酶工程酶的發(fā)酵生產(chǎn)

關(guān)于酶工程酶的發(fā)酵生產(chǎn)第一節(jié)酶生物合成的基本理論第2頁,共68頁，2024年2月25日，星期天一、中心法則1958年Crick：DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯ATCGAUCG43=64遺傳密碼氨基酸折疊密碼第3頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

二、RNA的生物合成——轉(zhuǎn)錄RNA的種類dsRNA:某些病毒遺傳信息載體催化活性RNA：催化作用tRNA：氨基酸載體rRNA：與蛋白質(zhì)共同組成核糖體mRNA：蛋白質(zhì)合成模板sRNA：分子修飾、代謝調(diào)節(jié)作用（一）RNA的種類和主a要功能第4頁,共68頁，2024年2月25日，星期天以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在依賴DNA的RNA聚合酶作用下，生成RNA的過程。（二）轉(zhuǎn)錄RNA+4nPPinATPnGTPnCTPnUTPDNA模板，Mg2+/Mn2+RNA聚合酶第5頁,共68頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌RNA聚合酶：MW=5x105（三）RNA聚合酶全酶：由ββ’αωσ組成，識別轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，與DNA上的啟動基因結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄開始。核心酶：由ββ’αω組成，進(jìn)行核苷酸鏈的延伸。第6頁,共68頁，2024年2月25日，星期天真核生物RNA聚合酶：三種聚合酶種類RNA聚合酶IRNA聚合酶IIRNA聚合酶III別名rRNARNA聚合酶不均一RNA聚合酶小分子RNA聚合酶存在位置核仁核仁核之相對分子質(zhì)量/103550600600催化反應(yīng)產(chǎn)物rRNAmRNAtRNA5SrRNA第7頁,共68頁，2024年2月25日，星期天RNA生物合成的起始位點(diǎn)在DNA的啟動基因（啟動子)上（四）轉(zhuǎn)錄的起始起始階段的重要問題是RNA聚合酶與DNA的啟動基因的相互作用，起始階段包括：全酶的形成酶與模板結(jié)合酶與啟動基因結(jié)合模板DNA局部變性轉(zhuǎn)錄開始第8頁,共68頁，2024年2月25日，星期天RNA轉(zhuǎn)錄泡，17bpDNA5’3’5’3’活性中心RNA-DNA雜交體，8bp重旋解旋酶的移動方向

（五）轉(zhuǎn)錄的延伸第9頁,共68頁，2024年2月25日，星期天模板DNA分子上每個基因或每個操縱子都含有一個終止信號——終止子。當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄到達(dá)這個信號時，合成的RNA分子以及聚合酶與模板DNA分離，RNA鏈的合成便被終止。（六）轉(zhuǎn)錄的終止5’ρATP→ADP+PiRNA聚合酶終止子第10頁,共68頁，2024年2月25日，星期天1.剪切反應(yīng)2.剪接反應(yīng)3.末端連接反應(yīng)：（七）RNA前體的加工tRNA3’-末端加上CCA-OH尾巴在mRNA的5’-末端加上“帽子”結(jié)構(gòu)5’-m7GpppNmpNp在mRNA的3’-末端連接polyA尾巴tRNA5’-末端加上甲基鳥苷酸核苷修飾反應(yīng)第11頁,共68頁，2024年2月25日，星期天二、蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯以mRNA為模板，以各種氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程，稱為翻譯。DNAaRNA

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯ATCGAUCG43=64遺傳密碼氨基酸第12頁,共68頁，2024年2月25日，星期天遺傳密碼的簡并性：密碼子

5’-XYZ-3’反密碼子

3’-X’Y’Z’-5’61種密碼——20種氨基酸遺傳密碼的通用性密碼子與反密碼子的相互作用：mRNAtRNACrick根據(jù)立體化學(xué)原理，于1966年提出了擺動假說：密碼子與反密碼子的配對中，前兩對嚴(yán)格按照堿基配對原則，而第三對堿基則可以有一定自由度地?cái)[動，所以，某些tRNA的反密碼子可以識別一個以上的密碼子。第13頁,共68頁，2024年2月25日，星期天1.氨基酸活化生成氨酰-tRNAaa＋tRNA+ATPaa-tRNA+AMP+PPi

