醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實驗指導(dǎo)第一章

醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實驗指導(dǎo)第一章

一、要求

1.熟悉實驗室規(guī)則及常用生化儀器

2.清點洗刷實驗用具。

3.掌握各類儀器的正規(guī)操作及保護

二、常用生化儀器

燒杯

試管

刻度吸量管

離心管

滴管

攪棒

槍式移液器及其配適吸頭

混勻器

恒溫水浴箱

離心機

分光光度計，

電泳儀

點收儀器；

根據(jù)儀器清單，逐項查點是否完好（如有缺損向教師聲明及時補充更換）。

本套儀器由本人使用保管至全部實驗課程結(jié)束。

三、基本操作

1.玻璃儀器的洗滌

（1）洗滌液：

①洗潔精，肥皂水，洗衣粉。

②玻璃儀器專用洗滌液：要緊成份為中性稀氯氧化劑，上海日化研究所出品

（2）洗滌的要求與步驟：

要求：潔凈的玻璃器皿表面應(yīng)不掛任何水滴。

步驟：

不凈的器皿

洗衣粉或者肥皂水刷洗

自來水沖凈

達到要求？|

是浸入洗液做小時至過夜）

自來水沖凈

蒸儲水涮洗2-3次1

（其目的是去除自來水中的雜質(zhì)，故應(yīng)少量多次，全面充分）

烤干或者晾干、備用

對使用過的儀器應(yīng)養(yǎng)成及時清洗的習(xí)慣，特別是血液分析時用以吸取血液樣本的吸管,

用過后應(yīng)當(dāng)立即用水將所沾的血液沖去，否則放置過久，血液干燥硬結(jié)，就很不容易清除。

（3）玻璃儀器的干燥

通常的玻璃儀器均可洗凈后倒置架上，讓其水分蒸發(fā)自然干燥，如需迅速干燥者應(yīng)按儀器

的不一致類型按下述不一致方法處理：

①試管、離心管、燒杯、燒瓶等普通玻璃器皿可置烤箱中100—105℃烘烤

②少量儀器如需急用也可在電爐上或者酒精燈上烘烤。烘烤時應(yīng)將器皿時時轉(zhuǎn)動，務(wù)使

受熱緩慢且均勻，并將管口（或者杯口）傾斜向下，以便水蒸氣冷凝成水滴，順口流出，不致

使水滴接觸烘熱了的器壁而使儀器爆裂。

③使用電吹風(fēng)干燥通常玻璃儀器也很便利常用。

④下列玻璃儀器應(yīng)避免烘烤：吸管：容易造成器壁變形而致容量不準(zhǔn)。

比色杯：易在烘烤時發(fā)生破裂。

2.移液操作

（1）吸量管的使用

①吸量管的選擇：

在一次完成轉(zhuǎn)移的前提下，應(yīng)選用容量較小的吸量管。

?關(guān)于同一次實驗中同一種試劑的移取，應(yīng)選用同一支吸量管

②操作（見圖1一1）

?用洗耳球?qū)⒁后w吸至超過標(biāo)線

?移開洗耳球，迅速用食指壓緊管口

?必要時將管尖端外圍拭凈

?調(diào)液面至標(biāo)線

?放開食指，使液體流入容器

?將最后液滴沿器壁而下或者吹出

③讀數(shù)（見圖1—2）

?吸量管保持垂直

?視線與液面應(yīng)水平

?管中液面與刻度線應(yīng)呈切線

注：關(guān)于刻度由上至下的吸量管應(yīng)盡量使用上端刻度管尖殘液是否需吹出，看清標(biāo)記。

圖1-1使用吸量管的姿勢圖1-2定量移液管的讀數(shù)方法

彎

(2)槍式移液器的使用

①搶式移液器的結(jié)構(gòu)(見圖3)

1.液體吸放鈕

2.體積選取鈕

3.體積、顯示

4.槍頭排放鈕

5.槍頭排放器

6.槍頭接嘴

其內(nèi)部柱塞分2段行程，第1檔為吸液，第2檔為放液，手感十分清晰。

②操作(見圖1—4)

?調(diào)體積選取鈕至所需值

?套上槍頭，旋緊

?垂直持握槍式移液器外殼，按下大拇指至第1檔

?將槍頭插入溶液，徐徐松開大拇指，使其復(fù)原

?排放時，重新將大拇指按下，至第1檔后，繼續(xù)按至第2檔以排空

注：移取過程中應(yīng)操縱速度，力度

如需移取另一樣品，按槍頭排放鈕，更換槍頭

3.混勻

(1)旋轉(zhuǎn)法：手持容器，使溶液作離心旋轉(zhuǎn)

