霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

霍亂的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

目的:提高檢出率,減少漏檢以及誤判的發(fā)生

手段:檢測(cè)人員是否有足夠的責(zé)任心?檢測(cè)試劑準(zhǔn)備是否齊全且符合要求?是否嚴(yán)格按照檢測(cè)流程進(jìn)行操作?

什么是霍亂?霍亂是由01群和0139群霍亂弧菌（V．c

ho

le

ra

e

）引起的急性腸道傳染病，發(fā)病急、傳播速度快、波及范圍廣、危害嚴(yán)重的甲類傳染病?；魜y概述古典生物型小川型Og

a

w

a

(AB)稻葉型Ina

b

a

(AC)彥島型Hikojim

(AB

C)O1群埃爾托生物型霍亂弧菌霍亂病原菌O139群（B

e

ng

a

l）非O1群O2-O200群腹瀉病原菌

病原體O

1群，O

139群霍亂弧菌

發(fā)病特征：劇烈腹瀉、嘔吐、嚴(yán)重脫水時(shí)致酸中毒、循環(huán)衰竭而致死亡不治療或醫(yī)療很差的條件下病死率可達(dá)到20－50

％（重癥病人達(dá)70－100

％）

培養(yǎng)特性：營(yíng)養(yǎng)要求不高，兼性厭氧，37

℃生長(zhǎng)，怕酸嗜堿，

p

H:7.4-9.6快速生長(zhǎng)

檢驗(yàn)依據(jù)：WS

289-2008《霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)》霍亂防治手冊(cè)（1999年第五版）霍亂的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

樣品的采集和運(yùn)輸

不同樣品的病原分離流程及技術(shù)要點(diǎn)

糞便

水體

水產(chǎn)品，食品等

平板分離及可疑菌落挑取

菌落鑒定

常用快速檢測(cè)方法

膠體金檢測(cè)條

熒光PCR檢測(cè)

檢測(cè)工作中應(yīng)關(guān)注的事項(xiàng)樣品的采集和運(yùn)輸

采集：

病例：糞便、肛拭子、嘔吐物

未使用抗生素之前“健康”人：糞便、肛拭子其他傳播環(huán)節(jié)的標(biāo)本：食物、水、環(huán)境類樣品??

監(jiān)測(cè)：水樣，水產(chǎn)品等運(yùn)輸：一般要求在3小時(shí)內(nèi)室溫（20-25℃）條件下送達(dá)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

C-B運(yùn)輸培養(yǎng)基（p

H8.4

）;（或文臘二氏保存液）

堿性蛋白胨水（p

H8.4-9.2

）：不是最佳的，尤其6小時(shí)內(nèi)還不能進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，盡量采用C-B運(yùn)輸培養(yǎng)基。

糞便的采集與保存運(yùn)送以采集病人自然排除的新鮮糞便為主，水樣便采取1

～3

m

L，成形便采取指甲大小的糞量，亦可用直腸棉拭或采便管由肛門插入直腸內(nèi)3

～5

c

m處采取，采集后的樣品應(yīng)盡快挑取接種于堿性蛋白胨水（ＰＨ8.６-9.2

），同時(shí)劃線分離選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號(hào)／ＴＣＢＳ平板），如不能在６小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的樣品，應(yīng)插入Ca

ry-Bla

ir二氏半固體保存培養(yǎng)基（或文臘二氏保存液）中送檢。標(biāo)本與保存液比例約為1∶5。

分離培養(yǎng)要點(diǎn)（兩管三板法）：

挑取糞便，直接接種于堿性蛋白胨水（第一管）中，同時(shí)劃線分離選擇性平板（慶大／四號(hào)／ＴＣＢＳ平板，第一板）。

第一管堿性蛋白胨水在３７℃增菌６－８小時(shí)，沾取菌膜下表層液體，劃線分離選擇性平板（慶大／四號(hào)／ＴＣＢＳ平板，第二板），同時(shí)吸取

0.1

～0.2

m

l表層培養(yǎng)物，接種堿性蛋白胨水（第二管）。

第二管堿性蛋白胨水增菌１８小時(shí)后劃線分離選擇性平板（慶大／四號(hào)／ＴＣＢＳ平板，第三板）。糞便分離流程及技術(shù)要點(diǎn)