氨酰-tRAN合成酶

大腸桿菌，肽鏈合成的第一個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸：Met＋tRNAF+ATP→Met-tRNAF+AMP+PPi甲酰轉(zhuǎn)移酶fMet-tRNA第14頁,共68頁，2024年2月25日，星期天2.肽鏈的合成起始30s亞基IF-3mRNAmRNAGTP-IF-2-fMet-tRNAfMRA50s亞基IF-1+IF-2+IF-3GDP+PifMet第15頁,共68頁，2024年2月25日，星期天3.肽鏈的延伸mRNAfMetaa2fMetfMetaa1aa1EF-TGTP*aa1EF-TGDP+Piaa1aa1aa1fMettRNA2+EF-G+GDP+Pi+EF-G+GTP+EF-T+GDP+Piaa2+EF-T+GTP+EF-G+GTPtRNA1EF-GGDP+Piaa2fMetfMetaa2aa1fMet第16頁,共68頁，2024年2月25日，星期天4.肽鏈的終止終止密碼子：UAA,UAG,UGA釋放因子（ReleaseFactor）:RF-1：UAA,UAGRF-2：UAA,UGA5.翻譯后加工去除甲?；コ齆-末端的氨基酸肽鏈折疊第17頁,共68頁，2024年2月25日，星期天三、酶生物合成的調(diào)節(jié)第18頁,共68頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)翻譯水平的調(diào)節(jié)翻譯產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)酶降解調(diào)節(jié)組成酶：DNA酶，RNA酶，糖酵解途徑的酶調(diào)節(jié)酶：適應(yīng)酶，β-半乳糖苷酶（誘導(dǎo)酶）酶的類型酶合成的調(diào)節(jié)控制第19頁,共68頁，2024年2月25日，星期天1960年Jacob和Monod提出的操縱子學(xué)說調(diào)節(jié)基因：產(chǎn)生阻遏蛋白啟動基因操縱基因：與阻遏蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)基因：蛋白多肽鏈產(chǎn)物操縱子1.RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)2.cAMP及其受體蛋白復(fù)合物（cAMP-CRP）結(jié)合位點(diǎn)（一）操縱子學(xué)說第20頁,共68頁，2024年2月25日，星期天…RPOS1S2……DNA調(diào)節(jié)基因啟動基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因與阻遏蛋白結(jié)合1.RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)2.cAMP及其受體蛋白復(fù)合物（cAMP-CRP）結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生阻遏蛋白mRNA操縱子第21頁,共68頁，2024年2月25日，星期天原核生物中操縱子的類型1.誘導(dǎo)型操縱子：乳糖操縱子2.阻遏型操縱子：色氨酸操縱子第22頁,共68頁，2024年2月25日，星期天（二）原核生物中酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制1.分解代謝物阻遏作用2.酶生物合成的誘導(dǎo)作用3.酶生物合成的反饋?zhàn)瓒糇饔玫?3頁,共68頁，2024年2月25日，星期天1.分解代謝物阻遏作用是指容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是誘導(dǎo)酶）生物合成的現(xiàn)象。cAMP↓+H2OAMP↓磷酸二酯酶葡萄糖過量降解ATPADP,AMPcAMP-CRP↓啟動基因上沒有cAMP-CRP結(jié)合酶合成↓例：葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生物合成第24頁,共68頁，2024年2月25日，星期天2.酶生物合成的誘導(dǎo)作用加進(jìn)某種物質(zhì)，使酶的生物合成開始或加速進(jìn)行的過程。簡稱為誘導(dǎo)作用，起誘導(dǎo)作用的物質(zhì)，稱為誘導(dǎo)劑。舉例：乳糖誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶的合成…RPOS1S2…DNA無誘導(dǎo)物時：添加誘導(dǎo)物時：…RPOS1S2…DNA誘導(dǎo)物轉(zhuǎn)錄翻譯mRNA酶乳糖別乳糖第25頁,共68頁，2024年2月25日，星期天3.酶生物合成的反饋?zhàn)瓒糇饔茫óa(chǎn)物阻遏作用）是指酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受阻的過程。引起反饋?zhàn)瓒舻奈镔|(zhì)，稱為共阻遏物。舉例：無機(jī)磷酸阻遏堿性磷酸酶無阻遏物時：添加阻遏物時：…RPOS1S2…DNA翻譯mRNA…RPOS1S2…DNA共阻遏物磷酸單酯磷酸+醇堿性磷酸酶第26頁,共68頁，2024年2月25日，星期天（三）真核生物中酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制1.細(xì)胞分化改變酶的生物合成2.基因擴(kuò)增加速酶的生物合成3.增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成4.抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成第27頁,共68頁，2024年2月25日，星期天1.細(xì)胞分化改變酶的生物合成3’5’5’TTGGGGTTGGGG3’CCAACCCC3’5’端粒酶RNADNA3’5’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGG3’CCAACCCC3’5’端粒酶RNADNA3’5’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGG3’CCAACCCC3’5’端粒酶RNADNA端粒酶催化端粒的延伸（1）結(jié)合（2）延伸（3）移位第28頁,共68頁，2024年2月25日，星期天2.基因擴(kuò)增加速酶的生物合成基因擴(kuò)增：是通過增加基因的數(shù)量來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種方式。例：CHO在含有氨甲蝶呤的培養(yǎng)基上培養(yǎng)編碼二氫葉酸還原酶的基因大量擴(kuò)增，二氫葉酸還原酶合成速度加快。第29頁,共68頁，2024年2月25日，星期天增強(qiáng)子：又稱調(diào)變子，是一段能夠高效增強(qiáng)或促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。增強(qiáng)子的重要特性是能夠促進(jìn)同源或異源啟動基因的轉(zhuǎn)錄活性，其增強(qiáng)效果有時可達(dá)1000倍。3.增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成第30頁,共68頁，2024年2月25日，星期天4.抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成

