非洲豬瘟病原學(xué)診斷

非洲豬瘟病原學(xué)診斷非洲豬瘟(African

Swine

Fever

,ASF)是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，又稱非洲豬瘟疫或疣豬病。目前缺乏針對(duì)非洲豬瘟的有效疫苗，且非洲豬瘟的傳播非常迅速。由于非洲豬瘟引起的臨床癥狀跟豬的其他一些傳染病相似，根據(jù)臨床癥狀很難進(jìn)行鑒別診斷，因此實(shí)驗(yàn)室診斷和嚴(yán)格的生物安全措施對(duì)該病的防控至關(guān)重要。目前，國(guó)際上主要通過(guò)病原學(xué)和血清學(xué)方法進(jìn)行非洲豬瘟的診斷。然而，該病在我國(guó)屬于外來(lái)病，非洲豬瘟引起的臨床病程短、發(fā)病急，通常在病毒抗體產(chǎn)生之前，動(dòng)物已經(jīng)發(fā)病死亡。因此，目前我國(guó)非洲豬瘟的檢測(cè)主要應(yīng)用病原學(xué)檢測(cè)方法。本文主要對(duì)目前常用的非洲豬瘟病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述。非洲豬瘟病毒可引發(fā)從最急性、

急性到慢性和表現(xiàn)健康實(shí)際帶毒的一系列廣泛癥狀。根據(jù)毒株之間毒力的不同，非洲豬瘟產(chǎn)生的臨床癥狀也有所不同。其中，急性癥狀是最為常見(jiàn)的（3-5天），5-10天左右致死。慢性癥狀則通常表現(xiàn)為消瘦，腫脹和呼吸道問(wèn)題。非洲豬瘟的臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、出血以及皮膚發(fā)紺，甚至出現(xiàn)血塊。病理剖檢后通?？梢?jiàn)脾臟異常腫大和淤血，淋巴結(jié)、肝臟和腎臟出血，這些臨床癥狀與古典豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬病等很難區(qū)分，因此一般通過(guò)實(shí)驗(yàn)室手段進(jìn)行非洲豬瘟的鑒別診斷?？焖伲`敏并且特異的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于非洲豬瘟的防控是至關(guān)重要的，不僅可以預(yù)防非洲豬瘟病毒的傳播擴(kuò)散，更有助于區(qū)分與非洲豬瘟有相似臨床癥狀的一些疾病。一、病毒分離非洲豬瘟病毒可以通過(guò)血液、血清以及其他組織樣品（脾臟、肝臟、淋巴結(jié)和扁桃體）等進(jìn)行分離。如果樣品中存在非洲豬瘟病毒，感染細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變（CPE）。非洲豬瘟病毒的紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)是其特有的檢測(cè)技術(shù)，其它豬源病毒在白細(xì)胞培養(yǎng)物中不存在紅細(xì)胞吸附特性。細(xì)胞病變通常出現(xiàn)在紅細(xì)胞吸附48-72小時(shí)后，紅細(xì)胞吸附反應(yīng)（HAD）是基于豬源紅細(xì)胞會(huì)吸附在感染非洲豬瘟病毒的單核巨噬細(xì)胞周圍從而產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附的現(xiàn)象。該試驗(yàn)需要非洲豬瘟病毒在豬的原代骨髓細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中培養(yǎng)，試驗(yàn)方法已經(jīng)在世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE,

