發(fā)酵工藝實驗講議講解

10高產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)菌株的紫外線誘變育種【爭論背景與意義】具有穩(wěn)定、可遺傳的生長代謝調(diào)控特性，自然界分別的具有開發(fā)利用價值的野生型菌株，因受其嚴格的代謝調(diào)控，生長過程中代謝產(chǎn)物的合成一般僅滿足自身生長生殖的需要，全部代謝產(chǎn)物都不會過度產(chǎn)生。從自然界分別獲得的產(chǎn)某種目的產(chǎn)物的野生型菌株的生產(chǎn)力量一般很低，遠不能滿足工業(yè)生產(chǎn)對菌株生產(chǎn)力量的要求。另一方面，微生物普遍具有易變異的特點，自然條件下微生物的變異頻率10-6~10-9，而微生通過物理、化學(xué)方法進展的微生物誘變育種，是生產(chǎn)上提高微生物目的產(chǎn)物生產(chǎn)力量的重要方法之一，但微生物目的產(chǎn)物生產(chǎn)力量為數(shù)量性狀，單次誘變育種對數(shù)量性狀的轉(zhuǎn)變程度有限，欲獲得目的產(chǎn)物產(chǎn)量較野生型菌株顯著提高、滿足發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)要求的高產(chǎn)突變菌株，需要經(jīng)過反復(fù)的、長時間的誘變篩選才能到達目的。而且，即使已在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的菌種，生產(chǎn)上仍需要不斷進展誘變、篩選以不斷提高生產(chǎn)性能，如通過不斷的誘變育種可獲得高產(chǎn)、耐高溫、副產(chǎn)物少、抗噬菌體等工藝性能優(yōu)良的菌株。【試驗?zāi)康摹考由顚ξ⑸锞N選育在發(fā)酵工業(yè)重要地位的生疏；穩(wěn)固工業(yè)微生物提高目的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)力量的途徑；學(xué)習(xí)把握微生物紫外誘變育種的根本流程與操作方法?！驹囼炘怼空T變育種是利用誘變劑處理微生物細胞，提高基因突變頻率，再通過適當?shù)暮Y選方法獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種過程。具有增大微生物突變機率的因素稱為誘變劑，誘變劑分為物理、化學(xué)等，物理誘變劑有各種射線〔如紫外線及射線等〕、微波或激光等，化學(xué)誘變劑有亞硝基胍、亞硝酸鹽、氮芥、氯化鋰、硫酸二乙脂等具有提高微生物突變率的化合物。以紫外線為誘變劑的微生物誘變育種，具有不需要特別貴重設(shè)備、費用廉價、危急性小、效果好等優(yōu)點，而廣泛應(yīng)用于工業(yè)育種。紫外線是一種非電離輻射，波長短于紫色可見光而又緊接紫色光的射線，波長范圍為136～300nm，紫外線波長范圍雖寬，但有效范圍僅限于一個小區(qū)域，多種微生物對260nm左右的波長最敏感，是誘變最有效的波長。當物質(zhì)吸取肯定能量的紫外線后，它的某些電子將被提升到較高的能量水平，從而引起分子激發(fā)而造成突變；而不吸取紫外線的物質(zhì)，能量不發(fā)生轉(zhuǎn)移，分子也不會激發(fā)，不會產(chǎn)生任何化學(xué)變化。DNA能大量吸取紫外線，極簡潔受紫外線的影響而變化。紫外線的誘變作用是DNA分子構(gòu)造變化，可能導(dǎo)致DNA鏈的斷裂、DNA分子內(nèi)和分子間的交連、核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)、嘧啶水合物和嘧啶二聚體的產(chǎn)生等，特別是嘧啶二聚體的產(chǎn)生對于DNA的變化起主要作用。不同微生物對紫外線的敏感程度不一，因此不同微生物誘變育種對于誘變的劑量也不同。在紫外燈的功率、照耀距離肯定的狀況下，照耀時間打算著紫外照耀劑量，因而設(shè)計紫外照耀不同時間梯度的試驗，依據(jù)照耀不同時間的死亡率，作出照耀時間與死亡率的曲線，就可以選擇適當?shù)恼找珓┝?。一般以照耀后微生物的致死率?0%~99.9%的劑量為最正確照耀劑量，但也有傾向于承受致死率70%~75%甚至更低(30%~70%)的劑量。一般認為，偏低的劑量處理后正突變率較高，而較高的劑量時則負突變率較高，但高劑量造成損傷大、回復(fù)少。目前趨向承受低劑量、長時間處理，盡管致死率較高，但誘變效果較好。微生物細胞經(jīng)誘變劑處理后沒有發(fā)生突變的細胞為多數(shù)，發(fā)生突變的細胞是少數(shù)；微生物代謝產(chǎn)物相關(guān)的突變又多數(shù)是產(chǎn)量降低的負突變，生產(chǎn)力量提高的正突變則是少數(shù)。因而，微生物細胞經(jīng)誘變處理后目的產(chǎn)物生產(chǎn)力量提高的正突變細胞極少，要獲得生產(chǎn)力量提高的正突變細胞就必需淘汰眾多的未突變與負突變細胞，即誘變處理后需要大量的篩選才能獲得正突變細胞。