水體的采集與保存運(yùn)送水體的采集一般用無菌的500

m

l水樣瓶采集相對(duì)靜止的表層水(深度為30

c

m以內(nèi))500

m

l，密封加蓋后于室溫（20-25℃）3小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

分離培養(yǎng)要點(diǎn)（十倍濃縮堿胨水增菌培養(yǎng)法）：取450

m

l水樣，用1

M氫氧化鈉調(diào)整至p

H

8.4-9.2。然后加10倍濃縮堿性胨水50

m

l。再加入1%亞碲酸鉀0.25

～0.5

m

l和1000單位/m

l青霉素1m

l。37℃培養(yǎng)過夜，取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號(hào)／ＴＣＢＳ平板）分離培養(yǎng)，同時(shí)吸0.1

～0.2m

l表層培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于堿性胨水管中作二次增菌，37℃培養(yǎng)6

～8

h再劃線接種于選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號(hào)／ＴＣＢＳ平板）。水體分離流程及技術(shù)要點(diǎn)

水產(chǎn)品的采集與保存運(yùn)送

通常選取活的或者新鮮的水生動(dòng)物為采集對(duì)象，有時(shí)也應(yīng)考慮冰凍的水生動(dòng)物，有條件的采樣點(diǎn)可將水生動(dòng)物整體采回實(shí)驗(yàn)室再進(jìn)行相關(guān)處置

涂抹采集：使用無菌棉簽涂抹5只以上水水生動(dòng)物表面、腮部及泄殖腔，直接接種到

20

m

l堿性蛋白胨水作為增菌液處理。

整體或局部采集：在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)以無菌操作將其解剖，取鰓部和腸內(nèi)容物25克剪碎后，置滅菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋中，加入225

m

L倍體積的堿性蛋白胨水增菌；但小貝殼類動(dòng)物，則用錘子將外殼擊碎，整體放入100

m

l三角瓶中，加入5-10倍的堿性蛋白胨水增菌；甲殼類動(dòng)物除含肉質(zhì)部分外，其余部分(包括鰓、腸、足、表層外殼等)整體放入100

m

l三角瓶中，加入5-10倍的堿性蛋白胨水增菌。

分離培養(yǎng)（兩管兩板法）：接種后的堿性蛋白胨水37℃培養(yǎng)過夜，取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號(hào)／ＴＣＢＳ平板）．同時(shí)吸0.1

～0.2

m

l表層培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于10

m

l堿性胨水管中作二次增菌，37℃培養(yǎng)6

～8

h再劃線接種于選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號(hào)／ＴＣＢＳ平板）。水產(chǎn)品分離流程及技術(shù)要點(diǎn)

平板分離

選擇性分離平板應(yīng)采用9

c

m

分離平板（不建議采用7

c

m

平板），一個(gè)平

板分離一個(gè)樣品（嚴(yán)禁一個(gè)平板分離2

份或以上樣品??！

）。

樣品平板分離時(shí)應(yīng)進(jìn)行分區(qū)劃線分離，平板分離的單個(gè)菌落數(shù)量應(yīng)該達(dá)到

50

個(gè)以上。

可疑菌落挑取

經(jīng)典的鑒定步驟要求每個(gè)平板應(yīng)挑取5

個(gè)以上可疑菌落,轉(zhuǎn)種于克氏雙糖斜

面或者普通瓊脂斜面待分純培養(yǎng)后,再進(jìn)行O

1

、O

139

群血清玻片凝集試驗(yàn)，鑒于對(duì)霍亂疫情應(yīng)急處理的考慮,現(xiàn)大多數(shù)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室一般采用將血清玻片凝集試驗(yàn)前置的做法,作為快速篩查的手段,直接對(duì)平板上生長(zhǎng)的單個(gè)可

疑菌落進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn),出現(xiàn)明顯凝集時(shí)可做初步報(bào)告,對(duì)平板上出現(xiàn)可疑凝集的菌株必須馬上轉(zhuǎn)種于克氏雙糖斜面或者普通瓊脂斜面,待純培養(yǎng)物生長(zhǎng)良好后再次進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)加以確證。

慶大霉素平板和4

號(hào)瓊脂：多呈半透明狀，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并

隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而加深（由于這類培養(yǎng)基均含有亞碲酸鹽成份）。