(2)指彈法：一手執(zhí)試管上端，另一手輕彈試管下部，：使其中液體作渦旋運動。

(3)攪動法：使用玻璃棒攪邊；多用于溶解燒杯中的固體。

(4)混勻器法：將試管置于混勻器的振動盤上，逐步用力下壓，使內(nèi)容物旋轉(zhuǎn)。

(5)倒轉(zhuǎn)混勻：適用于具塞的容器，如容量瓶、具塞量筒及具塞離心管等。操作時，將容器

反復(fù)倒轉(zhuǎn)。試管內(nèi)的液量太多，也可利用倒轉(zhuǎn)混勻法，外面包以玻璃紙塞住管口，然后用手

指按住橡皮塞將試管反復(fù)倒轉(zhuǎn)，溶液即可充分混勻。

(6)吸管混勻法：用吸管將溶液反復(fù)吸吹數(shù)次，以達到混勻的目的。

4.加熱與保溫

⑴加熱

①直接加熱②水浴加熱

圖1-5直接加熱圖1-6水浴加熱

（管口切勿對著自己或他人）（加熱用水要適量）

⑵保溫

①使用恒溫水浴箱，調(diào)節(jié)溫度設(shè)定鈕至需要的溫度。

②水浴箱中水要足量。

③實驗過程中應(yīng)隨時監(jiān)測溫度，并及時調(diào)節(jié)。

5.離心

(1)離心沉淀法：

當(dāng)顆粒小而不均一，沉淀粘稠或者容積小又需精確定量時，往往使用離心沉降法。

(2)離心前檢查：

①取出所有套管，起動空載的離心機，看是否轉(zhuǎn)動平穩(wěn)。

②檢查套管有無軟墊，是否完好，內(nèi)部有無異物。

③離心管與套管是否匹配。

(3)平衡：

將一對離心管放入套管，置于天平兩側(cè)，用滴管較輕一側(cè)的離心管與套管之間加水至兩

側(cè)平衡(離心管及其內(nèi)溶液量不能差別過大)

(4漓心：

將等重的兩管置于離心機中的對稱位置，調(diào)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)鈕，逐步增加轉(zhuǎn)速至所需值，計時，

離心結(jié)束后，將套管中的水倒凈，所有套管放回離心機中。

四、血液樣品的制備：

1.采取血液樣品的注意事項：

(1)空腹采血：

血液中很多化學(xué)成份可受飲食影響，通常需在早晨空腹或者禁食6小時以上采取血液。

(2)防止酶的分解作用：

血液內(nèi)若干化學(xué)成份在離體后繼續(xù)分解。如血糖被紅細(xì)胞糖酵解酶系統(tǒng)分解而降低；為

防止酶分解作用可用氟化鈉、碘乙酸等儲存劑，或者將血液立即制成無蛋白血濾液。

(3)防止溶血：

紅細(xì)胞與血漿中成分與含量皆有顯著的差別，因此溶血可影響一些血清或者血漿生化

檢驗的結(jié)果。為防止溶血，抽血用具務(wù)必干燥清潔，避免劇烈振搖，防止污染。

2.抗凝劑：

根據(jù)所測定血液成份不一致，標(biāo)本可應(yīng)用血清、血漿或者全血。若需血漿或者全血應(yīng)

加抗凝劑。

(1)草酸鉀為最常用的抗凝劑，0.2m8可使Ind血液不凝固。它與血液內(nèi)鈣離子形成

草酸鈣使血液不再凝固，但不能用于鉀、鈣測定。

(2)草酸鉀一草酸鏤混合劑(3：2)鏤鹽使紅細(xì)胞膨脹，鉀鹽使之皺縮，故兩者混合能保

持紅細(xì)胞體積不變。

(3)檸檬酸鹽與鈣離子混合成可溶性鈉絡(luò)合物，從而防止血液凝固。比草酸鉀較少產(chǎn)

生溶血，故用于紅細(xì)胞沉降率測定及輸血。但抗凝能力較弱，通常不作生化檢驗抗凝劑用。

(4)氟化鈉有弱抗凝作用，但能抑制糖酵解與一些水解醐類。草酸鉀-氟化鈉(3：1)、

氟化鈉-麝香草酚(10：1)是測定血糖、尿酸、肌醉、無機磷等的良好抗凝劑。

(5)肝素能抑制凝血酣原轉(zhuǎn)化為凝血防而抗凝血。抗凝能力強，0.1-0.2mg或者20

單位可使1ml血液不凝固，且較少產(chǎn)生溶血。

五、實驗預(yù)習(xí)，實驗記錄，實驗報告

1.實驗預(yù)習(xí)

實驗前應(yīng)認(rèn)真預(yù)習(xí)，弄清實驗?zāi)康?、原理、操作概要、各步操作的意義及注意事項。

2.實驗記錄

準(zhǔn)備一個記錄本，在實驗時記錄實驗現(xiàn)象、實驗結(jié)果與實驗數(shù)據(jù)。

3.實驗報告

每個同學(xué)均應(yīng)準(zhǔn)備一個練習(xí)本，以備實驗結(jié)束后及時整理與總結(jié)實驗結(jié)果，寫出實驗

報告：實驗報告應(yīng)包含下列項目：

⑴實驗名稱

(2)目的與要求

（3）原理（簡述實驗的基本原理）

（4）操作（能夠使用流程圖的方式或者以表格方式表示）

（5）結(jié)果與討論描述實驗出現(xiàn)的現(xiàn)象與結(jié)果，分析它們所說明的問題，探討實驗成敗

的關(guān)鍵。闡述對實驗設(shè)計的改進意見等。關(guān)于定量實驗列出算式進行計算并對實驗結(jié)果進行

必要的說明與分析。

（6）思考題

（徐洪）

第二章生物化學(xué)實驗常用方法

第一節(jié)分光光度法

光線的本質(zhì)是一種電磁波，有與電磁波與X線類同的性質(zhì)。光線有不一致的波長,

肉眼可見彩色光稱之可見光，波長范圍在400—750nm,小于400nm的光線稱之紫外線，大

于750nm的光線稱之紅外線。如圖所示（表2—1）

表2-1光波波長與區(qū)帶

光波波長⑴

-10-<(cm)100A

-IO"