正突變菌株的篩選程序一般分為初選與復(fù)選2個階段。初選的目的是除去明顯不符合要求的大局部細胞，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保存下來，使性狀優(yōu)良的菌株不至于漏掉，初篩工作以量為主，測定的精確選要以質(zhì)為主，應(yīng)準確測定初選選出的每個菌株的生產(chǎn)指標，從中選出幾個生產(chǎn)力量最高的突變菌株，作為下一次誘變的動身菌株?！静牧吓c試劑】菌種與試劑可溶性淀粉、葡萄糖、KNO、KHPO、KHPO、MgSO.7HO、FeSO.HO、NaCl、NaOH、HCl、3 2 4 2 4 4 2 4 2瓊脂、大豆粕、玉米淀粉、酵母膏、瓊脂、燈用酒精。儀器設(shè)備無菌室、全溫振蕩器、滅菌器、恒溫培育箱、離心機、恒溫水浴鍋、電爐、三角(250mL、500mL)、酸度計、磁力攪拌器、燒杯〔1000mL、500mL、100mL〕、18×18試管、培育皿(90mm)、30W紫外燈、脫脂棉、紗布、漏斗、玻璃珠、1mL10把、1001000μL移液槍、血球計數(shù)板、玻棒、曲玻棒、酒精燈、酒精噴燈等。培育基高氏一號培育基〔g/L〕可溶性淀粉 20 KNO3 1 K2HPO4 1MgSO4.7H2O 0.5 FeSO4.H2O 0.01 NaCl 1瓊脂15 蒸餾水補足1000ml pH 7.2-7.4PDA培育基〔g/：去皮馬鈴薯 200〔汁〕 葡萄糖20 瓊脂15蒸餾水補足1000ml pH 6.7復(fù)選液體培育基〔g/L〕玉米淀粉 30 大豆餅粉40 酵母膏2蒸餾水補足1000ml pH 8.0配制培育基用的大豆餅粉:大豆粕先枯燥、80~100目篩過篩。突變菌株篩選混菌平板將青霉菌斜面孢子無菌水洗下制為孢子懸浮液，調(diào)孢子濃度為108個/mL，取1mL孢子懸浮液參加無42~45℃的PDA20mL，轉(zhuǎn)動培育皿使培育基與孢子混勻、冷凝，備用。【試驗步驟】1菌種活化培育拮抗菌種在高氏一號培育基斜面劃線接種，28℃培育6d。2．單孢懸液制備0.85%NaCl的無菌生理鹽水洗下斜面孢子，收集于裝有經(jīng)20250mL三角瓶內(nèi)，渦旋器上打散未分別的孢子3~5min子濃度，用無菌生理鹽水調(diào)孢子濃度為108個/mL。3．誘變處理紫外線誘變翻開紫外燈(30W)20min5mL菌懸液放在無菌的培育皿(9cm)5份。逐一操作，30cm(垂直距離)處的磁力攪拌器上，照耀lmin后翻開培育皿蓋，開頭照耀，照耀處理開頭的同時翻開磁力攪拌器進展攪拌，記錄時間，照耀時間分別為2min、4min、6min、8min及10min103個/mL、104個/mL、105個/mL等系列濃度孢0.4mL10個，2872h后將單菌落轉(zhuǎn)移至高氏一號平板，以未經(jīng)紫外線處理的103個/mL菌液為比照。死亡率測定2848h5B死亡率〔%〕= BA100%BA為紫外處理后的CFU，B為比照的CFU。初選2872h的平板單菌落，移到PDA篩選平板上，再2848h后，并選抑菌效果明顯的菌落，測量菌落直徑(H)與抑菌圈直徑〔C〕，H/C40～50個菌株轉(zhuǎn)接到高氏一號斜面，287d，低溫保藏備用。復(fù)篩振蕩培育將平板復(fù)選篩選出的每菌株接入液體培育基內(nèi)，28℃、200r/min7d3瓶，并以動身菌株為比照。抑菌效果測定4500r/min20min26mm直320μL滴于濾紙片上，每瓶做一個平板，28℃培育48h，十字穿插法測抑菌圈直徑，與比照比較，按如下公式計算菌突變菌株抗菌活性提高率〔%〕：D突變菌株抗菌活性提高率〔%〕=CD100%DC為突變菌株抑菌圈面積〔mm2〕；D為動身菌株抑菌圈面積〔mm2〕【留意事項】紫外線照耀時留意保護眼睛和皮膚。試驗時，為了避開光復(fù)活現(xiàn)象，處理過程應(yīng)在暗室的紅光下操作，處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用黑布包起來培育，然后再進展分別篩選?！驹囼灲Y(jié)果】1、記錄菌株紫處理死亡率結(jié)果分析：死亡率與紫外照耀時間的關(guān)系。2、初選結(jié)果將不同處理時間的CFU及比照的結(jié)果分析：死亡率與紫外照耀時間的關(guān)系。2、初選結(jié)果1紫外誘變處理菌株的死亡率〔%〕處理時間/min比照246 810CFUCFU死亡率CFU死亡率CFU 死亡率 CFU 死亡率CFU死亡率50個抑菌效果最明顯的單菌落，并將各被選菌落的H/C填入表內(nèi)。表2 菌株紫外誘變育種初選記錄菌株號抑菌圈直徑菌落直徑H/C處理時間菌株號抑菌圈直徑菌落直徑H/C處理時間H(mm)C〔mm〕〔min〕H(mm)C〔mm〕〔min〕結(jié)果分析：分析結(jié)果分析：分析H/C與處理時間的關(guān)系，正突變率與處理時間的關(guān)系。3、復(fù)選結(jié)果選三角瓶振蕩發(fā)酵發(fā)酵液平板抑菌效果最正確的10個菌株的抑菌效果填于表2。