1948年P(guān)auling提出過渡態(tài)理論

1975年Kohler合Milstein發(fā)明單克隆抗體技術(shù)

1986年Lerner合Schultz分別獨(dú)立獲得具有催化活性的抗體第31頁,共68頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)酶的生物合成法生產(chǎn)第32頁,共68頁，2024年2月25日，星期天一、基本概念酶的生物合成：所有的生物體在一定條件下都能夠產(chǎn)生多種多樣的酶。酶在生物體內(nèi)的產(chǎn)生過程，稱為酶的生物合成。酶的生物合成法生產(chǎn)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計(jì)，通過人工操作控制，利用細(xì)胞（包括微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞）的生命活動，產(chǎn)生人們所需要的酶的過程。第33頁,共68頁，2024年2月25日，星期天二、酶的生物合成法生產(chǎn)種類微生物發(fā)酵產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶第34頁,共68頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞應(yīng)具備的條件1.繁殖快,產(chǎn)酶量高，有利于縮短生產(chǎn)周期。2.能在便宜的底物上良好生長。3.產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，菌株不易退化，不易受噬菌體侵襲。4.產(chǎn)生的酶容易分離純化。5.不是致病菌及產(chǎn)生有毒物質(zhì)或其他生理活性物質(zhì)的微生物，才能確保酶生產(chǎn)和應(yīng)用的安全。第35頁,共68頁，2024年2月25日，星期天1.大腸桿菌特征：細(xì)胞成桿狀，0.5μm*（1~3）μm，無芽孢，G-，菌落從白色到黃色，光滑閃光，擴(kuò)展。產(chǎn)酶種類：一般生產(chǎn)胞內(nèi)酶谷氨酸脫羧酶，天冬氨酸酶，芐青霉素酰化酶，基因工程研究用酶等三、酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物第36頁,共68頁，2024年2月25日，星期天2.枯草芽孢桿菌特征：細(xì)胞成桿狀，（0.7~0.8）μm*（2~3）μm，單個，無莢膜，周生鞭毛，運(yùn)動，G+，菌落粗糙，不透明。污白色或微帶黃色。產(chǎn)酶種類：