紫真空1000A

紫夕卜

外-2xlO-52000A

線

近紫外-4X10-54000A

噱4200A

可藍(lán)4900A

見綠5300A

光黃5900A

線橙6500A

紅7500A

近紅外-10-4

紅ip

外中紅外-IO"WfJL

線

遠(yuǎn)紅外-10-2100g

當(dāng)光線通過透明溶液介質(zhì)時，其幅射能量有部分被溶液汲取，一部分透過，因此光線

射出溶液介質(zhì)之后光能被減少。對溶液來說，溶液呈現(xiàn)不一致的顏色，是由于溶液中的質(zhì)點

（分子或者離子）選擇性地汲取某種顏色的光所引起的。假如各類顏色的透過程度相同，這種

物質(zhì)就是無色透明的，若只讓一部分波長的光透過，其它波長的光被汲取，則溶液就呈現(xiàn)出

透過光的顏色，并與被汲取的光的顏色完全互補。任何一種溶液，對不一致波長的光的汲取

程度是不相等的，一些有色物質(zhì)能夠選擇性地汲取一部分可見光區(qū)的光的能量而呈現(xiàn)不一致

顏色，一些物質(zhì)卻能特征性地選擇汲取紫外線的能量。物質(zhì)汲取由光源發(fā)出的某些波長的光

可形成特定的汲取光譜。由于物質(zhì)的汲取光譜與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且在一定條件下其

汲取程度與該物質(zhì)的濃度成正比，因此可利用物質(zhì)的特定汲取光譜對其進行定性與定量分

析。分光光度法是利用各類物質(zhì)所具有的這種汲取特征所建立起來的分析方法。

圖2-1光線通過溶液介質(zhì)示意圖

一、分光光度分析法的基本定律

勞伯一比爾定律(Lambert-Beerlaw)是討論汲取光能與溶液濃度與溶質(zhì)層厚度之間

關(guān)系的基本定律，是分光分析的理論基礎(chǔ)。

勞伯一比爾定律適用于可見光、紫外光、紅外光與均勻非散射的液體

(一)Lambert氏定律一束單色光通過透明溶液介質(zhì)時，光能被汲取一部分，被汲

取光能的量與溶液介質(zhì)厚度有一定比例關(guān)系(見圖2—1)。

logy=kL(1)

表達式為【

這里Io為入射光強度

I為通過溶液介質(zhì)后的光強度

L為溶液介質(zhì)的徑長(pathlength)

k為吸光系數(shù)(absorptioncoefficient)(g,cm1)

(-)Beer氏定律以溶液介質(zhì)濃度變化代替溶液介質(zhì)厚度的改變，光能的汲取與濃度

改變有類同的關(guān)系，即一束單色光通過溶液介質(zhì)時，光能被溶液介質(zhì)汲取一部分，汲取多少

與溶液介質(zhì)濃度有一定的比例關(guān)系。

得出下式：lOg^=kC(2)

這里C(Concentration)為溶液介質(zhì)的濃度(g?L1)

將Lambent氏定律與Beer氏定律合并，即⑴與⑵合并為3十5cL⑶

令A(yù)=log￥T=y-

*k

則A=-logT?A=kCL(4)

式中A(Absorbance)為吸光度

T(Transmittance)為透光度

(4)式也可表達為A=eCb(5)

式中￡(epsilon)稱之摩爾吸光率(Molarabsorptivity)(mol/L"cm")

C(concentration)濃度(mol/L)

b(pathlength)溶液樣品的長度cm(或者比色皿內(nèi)徑長cm)

(5)式為lambert-Beer定律的物理表示式，其含義為一束單色光通過溶液介質(zhì)后，

光能被汲取一部分，汲取多少與溶液的濃度與厚度成正比。此式為分光分析法的基本計算式。

假如實驗中溶液厚度b=lcm則A=eC

透光度與溶液濃度的關(guān)系透光度與溶液濃度的關(guān)系吸光度與溶液濃度的關(guān)系

(方格坐標(biāo)紙)(半對數(shù)坐標(biāo)紙),(方格坐標(biāo)紙)

圖2-2吸光度(A)、透光度(T)和溶液濃度(C)的關(guān)系

圖2—2說明，在溶液介質(zhì)厚度一定的情況下，吸光度(A)、透光度(T)與溶液介質(zhì)濃度

(C)之間的關(guān)系。

摩爾吸光率(e)實際上是物質(zhì)在單位濃變與單位厚度下對入射光的吸光度，在一定波長

下，￡越大表示物質(zhì)對光的汲取越強。

二、定量的分光光度法分析

許多對光有汲取的物質(zhì)能夠直接用分光光度法進行定量分析：一些對光，包含紫外、

可見或者近紅外都無汲取的物質(zhì)亦可通過與某些化學(xué)試劑作用而呈色，在一定的反應(yīng)條件卜

與一定的濃度范圍內(nèi)，溶液顏色的深淺(對光汲取的程度)與該溶液中顯色物質(zhì)的濃度呈正

比。

(一)測定波長的選擇

表2-2測定波長的選擇

選用分光波長!迂刈力加詢以

選用分光波長

待測溶液顏色七田，、待測溶液顏色

范圍(nm)-范圍

)1(nm)

綠400-420紫青540-560

綠帶黃430-440藍(lán)570-600

黃440~450藍(lán)帶綠600~630

橙紅450-480綠帶藍(lán)630~760

紅490-530

—

使用分光法測定溶液中物質(zhì)的含量，首先要選擇最適單色波長，由于只有以能被溶液

汲取的光束作為入射光才能符合Lambert—Beer定律。測定有色物質(zhì)時，不一致顏色的待測

溶液，則應(yīng)選擇不一致波長的單色光束。在分光光度計上，單色光波長的選擇原則通常是使

被測溶液的單位濃度的吸光度變化最大，同時還要具有最小的空白及干擾讀數(shù)，借以獲得最

高的靈敏度與正確性。最理想的辦法是對每種物質(zhì)的測定都應(yīng)先傲它的光譜汲取曲線及有關(guān)