表2 紫外誘變復(fù)選結(jié)果記錄表菌株號菌株號比照抑菌圈直徑/mm高(%)紫外誘變結(jié)果綜合分析：1、被選菌株與處理時間、死亡率的關(guān)系。24個抑菌圈最大正突變菌株的菌落特征?！舅伎碱}】何為表型延遲現(xiàn)象？絲狀菌的誘變怎樣才能避開表型延遲現(xiàn)象？何為表型延遲現(xiàn)象？絲狀菌的誘變怎樣才能避開表型延遲現(xiàn)象？試述紫外線誘變的作用機理及其在具體操作中應(yīng)留意的問題。為什么在誘變前要把菌懸液打散。絲狀菌孢子誘變后需要實行什么措施才能獲得純的突變菌株？紫外線誘變選育獲得的高產(chǎn)突變菌株可能經(jīng)2次轉(zhuǎn)管后其目的產(chǎn)物的產(chǎn)量就大幅降低，試分析可能的緣由。發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)除轉(zhuǎn)變菌種的遺傳特性外，還可通過哪些途徑提高生產(chǎn)效益？微生物目的產(chǎn)物的合成是生物化學(xué)反響的結(jié)果，試分析提高發(fā)酵微生物代謝產(chǎn)物產(chǎn)量可能的途徑。你對微生物紫外誘變育種有何體會？小型發(fā)酵罐好氧發(fā)酵與過程掌握【爭論背景與意義】【爭論背景與意義】發(fā)酵工業(yè)是關(guān)系國際民生的重大產(chǎn)業(yè)，在社會很多領(lǐng)域有著廣泛的用途。在醫(yī)藥工業(yè)上用于生產(chǎn)抗生-2等。在食品工業(yè)方面發(fā)酵用于生產(chǎn)各種酒類、調(diào)味品、食品添加劑等。在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域用微生物進展污水處理等。在化工能源領(lǐng)域用微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種有機酸、生物材料、生物塑料、生物燃料等。在農(nóng)業(yè)方面用微生物發(fā)酵生產(chǎn)農(nóng)用與獸用抗生素、殺蟲劑、微生物肥料等。而酶制劑工業(yè)用微生物發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、纖維素酶與脂肪酶等。工業(yè)生產(chǎn)中將利用微生物在通氣或厭氣條件下的產(chǎn)品生產(chǎn)過程統(tǒng)稱為發(fā)酵，發(fā)酵依據(jù)發(fā)酵的特點分為不同的類別。依據(jù)微生物種類不同分為好氧性發(fā)酵和厭氧性發(fā)酵；依據(jù)培育基狀態(tài)分為固體發(fā)酵和液體發(fā)酵；依據(jù)發(fā)酵設(shè)備分為敞口發(fā)酵、密閉發(fā)酵、淺盤發(fā)酵、深層發(fā)酵；依據(jù)微生物發(fā)酵操作方式分為分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、補料分批發(fā)酵；依據(jù)微生物發(fā)酵產(chǎn)物分為微生物菌體發(fā)酵、微生物酶發(fā)酵、微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵、微生物的轉(zhuǎn)化發(fā)酵、生物工程細胞發(fā)酵?！驹囼?zāi)康摹苛私獍l(fā)酵工業(yè)發(fā)酵系統(tǒng)的根本構(gòu)造與功能。把握工業(yè)種子培育基、發(fā)酵培育制備過程。把握發(fā)酵罐的使用及其大規(guī)模培育微生物的方法。學(xué)習(xí)把握發(fā)酵生產(chǎn)中主要參數(shù)的調(diào)控技術(shù)。發(fā)酵工業(yè)實質(zhì)上是利用微生物代謝產(chǎn)生的酶的作用生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品，涉及生物催化劑的生物化學(xué)反響，因而發(fā)酵生產(chǎn)過程亦稱為生化反響過程。用于工業(yè)發(fā)酵的容器稱為發(fā)酵罐，也可叫做生物反響器。發(fā)酵工業(yè)液體發(fā)酵的發(fā)酵罐分為液態(tài)厭氧發(fā)酵罐及液態(tài)好氧發(fā)酵罐2【試驗?zāi)康摹苛私獍l(fā)酵工業(yè)發(fā)酵系統(tǒng)的根本構(gòu)造與功能。把握工業(yè)種子培育基、發(fā)酵培育制備過程。把握發(fā)酵罐的使用及其大規(guī)模培育微生物的方法。學(xué)習(xí)把握發(fā)酵生產(chǎn)中主要參數(shù)的調(diào)控技術(shù)?！驹囼炘怼糠N子培育基是用于使孢子萌發(fā)，菌體生長生殖的培育基。培育基成分除必需具有微生物生長代謝的各種子培育基是用于使孢子萌發(fā)，菌體生長生殖的培育基。培育基成分除必需具有微生物生長代謝的各類養(yǎng)分物質(zhì)外，還應(yīng)具有肯定的速效C源，如葡萄糖；速效N源，如銨態(tài)氮與硝態(tài)氮，以及養(yǎng)分成分較全面的酵母膏等。