TCBS（硫代硫酸鹽枸櫞酸鹽膽鹽瓊脂）：菌落生長(zhǎng)呈黃色發(fā)亮、表面光滑、潤(rùn)濕、稍凸起、邊緣整齊。

（TC

BS平板生長(zhǎng)的菌落不能直挑取進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，需按經(jīng)典方法進(jìn)行純培養(yǎng)后再進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)）平板分離及可疑菌落挑取

染色鏡檢革蘭染色陰性的短桿菌

血清凝集試驗(yàn)：

分別使用O

1

群，O

139

群霍亂血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，同時(shí)使用生理鹽水進(jìn)行

對(duì)照凝集，以排除與生理鹽水發(fā)生凝集的自凝菌。

生理鹽水不凝集，O

1

群血清明顯凝集的菌落，進(jìn)一步使用稻葉型和小川型血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，判定型別：稻葉型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落

為稻葉型，小川型血清凝集而稻葉型血清不凝集的菌落為小川型，如稻葉型血清和小川型血清均出現(xiàn)凝集的時(shí)候，要注意鑒別是否為彥島型，需進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)且兩者的凝集效價(jià)均超過一半以上才能判定為彥島型，因?yàn)槟承┬〈ㄐ途渥陨頃?huì)帶有少量的C抗原而出現(xiàn)與稻葉型血清發(fā)生弱凝集，因此如小川型血清凝集較稻葉型血清凝集有明顯優(yōu)勢(shì)時(shí)應(yīng)維持小川型的判定。

生理鹽水不凝集，O

139

群血清明顯凝集的菌落，一般為O

139

群，但其與O

22

群及O

155

群甚至一些非霍亂弧菌會(huì)出現(xiàn)交叉凝集，由上級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。菌落鑒定O1群和O139群抗原構(gòu)造與血清分型AO139BC小川+++少量稻葉+—+彥島O139+—++—+—型特異性抗原群特異性抗原型別

國(guó)內(nèi)商品化的霍亂檢測(cè)血清

國(guó)外血清：日本生研，泰國(guó)S

&A血清等進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)1％鹽酸對(duì)氨基二甲基苯胺或鹽酸二甲基對(duì)苯二胺水溶液粘絲試驗(yàn)0.5％去氧膽酸鈉水溶液

生化鑒定

生化鑒定管：發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣能分解色氨酸賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶（+）精氨酸雙水解酶（-）霍亂弧菌生化鑒定管（11

種生化,套裝，環(huán)凱）；

生化鑒定條：梅里埃API

20

E鑒定條等

全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)：梅里埃VITEK2

COMP

全自動(dòng)生化鑒定卡等

進(jìn)一步分型鑒定(省CDC進(jìn)行)

噬菌體分型

PFG

E脈沖場(chǎng)分型進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)

針對(duì)原始樣品（如病人糞便）以及初始增菌后的菌液進(jìn)行快速檢測(cè)

膠體金快速檢測(cè)卡

O

1群霍亂膠體金標(biāo)記快診卡

O

139群霍亂膠體金標(biāo)記快診卡

熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒

O

1群、O

139群雙色熒光檢測(cè)試劑盒

霍亂C

TX毒力基因熒光檢測(cè)試劑盒注：快速檢測(cè)并不能替代常規(guī)檢測(cè)的進(jìn)行，只是作為輔助檢測(cè)的一種手段霍亂快速檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用霍亂弧菌膠體金免疫層析檢測(cè)熒光PCR檢測(cè)霍亂弧菌病例標(biāo)本檢測(cè)環(huán)境和食品調(diào)查的初篩方法O

1群、O

139群雙色熒光檢測(cè)試劑盒深圳生科源生物技術(shù)有限公司O1群和O139群霍亂弧菌的檢驗(yàn)程序鑒定分型確診報(bào)告膠體金、熒光PCR快速診斷增菌培養(yǎng)（堿胨水）分離培養(yǎng)慶大霉素、4號(hào)、TCBS瓊脂標(biāo)本（糞便等）玻片凝集陽性（結(jié)合菌落、菌體形態(tài)）凝集菌落或可疑菌落第二次增菌（堿胨水）初步報(bào)告10-20小時(shí)6-8小時(shí)純培養(yǎng)（營(yíng)養(yǎng)瓊脂或克氏雙糖培養(yǎng)）10-20小時(shí)直接