干擾物的汲取曲線，根據(jù)這些光譜汲取曲線來選擇最佳測定波長。表2—2可供波長選擇的

參考。

(二)利用標(biāo)準(zhǔn)管計算測定物含量

最適波長選定以后可進行溶液物質(zhì)含量的測定。通常都使用對比測定法，即以巳知精

確含量的待測物質(zhì)的溶液作為參考標(biāo)準(zhǔn)物(Cs)與未知待測樣品(Cx)用同一方法，在同一條件

下、同時進行測定，讀取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度(As)與未知含量的樣品吸光度(Ax),由于標(biāo)準(zhǔn)物

質(zhì)與未知物質(zhì)是同一物質(zhì)，其摩爾吸光率(巨)相同與進行測定用的比色皿內(nèi)徑長(b)相同即

bs=bx,根據(jù)A=￡Cb式，可得到

As=Cs換算成下式

Cx=4"Cs

Ax=Cx

式中Cs是標(biāo)準(zhǔn)管中物質(zhì)的實際含量，是標(biāo)準(zhǔn)液的濃度與實際用量的乘積；Cx是測

定管中物質(zhì)的實際含量。還應(yīng)換寫到法定單位mmol/L、mg/mlo

(三)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進行換算

配制一系列不一致濃度的標(biāo)準(zhǔn)的溶液(至少五個)按測定管同樣方法處理顯色，在選定的

波長分別測定各管的吸光度(A),以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(C)為橫坐標(biāo)，在方格

坐標(biāo)紙上作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后在同樣條件下進行測定時，測定被測溶液的吸光度，從

標(biāo)準(zhǔn)曲線上可找出相應(yīng)的濃度。

根據(jù)Lambert-Beer定律，標(biāo)準(zhǔn)液的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度呈直線關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線

是這種直線關(guān)系的描述，通常認(rèn)為，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在測定物濃度的一半到二倍之間，并使吸

光度在0.05—1.0范圍內(nèi)為宜。

還須注意：曲線制作與測定管的測定應(yīng)在同一儀器上進行，由于曲線的建立與實驗室

當(dāng)時的條件如溫度，濕度與氣壓及電壓穩(wěn)固性等有關(guān)，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線常因各類變化而需校正

或者重做。

(四)摩爾吸光率￡求取測定物濃度

當(dāng)濃度為1M/L時，溶液厚度為1cm,吸光率用e表示，在已知測定物的e,則可根

據(jù)下式求得測定物的物質(zhì)濃度。

C=-

此計算法常用于紫外汲取，如核甘酸溶液含量測定，如UTP在262nm具有最大汲取峰,

利用已知UTP在262nm時的摩爾吸光率￡,讀取待測UTP溶液吸光度A,即可求出該UTP

濃度。

二種以上被測物的混合液，也可利用不一致e進行定量測定。比如a,b兩種物質(zhì)在波

長X1時，摩爾吸光率分別為eal與ebl：,在波長入2時摩爾吸光率分別為ea2與eb2,a

與b混合的溶液在X1時吸光度為A1,在入2時的吸光度為A2(圖2—3),各自濃度分別為

Ca與Cb,則

.%=eaiCa+ebjCb

A?=eajCa+eb^Cb

解上式，得a,b兩物濃度

ebiA?-eb2Al

Ca=

際由-Eateb2

eaN-￡a2Al

Cb=

ea^bz-eaeb

21圖2-3a,b二成分混合液的吸收光譜

如有三種以上成分的混合液，也可通過三種不一致波長情況下的吸光度，以各自特有的

值，根據(jù)三元一次方程，同樣可求出未分離的三種混合物的各自濃度-'

三、物質(zhì)的定性分析

以不一致波長的單色光作為入射光，測定某一溶液的吸光度，然后以入射光的不一致

波長為橫軸，各相應(yīng)的吸光度為縱軸作圖，可得到溶液的汲取光譜曲線。汲取光譜曲線是物

質(zhì)的特征性曲線，它與分子結(jié)構(gòu)有嚴(yán)格的對應(yīng)關(guān)系故可作為定性分析的根據(jù)。不一致的物質(zhì)，

分子結(jié)構(gòu)不一致，其汲取光譜曲線也有其特殊形狀（圖2—4）。

圖2-4維生索Bi2水溶液的吸收光譜

在汲取光譜中，往往能夠找到一個或者幾個汲取最大值，該處的波長稱之最大汲取波

長（入max）。物質(zhì)不一致，它們的波長（nm）最大汲取波長也往往不一致，圖1—4為維生素

B12溶液的汲取光譜曲線。

物質(zhì)用分光分析定性要緊根據(jù)汲取光譜存在的特征汲取。

1.比較汲取光譜曲線，在相同情況下，汲取光譜曲線不一致，說明物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不

一致，由于不一致的物質(zhì)有各自的特征性曲線。如ATP與GTP都屬于核甘酸，它們的溶液

在紫外光區(qū)均有汲取，但由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不很一樣，它們的汲取光譜就有差別。需要注意的是

在不一致條件（如選擇不一致溶劑）下，即使是同一物質(zhì)也可呈現(xiàn)不一致的汲取光譜。

2.比較最大的汲取波長。不一致的物質(zhì)可有不一致的最大汲取波長（kmax）。如NTP、

GTP、CTP與UTP的Amax分別為259nm、253nm、271nm與262nm。Lnlax可作為物質(zhì)定

量測定的最適波長，如今測定靈敏度最高。有些物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)相近，可產(chǎn)生相同的Amax,