使孢子快速萌發(fā)、菌絲快速生長，并具有具有很強的生活力，還要并兼顧培育基原料的成本廉價。最終一級種子培育基成分應(yīng)與發(fā)酵培育基接近，以縮短種子接種至生產(chǎn)罐后的延滯期。發(fā)酵培育基是生產(chǎn)上直接生產(chǎn)目的產(chǎn)物的培育基，要求培育基的原料應(yīng)價格低廉、易得、性能穩(wěn)定，便于選購運輸、適合大規(guī)模貯存。培育基的成分要能保證生產(chǎn)的需求，滿足產(chǎn)物的經(jīng)濟合成，不含對微生如發(fā)酵形成的副產(chǎn)物少，不對通氣、提取、精制及廢物處理等造成嚴峻的不利影響。液體深層通氣純種發(fā)酵是現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的主要發(fā)酵類型。此類發(fā)酵首先需要對發(fā)酵罐及其管道、培育基進展滅菌，而生產(chǎn)菌種需要先經(jīng)數(shù)次種子擴大生殖，最終接入生產(chǎn)罐發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)物。不管是種子發(fā)酵與生產(chǎn)發(fā)酵，發(fā)酵的過程中要不斷地向發(fā)酵罐通入無菌空氣，保證微生物生長、產(chǎn)物合成過程中對氧的pH并依據(jù)發(fā)酵液養(yǎng)分物的狀況進展補料等。整個發(fā)酵過程中需要時刻監(jiān)視發(fā)酵系統(tǒng)的運行狀況、定時檢測菌并依據(jù)發(fā)酵液養(yǎng)分物的狀況進展補料等。整個發(fā)酵過程中需要時刻監(jiān)視發(fā)酵系統(tǒng)的運行狀況、定時檢測菌的生長與目的產(chǎn)物的累積狀況、監(jiān)視發(fā)酵液的染菌狀況等，并依據(jù)實際狀況實行敏捷、有效的措施，確保生產(chǎn)的正常進展。度掌握系統(tǒng)、消泡系統(tǒng)、酸堿調(diào)整與補料系統(tǒng)等構(gòu)成。發(fā)酵罐的罐體是微生物生長生殖與產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的場所，蒸汽系統(tǒng)是培育基、罐體高溫濕熱滅菌的熱源，空氣過濾系統(tǒng)為純種、好氧發(fā)酵供給無菌空氣，發(fā)系統(tǒng)則掌握發(fā)酵過程中的泡沫，以免泡沫過多沖頂引起雜菌污染以及跑料降低生產(chǎn)效率。酸堿調(diào)整與補料pH和為發(fā)酵過程中添加養(yǎng)分物質(zhì)與前體物質(zhì)，以獲得最大限度提高目的產(chǎn)物生產(chǎn)，使大型發(fā)酵罐的性能與小型試驗罐接近，大型發(fā)酵罐的生產(chǎn)效率與小型發(fā)酵罐的相像。在不同大小的發(fā)酵罐中的生物反響過程雖然一樣，但在質(zhì)量、熱量和動量的傳遞上卻會有明顯的差異，致使微生物的生長速率、代謝產(chǎn)物的合成存在差異?！静牧吓c試劑】試劑與材料可溶性淀粉、KNO、KHPO、MgSO.7HO、FeSO.HO、NaCl、瓊脂15、大豆粕、玉米淀粉、酵3 2 4 4 2 4 2母膏、消泡劑、瓊脂、蒸餾水、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無水乙醇等。儀器設(shè)備5L發(fā)酵罐系統(tǒng)、培育箱、離心機、恒溫水浴鍋、電爐、三角瓶(250mL、500mL)、酸度計、18×18試管、培育皿(90mm)、脫脂棉、漏斗、玻璃珠、1mL10把、100μL移液槍、血球計數(shù)板、玻棒、酒精燈、酒精噴燈等?！驹囼灢襟E】培育基制備高氏一號培育基〔g/L〕可溶性淀粉 20 KNO3 1 K2HPO4 1MgSO4.7H2O 0.5 FeSO4.H2O 0.01 NaCl 1瓊脂15 蒸餾水補足1000ml pH 7.2-7.4PDA培育基〔g/：去皮馬鈴薯 200〔汁〕 葡萄糖20 瓊脂15蒸餾水補足1000ml pH 6.7種子培育基〔g/L〕玉米淀粉20 葡萄糖10 大豆餅粉20酵母膏4 蒸餾水補足1000ml pH 8.094〕發(fā)酵培育基〔g/L〕玉米淀粉 30 大豆餅40 酵母膏2蒸餾水補足1000ml pH 8.0將質(zhì)量為玉米淀粉0.5的7℃左右溫度下酶解30mi大豆餅先粉碎、100目篩過篩。〔5〕發(fā)酵液抗菌物質(zhì)生物檢測混菌平板將青霉菌斜面孢子用無菌水洗下制為孢子懸浮液，調(diào)孢子濃度為108個/mL，取1mL孢子懸浮液參加無菌培育皿，倒入PDA20mL，轉(zhuǎn)動培育皿使培育基與孢子混勻，平放冷凝后備用。種子液的制備200mL裝入500mL三角瓶內(nèi)，8頁層紗布封口，滅菌。培育基冷卻至室溫后，將適量斜面活化后菌種的菌絲體與孢子接入三角瓶內(nèi)，28℃、200r/min36~48h后為供發(fā)酵罐發(fā)酵的種子液。