α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、堿性磷酸酶等第37頁,共68頁，2024年2月25日，星期天3.鏈霉菌特征：最高等的放線菌。有發(fā)育良好的分枝菌絲，菌絲無橫隔，分化為營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、65孢子絲。孢子絲再形成分生孢子。孢子絲和孢子的形態(tài)、顏色因種而異，是分種的主要識別性狀之一。產(chǎn)酶種類：α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、堿性磷酸酶等第38頁,共68頁，2024年2月25日，星期天4.黑曲霉特征：屬于半知菌亞門,菌絲有隔,細(xì)胞多核；部分氣生菌絲細(xì)胞形成特化的厚壁、膨大的足細(xì)胞，由足細(xì)胞的中間稍呈垂直地向上延長，形成分生孢子梗。產(chǎn)酶種類：糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶等第39頁,共68頁，2024年2月25日，星期天特征：屬于半知菌亞門,分生孢子?；繜o足細(xì)胞，孢子梗頂端不膨大成囊，而是多次分枝形成掃帚狀，小梗末端形成分生孢子。產(chǎn)酶種類：葡萄糖氧化酶、果膠酶、纖維素酶等5.青霉第40頁,共68頁，2024年2月25日，星期天四、產(chǎn)酶菌種的篩選方法胞內(nèi)酶：含菌樣品的采集→菌種分離→產(chǎn)酶性能測定→復(fù)篩①固體培養(yǎng)法：把菌種接人固體培養(yǎng)基中,保溫?cái)?shù)天,用水或緩沖液浸泡培養(yǎng)基,將酶抽提,測定酶活力,這種方法主要適用于霉菌.②液體培養(yǎng)法：將菌種接人液體培養(yǎng)基后,靜置或在搖床上振蕩培養(yǎng)一段時間(視菌種而異),再測定培養(yǎng)物中酶的活力,通過比較,篩選胞外酶：第41頁,共68頁，2024年2月25日，星期天五、酶的發(fā)酵生產(chǎn)方式1.固體培養(yǎng)發(fā)酵2.液體深層發(fā)酵3.固定化細(xì)胞4.固定化原生質(zhì)體發(fā)酵第42頁,共68頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)發(fā)酵工藝的條件及控制第43頁,共68頁，2024年2月25日，星期天保藏細(xì)胞細(xì)胞活化細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵分離純化酶原生質(zhì)體培養(yǎng)基固定化原生質(zhì)體固定化細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)無菌空氣酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程第44頁,共68頁，2024年2月25日，星期天一、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞活化：保藏細(xì)胞在使用之前必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以恢復(fù)細(xì)胞的生命活力，這就叫細(xì)胞的活化。種子培養(yǎng)基：用于細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基。氮源豐富碳源少溫度、pH、溶解氧接種量：1~10%第45頁,共68頁，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基：是指人工配制的用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。碳源氮源無機(jī)鹽生長因素第46頁,共68頁，2024年2月25日，星期天三、pH調(diào)節(jié)1.細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH與生長最適pH值往往不同，通常接近于該酶反應(yīng)的最適pH。2.有些細(xì)胞可以同時產(chǎn)生多種酶，通過控制培養(yǎng)基的pH，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。3.培養(yǎng)基的pH在細(xì)胞生長繁殖和代謝物產(chǎn)生的過程中往往會發(fā)生變化。第47頁,共68頁，2024年2月25日，星期天四、溫度的調(diào)節(jié)控制1.細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與最適生長溫度有所不同，而且往往低于最適生長溫度。2.有些酶的發(fā)酵生產(chǎn)，要在不同階段控制不同的溫度條件。第48頁,共68頁，2024年2月25日，星期天五、溶解氧的調(diào)節(jié)控制調(diào)節(jié)溶解氧的方法：（1）調(diào)節(jié)通氣量（2）調(diào)節(jié)氧的分壓（3）調(diào)節(jié)氣液接觸時間（4）調(diào)節(jié)氣液接觸面積（5）改變培養(yǎng)基的性質(zhì)第49頁,共68頁，2024年2月25日，星期天六、微生物產(chǎn)酶的方式及特點(diǎn)1.固體培養(yǎng)發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單、操作方便、麩曲中酶濃度較高、適合霉菌培養(yǎng)發(fā)酵缺點(diǎn)：勞動強(qiáng)度大、原料利用率低、生產(chǎn)周期長2.液體深層發(fā)酵3.固定化細(xì)胞4.固定化原生質(zhì)體第50頁,共68頁，2024年2月25日，星期天七、提高酶產(chǎn)量的措施1.添加誘導(dǎo)物酶的作用底物:酶的反應(yīng)產(chǎn)物:酶的底物類似物:

葡萄糖：1個β-半乳糖苷酶乳糖：3000個半乳糖醛酸誘導(dǎo)果膠酶纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶異丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）對β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)效果比乳糖高幾百倍第51頁,共68頁，2024年2月25日，星期天2.控制阻遏物的濃度：無機(jī)磷是堿性磷酸酶的阻遏物3.添加表面活性劑：增加細(xì)胞的通透性4.添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑：聚乙烯醇提高糖化酶的產(chǎn)量機(jī)理尚不清楚第52頁,共68頁，2024年2月25日，星期天八、酶發(fā)酵動力學(xué)發(fā)酵動力學(xué)是研究發(fā)酵過程中細(xì)胞生長速度、產(chǎn)物生成速度、基質(zhì)消耗速度以及環(huán)境因素對這些速度的影響的學(xué)科第53頁,共68頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞濃度/（mg/mL）酶濃度/(單位/ml)細(xì)胞濃度/（mg/mL）OABCDO-A調(diào)整期A-B生長期B-C平衡期C-D衰退期時間/hI-同步合成型II-延續(xù)合成型III-中期合成型IV-滯后合成型時間/hIIIIIIIV（一）酶生物合成模式第54頁,共68頁，2024年2月25日，星期天（二）各種酶生物合成模式的特點(diǎn)1.同步合成型例：單寧誘導(dǎo)米曲霉合成單寧酶1.生物合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝阻遏物和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。2.酶所對應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。細(xì)胞濃度/（mg/mL）時間/h酶濃度/（單位/mL）0204060細(xì)胞濃度總酶濃度胞外酶濃度胞內(nèi)酶濃度特點(diǎn)：第55頁,共68頁，2024年2月25日，星期天2.延續(xù)合成型例：果膠誘導(dǎo)黑曲霉合成聚半乳糖酸酶1.生物合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝阻遏物和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。2.酶所對應(yīng)的mRNA很穩(wěn)定。細(xì)胞濃度總酶濃度細(xì)胞濃度/（mg/mL）時間/h酶濃度/（單位/mL）0204060特點(diǎn)：第56頁,共68頁，2024年2月25日，星期天3.中期合成型例：枯草桿菌合成堿性磷酸酶1.生物合成受反饋抑制。2.酶所對應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定。細(xì)胞濃度酶濃度細(xì)胞濃度/（mg/mL）時間/h酶濃度/（單位/mL）0204060特點(diǎn)：第57頁,共68頁，2024年2月25日，星期天4.滯后合成型1.酶在對數(shù)期不合成。2.酶所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定。例：黑曲霉合成酸性蛋白酶細(xì)胞濃度酶濃度細(xì)胞濃度/（mg/mL）時間/h酶濃度/（單位/mL）0204060特點(diǎn)：第58頁,共68頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)動、植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶第59頁,共68頁，2024