但它們的汲取系數(shù)都不一致，可據(jù)此鑒別之。

3.比較吸光度比值。可根據(jù)物質(zhì)兩個或者幾個不一致波長的吸光度比值來鑒別不一致

的物質(zhì)，同時也可檢查物質(zhì)的純度。如DNA溶液kmax為260nm。在260nm的汲取度與在

280nm的汲取度比值為1.8。但溶液中混進了蛋白質(zhì)，則比值會降低（蛋白質(zhì)在280nm處有

最大汲取）。

四、常用分光光度計及使用介紹

（-）72—1型分光光度計該機光譜范圍在360—800nm（可見光區(qū)），該機靈敏度較高，

而且結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，可用于有色物質(zhì)溶液的測定。

1.72—1型分光光度計光路圖與外形圖

1.波長選擇鈕2.“0”電位鈕3.“100”電位鈕4.比色杯拉桿5.靈敏選擇鈕6.電

源開關(guān)7.電源指示燈8.暗箱蓋9.讀數(shù)表10.波長讀數(shù)窗

2.使用方法

(1)接通電源,打開機器開關(guān)，打開箱蓋，預(yù)熱10分鐘，

(2)將空白液或?qū)φ找?往往是溶解測定物質(zhì)的溶劑)及測定液分別裝入比色杯(3/4體

積并用軟紙擦清外壁,放入樣品室內(nèi)。

(3)調(diào)節(jié)電流計上零點調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤上指針的吸光度為8或透光率為0,調(diào)節(jié)測定

所用波長。

(4)蓋上箱蓋,光徑開關(guān)自動打開。轉(zhuǎn)動光量調(diào)節(jié)器使空白對照管的吸光度為0,或透

光率為100%,待讀數(shù)指針穩(wěn)定后,逐步拉出樣品盒滑桿，通過讀數(shù)的指針，讀取測定管上的

吸光度。

有時需調(diào)節(jié)靈敏度開關(guān),才能正確讀得吸光度。此時應(yīng)重新轉(zhuǎn)動零點調(diào)節(jié)器至吸光度

為8。

(5)讀數(shù)完畢,打開儀器蓋板，關(guān)閉開關(guān),將比色杯沖洗干凈。

(二)72-2型分光光度計該機光度范圍在360~800nm,特用單光束、衍射光柵光學(xué)

系統(tǒng)，靈敏度高。

1.72-2型分光光度計光路圖和外形圖

對

銅

數(shù)

燈

放

電寸示，

大

源

“

U3

隈1

1.數(shù)字顯示器2.消光零旋鈕3.選擇開關(guān)4.吸光度調(diào)斜率電位器5.濃度旋鈕

6.光源室7.電源開關(guān)8.波長手輪9.波長刻度窗10.試樣架拉手11.100%

T旋鈕12.0%T旋鈕13.靈敏度調(diào)節(jié)旋鈕14.干燥器

2.使用方法；

(1)開啟電源，指示燈亮，選擇開關(guān)置于“T”，波長調(diào)置測試用波長。儀器預(yù)熱20分鐘。

(2)打開試樣室蓋(光門自動關(guān)閉)。調(diào)節(jié)“0”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”蓋上試樣室

蓋，將比色皿架處于蒸儲水校正位置，使光電管受光，調(diào)節(jié)透光率“100%”旋鈕，使數(shù)字

顯示為“100.0”。

(3)將選擇開關(guān)置于“A”。調(diào)節(jié)消光零旋鈕，使得數(shù)字顯示為“.000”，然后將被測樣

品移入光路，顯示值即為被測樣品的吸光度的值。

(4)假如大幅度改變測試波長時，在調(diào)整“0”與“100%”后稍等片刻，(因光能量變化

急劇，光電管受光后響應(yīng)緩慢，需一段光響應(yīng)平衡時間)，當(dāng)穩(wěn)固后，重新調(diào)整“0”與100%

即可工作。

(5)每臺儀器所配套的比色皿，不能與其它儀器上的比色皿單個調(diào)換。

(6)換一波長測試時，應(yīng)將選擇開關(guān)置“T”，重復(fù)(2)與(3)操作。

(7)測試完畢，關(guān)閉開關(guān)，電源，將比色皿沖洗干凈。

(三)UV-75—4型紫外分光光度計

1.UV—754紫外分光光度計光路圖：

W洸鏡

光Si

由光源發(fā)出的連續(xù)輻射光線，經(jīng)濾光片與球面反射鏡至單色器入射狹縫處聚焦成像，

光束通過入射狹縫，經(jīng)平面反射鏡到準(zhǔn)直鏡，產(chǎn)生平行光射至光柵。在光柵上色散后，又經(jīng)

準(zhǔn)直鏡聚焦在出射狹縫上成一連續(xù)光譜，由出射狹縫射出——定波長的單色光，通過標(biāo)準(zhǔn)溶

液再照射到光電管上。

光源切換與波長移動相對應(yīng)'

200nm-290nm需點亮笊燈

290nm—360nm需同時點亮氣燈與鴇燈

360nm-850nm需點亮鴇燈

單色器使用自準(zhǔn)式系統(tǒng)，衍射光柵使用該廠自制1200條/nm的復(fù)制閃躍光柵

2.測試準(zhǔn)備

(1)打開電源開關(guān)之前，檢查一下測試樣品室。

(2)試樣槽置“參考”位置。

(3)打開電源開關(guān)。

假如波長工作在200nm—300nm時需按笊燈觸發(fā)按鈕。

(4)顯示器顯示"754”后，數(shù)顯為“100.0”，則說明儀器已通過自檢程序。如今按A/

C鍵，儀器自動進入“0.000”吸光值狀態(tài)，測試“連續(xù)”及“自動”打印狀態(tài)；

(5)儀器預(yù)熱三十分鐘。

3.測試

(1)數(shù)顯“0.000”穩(wěn)固后，即可把試樣槽置于“樣品”位置進行測試(即拉一下樣品室滑

桿)。待第一個數(shù)據(jù)自動打印完畢后，再可將試樣槽置于第二個“樣品”位置測試(即再拉一

下樣品室滑桿).