發(fā)酵液過程中復(fù)原糖的測定發(fā)酵過程中的取樣操作取樣操作是發(fā)酵過程中在線掌握的重要內(nèi)容，只有通過取樣才能對發(fā)酵過程中的諸多參數(shù)進展測定，從而把握發(fā)酵罐發(fā)酵狀況，為進一步的發(fā)酵調(diào)供給依據(jù)。取樣操作要做到動作協(xié)調(diào)、快速，嚴格依據(jù)操作程序進展，避開造成發(fā)酵罐的污染。盛放樣品的器皿也要干凈、無菌，以防止對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。DNS法復(fù)原糖測定DNS法又稱3，5－二硝基水楊酸法。在堿性溶液中，復(fù)原糖變?yōu)橄┒?，烯二醇可?，5－二硝基水楊酸氧化為糖酸。加熱進一步產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物。在肯定濃度范圍內(nèi)，復(fù)原糖含量與棕紅色DNS和科研上應(yīng)用更為廣泛。[試驗材料]1〕分析試劑DNS1000mlDNS溶液含有酒石酸鉀鈉182g，無水亞硫酸鈉3g，氫氧化鈉20g，3,5－二硝基水楊酸6.3g，重蒸餾酚4g。配制后過濾放置半月后使用。1%葡萄糖標準溶液配制準確稱取100mg100ml，冰箱保存?zhèn)?0%的ZnSO4溶液。2〕器材分光光度計、定糖管、移液管、容量瓶、燒杯及電爐等。[方法步驟]〔一〕葡萄糖標準曲線的繪制9〔15min，后馬上流淌水冷卻。管內(nèi)溶液混勻，用空白管溶液調(diào)零點，520nm測定光密度值(O.D.)，以葡萄糖含量為橫坐標，光密度值為縱坐標繪制葡萄糖溶液標準曲線。表1 制作葡萄糖標準曲線時各試劑用量11，并繪制葡萄糖標準曲線圖。工程CK12345678含糖總量/mg00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖液/mL00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸餾水/mL2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNA試劑/mL1.51.51.51.51.51.51.51.51.5加熱5min冷卻流淌自來水冷卻蒸餾水/mL21.521.521.521.5 21.5 21.521.521.521.5光密度/520nm0〔二〕發(fā)酵液取樣依據(jù)發(fā)酵罐取樣的操作規(guī)程取樣，將取樣的發(fā)酵液裝入干凈的三角瓶內(nèi)。〔三〕發(fā)酵液的處理12023rpm10min5ml上〔100ml10ml10%ZnSO4溶液，用堿液〔NaOH3mol/L〕調(diào)為堿性，以水稀釋至刻度、搖勻；通過枯燥濾紙過濾。依據(jù)表2參加相應(yīng)試劑進展反響。520nm測定光密度值，最終依據(jù)葡萄糖標準曲線算動身酵液所含復(fù)原糖的量。每管測定三次，求平均值。2青霉素發(fā)酵液所含復(fù)原糖的測定工程CK1 23發(fā)酵液/mL00.8 0.80.8蒸餾水/mL2.01.2 1.21.2DNA試劑/mL1.51.5 1.51.5加熱5min冷卻流淌自來水冷卻蒸餾水/mL21.521.5 21.521.5光密度/520nm0光密度平均值留意：1、試驗中全部的試管要干凈，參加各種試劑量要準確。2、試劑不行倒出，用干凈的移液管吸取，用后蓋好瓶塞，防回原處。3、定糖管的管口在加熱時不行朝向人，以免糖液過度沸騰飛濺傷人。4、葡萄糖標準曲線繪制要準確，盡量符合統(tǒng)計學(xué)意義〔R2>97％〕。假設(shè)繪制時濃度過度分散需重做依次。5、分光光度計使用：溶液不要倒太多；毛邊不要對著透光處；用后用自來水沖洗干凈，防回原處。[試驗結(jié)果]1〕1，并繪制葡萄糖標準曲線圖。工程CK12345678含糖總量/mg00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖液/mL00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸餾水/mL2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNA試劑/mL1.51.51.51.51.51.51.51.51.5加熱5min冷卻流淌自來水冷卻蒸餾水/mL21.5 21.521.521.521.521.521.521.521.5光密度/520nm0建立光密度與葡萄糖濃度間的回歸議程。依據(jù)葡萄糖標準曲線，算動身酵液中復(fù)原糖的濃度。24h發(fā)酵后側(cè)得發(fā)酵液的吸光值工程CK工程CK123發(fā)酵液/mL00.8 0.80.8蒸餾水/mL2.01.2 1.21.2DNA試劑/mL1.51.5 1.51.5加熱5min冷卻流淌自來水冷卻蒸餾水/mL21.521.5 21.521.5光密度/520nm0光密度平均值將平均光密度值代入回歸議程，計算先得發(fā)酵的復(fù)原糖量。