2012）手冊(cè)詳細(xì)描述。紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)方法的主要缺點(diǎn)是需要制備原代細(xì)胞，而且證明它的陰性結(jié)果至少需要6天。然而，如果紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)在前24h為陽(yáng)性的話，通過(guò)紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)進(jìn)行的病毒分離是優(yōu)先于ELISA，PCR以及熒光抗體試驗(yàn)（FAT）。即使使用其他方法以及驗(yàn)證非洲豬瘟病毒為陽(yáng)性的情況，通常建議使用紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)進(jìn)行確診，尤其是檢測(cè)首次爆發(fā)或首例非洲豬瘟疫情。二、非洲豬瘟病毒抗原檢測(cè)1.熒光抗體試驗(yàn)熒光抗體試驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)疑似病例組織中的非洲豬瘟病毒。試驗(yàn)方法是將疑似病例的組織或器官涂抹在載玻片或冷凍切片切成薄片，使用熒光素標(biāo)記的特異抗體染色后通過(guò)顯微鏡觀察非洲豬瘟病毒的抗原。熒光抗體試驗(yàn)也可以檢測(cè)紅細(xì)胞吸附陰性的白細(xì)胞，同時(shí)也可以鑒定沒(méi)有紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的非洲豬瘟病毒株。雖然熒光抗體試驗(yàn)對(duì)非洲豬瘟急性期的檢測(cè)非常敏感，但對(duì)于亞急性和慢性癥狀，由于抗原抗體復(fù)合物的形成阻礙了非洲豬瘟抗原表位簇與標(biāo)記熒光素抗體的結(jié)合，導(dǎo)致該試驗(yàn)的敏感性會(huì)降低。2.抗原檢測(cè)ELISA技術(shù)ELISA技術(shù)可以用于非洲豬瘟病毒抗原的檢測(cè)，但只適用于急性癥狀的非洲豬瘟感染，但抗原檢測(cè)ELISA不如PCR方法敏感。首次研究的間接ELISA方法檢測(cè)非洲豬瘟病毒抗原的濃度范圍在50-500HAD50/ml，之后以VP72的單克隆抗體建立的夾心ELISA方法提高了試驗(yàn)的敏感性。據(jù)報(bào)道，目前使用的兩種雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，一種是使用多克隆抗體，另一種是結(jié)合使用單克隆和多克隆抗體。兩種方法都可以檢測(cè)到較為廣泛的非洲豬瘟毒株，但相比單克隆抗體，使用多克隆抗體檢測(cè)非洲豬瘟病毒抗原要較為敏感。三、非洲豬瘟病毒分子生物學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)非洲豬瘟病毒的基因組大小在170到190kb之間，一條線性雙鏈DNA分子，編碼至少150個(gè)蛋白。根據(jù)不同毒株的差異，編碼的蛋白數(shù)目也有所不同，據(jù)報(bào)道非洲豬瘟病毒可以分為24個(gè)基因型。分子生物學(xué)檢測(cè)方法，通?；诒Ｊ鼗蛟O(shè)計(jì)引物，能保證擴(kuò)增到所有基因型的非洲豬瘟病毒。目前OIE非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室將實(shí)時(shí)熒光定量PCR當(dāng)作檢測(cè)非洲豬瘟病毒的金標(biāo)準(zhǔn)。相比實(shí)時(shí)熒光PCR而言，等溫?cái)U(kuò)增的分子檢測(cè)方法價(jià)格低廉，在發(fā)展中國(guó)家應(yīng)用具有很大的潛力。1.

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）針對(duì)非洲豬瘟病毒基因的檢測(cè)，已經(jīng)研制出很多種常規(guī)PCR方法。雖然這些方法目前都被實(shí)時(shí)熒光定量PCR所代替，但是在一些沒(méi)有實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)PCR仍然非常有用。2.

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。相比常規(guī)PCR方法，實(shí)時(shí)熒光定量更加快速，靈敏，減少交叉污染以及能夠?qū)ΡO(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行定量。而且，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以使用96孔板，更加高效與自動(dòng)化。目前已經(jīng)有便攜式的實(shí)時(shí)熒光定量設(shè)備，這將給未來(lái)的臨床診斷帶來(lái)根本性的改變。首次報(bào)道的TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR詳細(xì)步驟已收集在OIE手冊(cè)中。該試驗(yàn)方法很敏感且又特異，可以檢測(cè)到10到100個(gè)病毒基因的拷貝數(shù)。這個(gè)方法在25種不同非洲豬瘟病毒株以及非洲和歐洲16種蜱分離毒株中得以驗(yàn)證，而且與其它豬病沒(méi)有交叉反應(yīng)。研究的另外一種基于VP72的TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR可便攜的儀器，因此簡(jiǎn)化了試驗(yàn)前后的步驟。同時(shí)，這個(gè)方法有非常高的敏感性與特異性。與前一種方法相比，它可以檢測(cè)到1.4到8.4個(gè)病毒基因的拷貝數(shù)。第三種實(shí)時(shí)熒光定量PCR是利用DNA雙螺旋上的小溝（MGB）結(jié)合物探針來(lái)擴(kuò)增非洲豬瘟病毒的9GL基因，它可以檢測(cè)到至少20個(gè)病毒基因拷貝數(shù)，這種方法已經(jīng)在15種非洲豬瘟病毒株以及相似豬病得以驗(yàn)證。目前由包括蘭州獸醫(yī)研究所等多家單位共同起草、由中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布的T/CVMA5-2018非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法在我國(guó)非洲豬瘟病毒檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。3.

