驗技術(shù)要點

用于新型冠狀病毒核酸PMA-qRT-PCR檢測的樣本應(yīng)采用非滅活型病毒采樣管進(jìn)行采集。

8樣本前處理

8.1在BSL-2實驗室生物安全柜內(nèi)打開樣本第二層包裝，取出待檢樣本，核對送檢單，若管壁外有不

明液體，應(yīng)用消毒劑擦拭。

8.2將樣本混勻后分裝于2mL帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈凍存管。在凍存管上標(biāo)記，注明姓名、樣本類型、

日期等。吸取部分樣本進(jìn)行樣本PMA預(yù)處理與核酸提取。所有凍存管旋緊管蓋后需用封口膜密封。

9樣本PMA預(yù)處理與核酸提取

9.1樣本PMA預(yù)處理

9.1.1以20%二甲基亞砜（DMSO）將PMA配置成2mM濃度。

9.1.2將PMA加入到病毒樣品中使其達(dá)到200μM終濃度，同時取等量PBS加入到病毒樣本中作為

樣品對照組，并做好標(biāo)記。以同樣的方法對新型冠狀病毒核酸檢測質(zhì)控品（稀釋到500拷貝/mL）進(jìn)行

處理。

9.1.3將所有樣品管混合均勻，室溫孵育10min。

9.1.4孵育完成后使用BLU-V曝光系統(tǒng)或鹵素?zé)簦?50W，樣品置于冰上，距離燈源20cm）曝光15

min。

注：以上步驟均在避光條件下進(jìn)行。

9.2核酸提取

同DB32/T3762.3的7.2條。

10擴(kuò)增體系配制與擴(kuò)增

10.1將qRT-PCR擴(kuò)增引物和探針（Forward：5′-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3′；Reverse：

5′-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3′；Probe：5′-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG

-BHQ1-3′）配置為10μM濃度。

2

DB32/T3762.13—2021

10.2采用qRT-PCR擴(kuò)增試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書配置qRT-PCR擴(kuò)增體系，反應(yīng)體系中每一條引物

的終濃度為0.2μM，每個樣品及新型冠狀病毒核酸檢測質(zhì)控品均做3個重復(fù)，同時設(shè)立陰性對照。

10.3在生物安全柜內(nèi)加核酸模板，然后根據(jù)試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)條件進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增

40個循環(huán)。

10.4在實驗記錄本記錄加樣位置和樣本編號。

10.5未用完核酸樣本轉(zhuǎn)入病毒樣本專用專人保管冰箱。

11閾值設(shè)定

閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)。

12質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性對照結(jié)果為陰性。新型冠狀病毒核酸檢測質(zhì)控品PBS處理組出現(xiàn)典型S型擴(kuò)增曲線，Ct值小

于40，且質(zhì)控品PBS處理組Ct值和PMA預(yù)處理組Ct值之間存在統(tǒng)計學(xué)差異（陰性結(jié)果Ct值記為40）；若

以上對照不成立，此次實驗視為無效。

13結(jié)果判斷

記錄各組樣品Ct值，陰性結(jié)果Ct值記為40。如果樣品PMA預(yù)處理組Ct值和PBS處理對照組Ct值之間

無統(tǒng)計學(xué)差異，則提示樣品中的病毒具有感染性的可能性較大；如果PMA預(yù)處理組Ct值和PBS處理對照

組Ct值之間存在統(tǒng)計學(xué)