發(fā)酵系統(tǒng)的生疏、功能與小型發(fā)酵罐的安裝1〕發(fā)酵罐罐體的構(gòu)造2〕發(fā)酵罐的掌握系統(tǒng)3〕發(fā)酵罐的蒸汽系統(tǒng)4〕發(fā)酵罐的通氣系統(tǒng)5〕發(fā)酵罐的控溫系統(tǒng)發(fā)酵罐的pH掌握與補料系統(tǒng)發(fā)酵罐的攪拌系統(tǒng)發(fā)酵罐的消泡系統(tǒng)發(fā)酵罐的滅菌操作將發(fā)酵培育基裝入發(fā)酵罐用，培育基裝入量為發(fā)酵罐工程容積的60%，插入已標定后的pH電極，關(guān)閉全部管道閥門，攪拌器設(shè)定150r/min，開啟攪拌器。翻開發(fā)酵罐排氣閥，翻開夾套蒸汽閥進展發(fā)酵罐培育基預(yù)熱。當溫度到達90罐溫升至1210.11MPa30min。滅菌完畢前關(guān)閉過濾器排污閥，并將溶氧電極標定為0.0%。滅菌完畢后關(guān)閉總蒸汽閥、排污閥，翻開冷卻閥，待罐溫降至110℃時翻開進氣閥，調(diào)整罐壓為0.03MPa2890℃以后開啟攪拌。發(fā)酵過程的掌握發(fā)酵罐接種、發(fā)酵開頭282~395%燈用酒精倒入發(fā)酵罐接種環(huán)內(nèi)，點燃酒精，擰開接種口蓋，將發(fā)酵液體積5%的種子液倒入發(fā)酵罐內(nèi)，擰緊接種蓋。30200r/min10.03MPa、pH=8，發(fā)酵開頭。5~10%。溫度的掌握48h3048h28℃。3〕溶氧的掌握24h0.5150r/min24h~96h內(nèi)設(shè)通1.5250r/min。4〕pH的掌握發(fā)酵過程中，發(fā)酵液pH7.5~8以內(nèi)，手動或自動掌握，掌握量5%。5〕發(fā)酵液養(yǎng)分的掌握發(fā)酵過程中，發(fā)酵36h時第一次補料，補料全料，補料量10%72h時其次次補料，補料類型為1/210%。6〕發(fā)酵泡沫的掌握發(fā)酵過程中，自動或手動添加泡敵消泡，掌握量5%，假設(shè)手動掌握當泡沫消逝后馬上停頓。7〕發(fā)酵過程的觀看、記錄發(fā)酵過程中輪番值班，每班4人、值班時間6h，凡偶數(shù)班接班時取樣進發(fā)酵液的生物量、發(fā)酵液抗菌活性的生物檢測、復(fù)原糖檢測等。各班記錄加堿液次數(shù)與添加量、消泡劑添加次數(shù)及添加量，以及鏡檢觀察。發(fā)酵過程的檢測方法翻開取樣管，先將原管內(nèi)的培育基放掉后接流出的發(fā)酵液少許用于進展測試。鏡檢觀看發(fā)酵的菌絲生長與染菌狀況將發(fā)酵液滴于載玻片中心，蓋上蓋玻片，40倍物鏡下觀看菌絲量及有無細菌污染狀況。發(fā)酵液菌絲體生物量測定〔濕重法〕準確量取適量體積發(fā)酵液裝于離心管內(nèi)4500r/min、離心20min，去上清液，沉淀加無菌水以渦旋器混勻，重復(fù)離心，菌絲體淺薄稱重，按如下公式計算生物量〔濕重〕：E發(fā)酵液菌絲體生物量〔mg/mL〕= FE—離心沉淀重〔mg〕，F(xiàn)—離心發(fā)酵液體積〔mL〕發(fā)酵液抗菌活性測定4500r/min20min2層直徑6mm320μL3個平板，2848h，十字穿插法測抑菌圈直徑〔單位：mm〕。發(fā)酵液粘度測定發(fā)酵罐取出的發(fā)酵28℃恒溫下，以粘度計測定發(fā)酵液的粘度。發(fā)酵放罐及發(fā)酵罐的清洗發(fā)酵時間到達120h時發(fā)酵完畢、放罐，收集發(fā)酵液，并測定發(fā)酵液的生物量、發(fā)酵液的抗菌活性、粘度及發(fā)酵液的殘?zhí)橇?。拆卸罐體各部件，充分清洗罐體、通氣管、取樣管、pH與溶氧電極等，洗凈后再重組裝。五、結(jié)果與分析五、結(jié)果與分析種子的生長狀況描述包括種子液描述表觀濃稠度、顏色、有無細菌污染異味，種子液的生物量測定，鏡檢菌絲體，細菌污染狀況等。發(fā)酵值班記錄各班將發(fā)酵過程中操作的狀況記錄于表1內(nèi)。發(fā)酵時間發(fā)酵時間員表1 發(fā)酵操作記錄罐內(nèi)泡沫發(fā)酵液pH加堿量泡沫量(多、少)發(fā)酵液生物量加消泡劑量 (濕重,mg/mL)發(fā)酵液抗菌活性(抑菌圈直徑,mm)備注(排氣氣等)特別現(xiàn)象、突發(fā)狀況記錄：繪制發(fā)酵發(fā)酵過程中溶氧、pH、發(fā)酵液抗菌活性、生物量的曲線，以每班內(nèi)的平均為繪圖數(shù)據(jù)?！玖粢馐马棥堪惭b與折卸發(fā)酵罐頂蓋時，連接螺帽的擰緊、擰松時都應(yīng)留意對角線螺帽同時、以同樣大小的力擰動，而且要分屢次擰動，每次擰動用力不要過猛。安裝與折卸發(fā)酵罐頂蓋時，連接螺帽的擰緊、擰松時都應(yīng)留意對角線螺帽同時、以同樣大小的力擰動，而且要分屢次擰動，每次擰動用力不要過猛。發(fā)酵罐pH電極的使用與維護，pH10h左右，使用時應(yīng)先用6.86標準磷酸緩沖溶液定位，然后以4.00標準磷酸緩沖溶液調(diào)斜率，上述較正完成后再將pH電極插入蓋的插孔內(nèi)、并擰緊。