(2)每當(dāng)需要調(diào)換波長時，務(wù)必把試樣槽置于“參考”位置，重新調(diào)零，現(xiàn)將測試操作

順序如下：

測試開始

試樣槽置“參考”位置

I

調(diào)/長置所需波長

VI

顯示器顯示0.000(A)

或i100.0(T)

I

?

I

拉動滑桿，試樣槽置“樣品”位置

讀的自動送出打印測定值

重看

注意：樣品號超過99號，打印數(shù)復(fù)位至00繼續(xù)計數(shù)下去。

(四)分光光度計與紫外分光光度計使用注意事項

1.光度計的光電管或者光電池對不一致濃度的光敏度不一樣，應(yīng)注意每換一次波長，

即應(yīng)將空白溶液的吸光度調(diào)整到0。

2.溶液定量測定，應(yīng)注意吸光度在0.05-1.0范圍，濃度太大時應(yīng)該適當(dāng)稀釋。

3.通常靈敏度旋鈕調(diào)置“1”檔，因其放大倍率最小，較穩(wěn)固。

(五)雙波長分光光度計

為了消除背景汲取的影響，提高測定的精確度，可使用雙波長分光光度法，儀器圖示

如下：

圖2-5雙波長分光光度計光路圖

由圖2—5可見，從光源發(fā)出的光分成兩束，分別通過各自的單色器后，分出具有任意

波長入1與A2的兩束單色光，由切光器(斬波器或者稱扇面鏡)調(diào)制入1與入2,以一定間隔交

替照射裝有供試品溶液的比色皿，然后測量與記錄它們之間汲取度的差值。

雙波長分光光度法是通過選擇二個適當(dāng)?shù)牟ㄩL通過斬波器或者扇面鏡，使兩個波長分

別交替在照射于同一供試品液，測量二個波長處的汲取度之差△A(AA=A'2—AA1),來

消除不有關(guān)汲取的方法。

雙波長分光光度法由于使用一個比色皿與兩道不一致波長的光束進行測量，因而不用

參比比色皿，而只用一個比色皿進行測量，因此能避免由于比色皿及樣品溶液與參比溶液之

間的差別等因素所引起的誤差，從而可提高測定的精確度。

(六)熒光分光光度計

1.熒光分光光度計種類很多，通常均由激發(fā)光源、激發(fā)單色器、樣品皿與檢測器四部

分構(gòu)成。

(1)光源要緊用于激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生激發(fā)光，通常有汞燈與敬弧燈。對光源的要求是

能夠產(chǎn)生高強度的，不隨波長變化的連續(xù)的光譜。汞燈提供線性光譜，由于光強度隨波長有

很大的變化，作為激發(fā)光源有一定的局限性，僅適用于濾光片的熒光計的光源，沉弧燈內(nèi)有

氫氣，通電后債氣電離，同時產(chǎn)生很強的光源，并提供250—600nm的連續(xù)光譜，最高峰值

在470nm,適用于記錄光譜圖。

(2)單色器使用濾色片作單色器的光電熒光計通常有兩個濾光片。處于光源與樣品池

之間的單色器叫激發(fā)單色器；用于選定不一致的激發(fā)波長，滿足不一致溶液的需要。處于樣

品池與檢測器之間的單色器叫發(fā)射濾光片，用于濾去樣品池里物質(zhì)受激發(fā)后所產(chǎn)生的不一致

波長的可見光。

若用濾光片代替兩個單色器，這樣的儀器稱之熒光光度計或者光電熒光計，這類儀器

盡管結(jié)構(gòu)簡單，價格低廉，但是靈敏度低特異性差。若使用棱鏡或者光柵作單色器，這類儀

器稱之熒光分光光度計，但是光柵色散后譜線的波長讀數(shù)是線性的，同時分辨率相同時，光

柵色散后得到譜線強度高于棱鏡，靈敏度高。

(3)樣品皿大多由石英制成，某些儀器為了測定低溫?zé)晒猓谑⒚蟮耐庵芴咨弦粋€

裝有液氮的透明石英真空瓶以降低溫度。

(4)檢測器大多數(shù)熒光分光光度計使用光電倍增管作檢測器。以后的信號處理與顯示

部件與通常的可見分光計類同。

2.熒光分析的應(yīng)用

分子熒光光譜具有靈敏度高、選擇好、操作快速等優(yōu)點?？蛇m用于生物體內(nèi)微量的有

機物與體內(nèi)代謝產(chǎn)物的監(jiān)測與定量。

無機物很少能發(fā)出熒光，無機物的熒光分析依靠于待測元素與有機物形成配合物，具

有熒光的配合物可用于熒光分析，能進行熒光分析的元素現(xiàn)已達幾十種。

此外熒光光譜法還有測定葡萄糖、膽紅素、葉膽原、膽汁酸與某些激素，甚至還可借

助于酶的人工底物產(chǎn)生的熒光測定酶的活性。

(程楓)

第二節(jié)電泳法

帶電粒子在電場中向與自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象稱之電泳(Electrophoresis),電

泳技術(shù)是生物化學(xué)與分于生物學(xué)中的重要研究方法之一。利用電泳技術(shù)可分離許多生物物

質(zhì)，包含氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、脂類、核甘、核甘酸及核酸等，并可用于分析物質(zhì)的純度