多重PCR已經(jīng)建立了多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法來(lái)同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分非洲豬瘟和豬瘟病毒。它的敏感性對(duì)兩種病毒都達(dá)到了100%，它的特異性對(duì)豬瘟是100%，而對(duì)非洲豬瘟是97.3%。常規(guī)多重PCR可以同時(shí)檢測(cè)出多種豬源病毒，該方法使用多對(duì)針對(duì)各自病毒的不同引物，因?yàn)榭梢詳U(kuò)增出不同條帶的片段，因此可以在瓊脂糖凝膠電泳中加以區(qū)分。雖然，它的敏感性比單一常規(guī)PCR降低10倍左右，但是，可以同時(shí)檢測(cè)出多種豬源病毒。4.

等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)雖然RT-PCR方法在檢測(cè)非洲豬瘟病毒時(shí)的敏感性和特異性都很高，但因?yàn)檫@些方法都需要比較昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備。等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)就為了基層等條件較為落后的實(shí)驗(yàn)室提供了一種選擇。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)非洲豬瘟病毒是一種非常有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段。相比較其他方法，等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)只需要一個(gè)恒溫水浴鍋，不需要昂貴的熱循環(huán)設(shè)備。其中一種等溫?cái)U(kuò)增方法是基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（LAMP）原理建立的檢測(cè)方法，通過(guò)檢測(cè)38種不同的非洲豬瘟病毒株來(lái)比較該方法與其他檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，它可以檢測(cè)出330個(gè)病毒基因拷貝數(shù)，敏感性低于其他試驗(yàn)方法。但是，對(duì)檢測(cè)非洲豬瘟致死的豬群，這種方法的敏感性也很高。四、RT-PCR、LAMP和抗原ELISA檢測(cè)方法比較試驗(yàn)OIE參考實(shí)驗(yàn)室IAH-Pirbright通過(guò)試驗(yàn)比較了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR，一種商品化的抗原ELISA和一種LAMP方法。實(shí)驗(yàn)樣品選自試驗(yàn)感染動(dòng)物和疑似自然感染動(dòng)物。對(duì)于試驗(yàn)感染動(dòng)物，使用非洲豬瘟毒株（OURT88/1）攻毒感染后5天收集樣品進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR和LAMP試驗(yàn)方法檢測(cè)全部18頭份都是陽(yáng)性，RT-PCR的Ct值都比較低，表明了試驗(yàn)動(dòng)物病毒DNA的拷貝數(shù)很高，LAMP試驗(yàn)方法在不到30分鐘檢測(cè)出所有陽(yáng)性?？乖璄LISA的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有14頭份動(dòng)物是陽(yáng)性，3頭份不確定，還有一頭份是陰性。陰性動(dòng)物對(duì)所有方法的檢測(cè)都是陰性。這個(gè)結(jié)果表明了RT-PCR和LAMP在檢測(cè)非洲豬瘟急性癥狀樣品時(shí)的敏感性要好于抗原ELISA。田間樣品選自2004到2009年來(lái)自加納疑似感染非洲豬瘟病毒動(dòng)物。在所有46份樣品中，RT-PCR檢測(cè)34份是陽(yáng)性，LAMP檢測(cè)33份是陽(yáng)性。唯一的一份LAMP檢測(cè)是陰性，但它的RT-PCR的Ct值也非常高。當(dāng)LAMP的Tp值調(diào)到40時(shí)，它的敏感性就和RT-PCR一樣了，這表明了Tp值在LAMP試驗(yàn)中的重要性。而將這些樣品用于抗原ELISA時(shí)，只有14份是陽(yáng)性，10份不確定性，22份是陰性。這個(gè)結(jié)果表明了抗原ELISA的敏感性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于RT-PCR和LAMP方法，這可能是由于田間樣品的純度造成的。雖然抗原ELISA比RT-PCR和LAMP的敏感性都低，但當(dāng)臨床檢測(cè)緊急爆發(fā)非洲豬瘟?xí)r，抗原ELISA還是能夠成功檢測(cè)出非洲豬瘟病毒。五、結(jié)語(yǔ)與展望綜上所述，目前可用于非洲豬瘟病毒檢測(cè)的診斷技術(shù)有病毒檢測(cè)和抗