發(fā)酵罐培育基滅菌前應(yīng)先檢查罐體的氣密性，關(guān)閉所排氣閥、翻開進氣閥向發(fā)酵罐通氣，大到肯定罐壓后關(guān)閉進氣閥停頓通氣，停頓通氣時觀看罐壓，過3-5分鐘后再觀看罐壓，假設(shè)壓力沒明顯降低說明罐體的氣密好，可以開頭滅菌。培育基滅菌過程中不接觸罐體的玻璃部件，以免玻璃裂開高溫蒸汽發(fā)生意外事故。發(fā)酵罐接種時應(yīng)適當增大通氣量，點燃接種杯酒精后戴上濕棉手套擰開接種孔蓋，三角瓶內(nèi)種子液在火焰上方拔去棉塞、瓶口在火焰上灼燒后再倒入種子液。發(fā)酵罐接種時應(yīng)適當增大通氣量，點燃接種杯酒精后戴上濕棉手套擰開接種孔蓋，三角瓶內(nèi)種子液在火焰上方拔去棉塞、瓶口在火焰上灼燒后再倒入種子液。發(fā)酵過程中加堿液與消泡劑時的流速掌握量不能太大，應(yīng)緩慢參加，以免參加過量對發(fā)酵與目的的提取造成不利影響。發(fā)酵過程中的取樣應(yīng)前將取樣管內(nèi)存在的發(fā)酵液放掉，然后再放肯定體積的發(fā)酵液用于發(fā)酵的檢測，取樣后要將取樣管的管口始終浸于消毒液內(nèi)。發(fā)酵完畢后準時將pH電極清洗干凈，將電極置于飽和氯化鉀溶液內(nèi)保存，絕不能長期干放，不能在外表附有枯燥介質(zhì)時貯存電極?！舅伎碱}】何為種子培育基、發(fā)酵培育基？兩者目的、要求有何區(qū)分？何為種子培育基、發(fā)酵培育基？兩者目的、要求有何區(qū)分？發(fā)酵液溶氧缺乏時可通過哪些途徑提高發(fā)酵液的溶氧？發(fā)酵生產(chǎn)初及代謝產(chǎn)物與次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵過程參數(shù)的掌握有何異同？為什么培育基滅菌過程中不始終開攪拌發(fā)酵工業(yè)的發(fā)酵系統(tǒng)各由哪些主要部件構(gòu)成？各部件的主要作用是什么？補料具有的作用是什么？怎樣進展補料？如何進展發(fā)酵終點的判定？分批滅菌與連續(xù)滅菌的主要優(yōu)錯點有哪些？發(fā)酵中泡沫是怎樣產(chǎn)生的？泡沫對發(fā)酵有哪些不利影響？發(fā)酵染菌的途徑？不同染菌的途徑染菌后如何處理？生產(chǎn)發(fā)酵系統(tǒng)包括哪些主要組成局部？各有何主要功能？小型發(fā)酵罐的安裝應(yīng)留意哪些問題？分析發(fā)酵中發(fā)酵罐排出的氣體有氨味可能的緣由。抗霉菌拮抗菌株發(fā)酵液抗菌物質(zhì)的提取與精制【爭論背景與意義】發(fā)酵工程由上游工程、中游工程和下游工程三局部組成。上游工程包括優(yōu)良種株的選育，最適發(fā)酵條件確實定，養(yǎng)分物的預(yù)備等。中游工程主要指在最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵罐中大量培育細胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術(shù)。下游工程指從發(fā)酵料液中分別和純化產(chǎn)品的技術(shù)，包括發(fā)酵料液預(yù)處理、固液分別、細胞破碎、目的產(chǎn)物的提取與精制，最終還有產(chǎn)品的包裝處理技術(shù)。發(fā)酵料液是含有細胞、代謝產(chǎn)物和剩余培育基等多組份的多相系統(tǒng)，粘度常很大，因而發(fā)酵料液的固液分別很困難。發(fā)酵目的產(chǎn)物在發(fā)酵料液中濃度很低，且常常與養(yǎng)分物質(zhì)等大量雜質(zhì)形成簡單的混合物，有的目的產(chǎn)物不穩(wěn)定，遇熱、極端pＨ、有機溶劑會分解或失活。另外，由于發(fā)酵是分批操作，生物變異性大，各批發(fā)酵液不盡一樣，因而要求下游加工有肯定彈性。發(fā)酵的最終產(chǎn)品純度要求較高。上述種種緣由使下游加工過程成為很多發(fā)酵生產(chǎn)中最重要、本錢費用最高的環(huán)節(jié)，甚至有因發(fā)酵生產(chǎn)中因缺乏適宜的、經(jīng)濟的下游處理方法而不能投入生產(chǎn)。從發(fā)酵料液分別提取目的產(chǎn)物首先需要進展料液的預(yù)處理，以大幅降低料液的粘度，提高固液分別效率，并應(yīng)盡量除盡料液中的蛋白、膠體物與高價的離子，為目的產(chǎn)物的高效分別制造條件。對以微生物代謝產(chǎn)物為目的產(chǎn)物的提取，應(yīng)依據(jù)預(yù)處理后目的產(chǎn)物是存在于固相或液相的不同，實行相應(yīng)的方法。提取的目的產(chǎn)物常常含有多種雜質(zhì)，其中有的可能影響目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性或?qū)δ康漠a(chǎn)物藥用與食用的安全存在不利影響，還需要經(jīng)過精制最大限度將其除去。