與分子量的測定等。

電泳按介質(zhì)狀想來分，有自由電泳與區(qū)帶電泳兩大類。前者以溶液為介質(zhì)，在溶液中

將蛋白質(zhì)分離開來。兩者相比較，自由電泳過程中擴散嚴(yán)重，分辨率有限，而且設(shè)備昂貴，

操作繁瑣，現(xiàn)在已基本上被區(qū)帶電泳法所取代。所謂區(qū)帶電泳法，就是在固體支持物上所進

行的電泳。50年代以來，常用的固體支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、淀粉凝膠、瓊脂糖凝

膠與聚丙烯酰胺凝膠等等。區(qū)帶電泳法分辨率很高，而且設(shè)備簡單，操作方便，已經(jīng)是生物

化學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域中極為有用的技術(shù)。

一、電泳法的基本原理

在酸性溶液中，蛋白質(zhì)分子帶正電，而在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電。但是這并

不是實際的電動單位，從物理化學(xué)的原理來分析，帶電分子的周圍由相反電荷的離子形成擴

散雙電層，它由緊密層與擴散層兩部分構(gòu)成。緊密層中相反電荷的離子被束縛在大分子周圍,

它在電場中是隨大分于一起泳動的，而擴散層中相反電荷的離子盡管也受到大分子的靜電引

力，但在電場中卻會向另一極移動。緊密層表面相關(guān)于溶液本體的電位差稱之為電動電位即

C(Zeta)電位，由它決定了蛋白質(zhì)分子在電場中的運動速度。

蛋白質(zhì)泳動分子在電場中受到電動力F的驅(qū)動，其大小等于凈電荷Q與電場強度E的

乘積：

F=QE

假如假設(shè)泳動分于為球體，它在電場中泳動時也受到一定的阻力F',按Stoke定律，

其大小與球體半徑r,介質(zhì)粒度刁與泳動速度成正比：

F'=63TrnV

當(dāng)恒速泳動時，電動力F與阻力F'相等，即QE=6“rnv

帶電粒子在單位電場強度下的泳動速度，稱之遷移率（mobility）或者泳動度，以U表示,

即："-五

Q

因此步6ml

可見，一個帶電粒子的遷移率不僅取決于其本身所帶的電荷，還與帶電粒子的大小、

介質(zhì)的粘度等多種因素有關(guān)。在具體實驗中，

_v_t_dl

“Equt

T

式中：v為粒子的泳動速度（厘米/秒或者分），E為電場強度或者電勢梯度（伏/厘米）,

d為粒子移動距離（厘米）,1為支持物的有效長度（厘米）,u為加在支持物兩端的實際電壓（伏）,

1為通電時間（秒或者分）。故遷移率（或者泳動度）的單位為厘米2?秒”?伏特L

假設(shè)物質(zhì)1與物質(zhì)2在同一電場中移動距離分別為：

dl=.辛

也=心?辛（V為電壓）

通過時間t之后，兩物質(zhì)（帶電粒于）移動的距離之差力：

△代=dl-d2=（jul—p（2）,辛

這就是說，物質(zhì)1與2能否分離開來，取決于兩者的遷移率。若它們的遷移率相同則

不能分離，有差別才能分離，差別越大，分離越好。當(dāng)然，也與其它實驗條件有關(guān)。

二、影響電泳的因素

電泳結(jié)果可受到多種因素的影響，但通常認(rèn)為下列4個方面更為重要。

（一）電泳介質(zhì)的pH

當(dāng)氨基酸為被分離物質(zhì)時，各類氨基酸有不一致的等電點，當(dāng)介質(zhì)的pH等于某氨基酸

的等電點時.，則該氨基酸處于等電狀態(tài)，即不向正極或者負(fù)極移動，當(dāng)介質(zhì)pH小于等電點

時，氨基酸呈陽離子狀態(tài)、向負(fù)極移動，反之當(dāng)介質(zhì)pH大于等電點時，氨基酸呈陰離子狀

態(tài)，向正極移動。當(dāng)20種氨基酸的混合物置于pH5.5左右的介質(zhì)中電泳時，能夠?qū)⑺鼈?/p>

分離為三組。蛋白質(zhì)由氨基酸構(gòu)成，也具有兩性電離性質(zhì)，因此介質(zhì)的pH值也影響蛋白質(zhì)

的電離情況，即決定蛋白質(zhì)的帶電量（Q）。為了保持介質(zhì)pH的穩(wěn)固性，常用一定pH的緩沖

液，如分離血清蛋白質(zhì)常用pH8.6的巴比妥緩沖液或者三羥甲基氨基甲烷（Tris）緩沖液。

（二）緩沖液的離子強度

離子強度假如過低緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定；離子強度過高，則降低蛋

白質(zhì)的帶電量（壓縮雙電層降低Zeta電勢），使電泳速度減慢，因此常用離子強度為0.02-

0.2之間。溶液中離子強度的計算方法如下：

1=jSCiZi2

6=離子的摩爾濃度

Zi=離子的價數(shù)