而且發(fā)酵生產(chǎn)的微生物活性產(chǎn)品，不管是藥用還食用產(chǎn)品的純度打算著產(chǎn)品的價格，高純度產(chǎn)品的價格可能成倍高于低純度產(chǎn)品的價格，因而從產(chǎn)品的安全與生產(chǎn)的效益角度考慮，提取的發(fā)酵產(chǎn)物都需要精制，以求綜合效益的最大化。由于發(fā)酵料液仍殘留有局部養(yǎng)分物質(zhì)，假設(shè)不準時處理可能雜菌生長，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物使發(fā)酵料液目的產(chǎn)物的分別難度增大，甚至可能分解發(fā)酵料液中的目的產(chǎn)物而降低目的產(chǎn)物的得率。有的生物活性產(chǎn)物遇熱、極端pＨ、光與局部有機溶劑而分解與失活。因而，發(fā)酵料液中目的產(chǎn)物的分別要求準時進展處理，處理條件要溫順，盡可能避開長時間高溫、強酸強堿等極端條件，假設(shè)從預(yù)處理后的固相浸提目的產(chǎn)物應(yīng)選擇對目的產(chǎn)物穩(wěn)定性無不利影響的溶劑，對光與溫度敏感的活性物質(zhì)的枯燥過程宜承受避光冷凍枯燥?！驹囼?zāi)康摹苛私夂桶盐瞻l(fā)酵產(chǎn)物的分別提取流程。了解和把握發(fā)酵產(chǎn)物的分別提取流程。把握微生物發(fā)酵目的產(chǎn)物的精制根本原理與方法。微生物目的產(chǎn)物的精制技術(shù)。【試驗原理】發(fā)酵料液中目的產(chǎn)物濃度較低，大多為發(fā)酵料液中目的產(chǎn)物濃度較低，大多為1～10％，懸浮液中大局部是水，處理體積量大。細胞的顆粒小，相對密度，細胞含水量大，可壓縮性大，一經(jīng)壓縮就會變形。料液中含有殘?zhí)?、膠體物質(zhì)、蛋白質(zhì)等，流變特性簡單，液相粘度大，易吸附在過濾介質(zhì)上。有的產(chǎn)物性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時間變化易被空氣氧化、微生物污染等。發(fā)酵料液中含有的雜蛋白、膠體物質(zhì)等嚴峻影響料液的固液分別，且當從料液中目萃取的產(chǎn)物時膠體與蛋白造成非極性溶劑乳化，不利于萃取后的油水分別。發(fā)酵料液中存在有大量的鎂離子、鈣離子、鎂離子等高價金屬離子，假設(shè)不除去又將對以離子交換層析分別目的產(chǎn)物時使離子交換層析的分別效率降低。提子等高價金屬離子，假設(shè)不除去又將對以離子交換層析分別目的產(chǎn)物時使離子交換層析的分別效率降低。提取發(fā)酵料液中的提取目的產(chǎn)物首先應(yīng)進展的預(yù)處理，使雜蛋白、膠體物質(zhì)變性絮凝等，以改善發(fā)酵液的物理性質(zhì)與流體性能，還可去出局部可溶性雜質(zhì)等，從而降低濾餅阻力，提高過濾與分別的速率，并有利于目的產(chǎn)物的提取和精制。改善發(fā)酵料液過濾效率的方法有酸堿處理、熱處理、電解質(zhì)處理、添加分散劑、添加外表活性物質(zhì)、添加反響劑及添加助濾劑等。發(fā)酵料液中添加草酸可與鈣結(jié)合生成草酸鈣沉淀，參加三聚磷酸鈉可與鎂離子形成絡(luò)合物，添加黃血鹽可與鐵離子形成普魯士藍沉淀而除去。料液預(yù)處理后需準時離心或過濾進展固液分別，然后進展目的產(chǎn)物的提取。目的產(chǎn)物的提取應(yīng)先明確預(yù)處理后目的產(chǎn)物是存在于固相還是液相中，依據(jù)目的產(chǎn)物存在的位置，選擇適宜的提取方法。假設(shè)目的產(chǎn)物存在于液相中可用層析、萃取、沉淀等方法提取，對存在于固相內(nèi)的目的產(chǎn)物可承受溶劑浸提，假設(shè)存在于細胞內(nèi)則先應(yīng)進展細胞裂開，然后再浸提。在提取分別過程中應(yīng)考慮提取溶劑種類、溫度、pH、各種雜質(zhì)等對產(chǎn)物得率與活性的影響。提取實為從物料中分別出目的物及其性質(zhì)相像物的過程，即不管是液相萃取與層析的提取液，還是從固獲得的浸提液中都有大量非目的產(chǎn)物存在，為了獲得較高純的目的產(chǎn)物還要對提取的粗提物進展進一步的精制，以盡可能除去非目的產(chǎn)物，常用的精制方法包括進一步的層析、結(jié)晶等，精制處理后經(jīng)枯燥及得目的產(chǎn)物樣品?！静牧吓c試劑】菌種試劑高氏一號培育基成分、大豆粕、玉米淀粉、酵母膏、消泡劑、瓊脂、蒸餾水、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、燈用酒精、鹽酸、氫氧化鈉、草酸、三聚磷酸鹽、黃血鹽、無水乙醇、無水甲醇。儀器設(shè)備5L發(fā)酵罐系統(tǒng)、培育箱、離心機、恒溫水浴鍋、電爐、三角瓶(250mL、500mL)、酸度計、18×18試管、燒杯、培育皿(90mm)、冷凍枯燥機、紫外-1mL移液槍、100移液槍、血球計數(shù)板、玻棒、酒精燈、酒精噴燈等?！驹囼灢襟E】發(fā)酵料液的制備菌種的活化，種子液制備，小型發(fā)酵罐發(fā)酵，