例1,兩個單價離子化合物（如NaCl）的離子強度等于它的摩爾濃度，如0.154mol/L

NaCI溶液的離子強度

1=j(0.154xp+0.154x12)=0.154

例2,兩個兩介離子化合物（如ZnSO4）的離子強度等于它的摩爾濃度的4倍，如0.Imol

/LZnS04溶液的離子強度

1=J（0.1X22+0.1X22）=0.4

由上述例子中能夠看出多價離子會使離子強度增高，因此電泳緩沖液常用單價離子的

化合物配制。

（三）電場強度

實驗所用電場強度對移動距離起正比作用。電場強度以每一厘米的電勢差計算，也稱

電勢梯度。以濾紙電泳為例，濾紙長15厘米，西端電勢差為150伏特，則電場強度為10

伏特/厘米。電場強度愈高，則帶電粒子的移動愈快。但電壓愈高，電流也隨之增高，產(chǎn)生

的熱量也增加。因此在高壓電泳（電場強度大于50伏特/厘米）常需加用冷卻裝置，否則熱

量可引起蛋白質(zhì)等物質(zhì)的變性而不能分離，還因發(fā)熱引起緩沖液中水分蒸發(fā)過多，使支持物

（濾紙、薄膜或者凝膠等）上離于強度增加，與引起虹吸現(xiàn)象（電泳缸內(nèi)液體被吸到支持物上）

等，都會影響物質(zhì)的分離。

（四）電滲

的

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圖2-6,電滲示意圖

在電場中,液體關(guān)于固體的固定相的相對移動，稱之電滲（圖2-6）。如濾紙中含有羥

基而帶負(fù)電荷,與紙相接觸的水溶液帶正電荷，液體便向負(fù)極移動。由于電滲現(xiàn)象往往與電

泳同時存在，因此帶電粒子的移動距離也受電滲影響，如電泳方向與電滲相反，則實際電泳

的距離等于電泳距離減去電滲的距離。如方向相同，則實際電泳距離等于電泳距離加上電滲

的距離。瓊脂中含有瓊脂果膠（agaropetin）,其中含有較多的硫酸根，因此在瓊脂電泳時電滲

現(xiàn)象很明顯，許多球蛋白均向負(fù)極移動。除去了瓊脂果膠后的瓊脂糖用作凝膠電泳時，電滲

大為減弱。電滲所造成的移動距離可用不帶電的有色染料或者有色葡聚糖點在支持物的中

心，以觀察電滲的方向與距離。

三、區(qū)帶電泳的分類

區(qū)帶電泳的形式繁多，分類比較困難，僅按某一特點分類大概都不全面。這里基于支

持物的物理性狀、裝置形式、pH值的連續(xù)性等不一致，可分為：

（一）按支持物的物理性狀不一致，區(qū)帶電泳可分為

1.濾紙及其他纖維（如醋酸纖維紗、玻璃纖維、聚氯乙烯纖維）薄膜電泳。

2.粉末電泳，如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳。

3.凝膠電泳，如瓊脂、瓊脂糖、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳。

4.絲線電泳，如尼龍絲、人造絲電泳。

（二）按支持物的裝置形式不一致，區(qū)帶電泳可分為

1.平板式電泳，支持物水平放置，是最常用的電泳方式。

2.垂直板式電泳，板狀支持物，在電泳時，按垂直方向進行，聚丙烯酰胺凝膠常做成

垂直板式電泳。

3.連續(xù)液動電泳，首先應(yīng)用于紙電泳，將濾紙垂直豎立，兩邊各放一電極，溶液自頂

端向下流，與電泳方向垂直，以后有用淀粉、纖維素粉、玻璃粉等代替濾紙分離血清蛋白質(zhì)，

分離量較大。

4.圓盤電泳（discelectrophoresis）o電泳支持物灌制在兩通的玻璃管中，被分離的物質(zhì)

在其中泳動后，區(qū)帶呈圓盤狀。

假如用石英玻璃制成內(nèi)徑為25或者50um、長50—100cm的管狀，則成為目前認(rèn)為比

較先進的毛細(xì)管電泳技術(shù)，若管中注入聚丙烯酰胺凝膠（特殊技術(shù)），也是區(qū)帶電泳的一種。

它集電泳與分析檢測系統(tǒng)于一身。因管細(xì)、散熱快，電壓可達2-3萬伏，故具有量微、快速、

重復(fù)性好、分辨率高及可自動化等優(yōu)點，但價格很高。

（三）按pH的連續(xù)性不一致，區(qū)帶電泳可分為

1.連續(xù)pH電泳，即整個電泳過程中pH保持不變，常用的紙電泳，醋酸纖維薄膜電泳

等屬于此類。

2.非連續(xù)pH電泳，緩沖液與電泳支持物間有不一致的pH,如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電

泳分離血清蛋白質(zhì)經(jīng)常用這種形式，它的優(yōu)點易在不一致pH區(qū)之間形成高的電位梯度區(qū)，

使蛋白質(zhì)移動加速壓縮為一極狹的區(qū)帶而達到濃縮的作用。但聚丙烯酰胺凝膠電泳分離核酸

則采取連續(xù)pH裝置。

近年來發(fā)明的等電聚焦電泳（Electrofocusing）可稱之非連續(xù)pH電泳，它利用人工合成的

兩性電解質(zhì)（商品名ampholin,一類脂肪族多胺基多竣基化合物）在通電后形成一定的pH梯

度。被分離的蛋白質(zhì)停留在各自的等電點而形成分離的區(qū)帶，電極兩端，一端是酸，另一端

是堿。

等速電泳Isotachophoresis）也是屬于非連續(xù)pH電泳，它的原理是將分離物質(zhì)夾在先行

離子與隨后離子之間，通電后被分主物質(zhì)的電泳速度相同，因此叫等速電泳。近年發(fā)明的塑

料細(xì)管等速電泳儀，能夠進行毫微克量物質(zhì)的分離，該儀器使用數(shù)千伏的高電壓，幾分鐘內(nèi)

即完成分離，用自動記錄儀進行檢測，它的出現(xiàn)是電泳技術(shù)的革新。

四、電泳技術(shù)的應(yīng)用

電泳技術(shù)要緊用于分離各類有機物（如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶、脂類、核昔、核昔

酸、核酸等）與無機鹽。也可用于分析某種物質(zhì)純度，還可用于分子量的測定。電泳技術(shù)與

其他分離技術(shù)（如層析法）結(jié)合，可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析，“指紋法”就是電泳法與層析法

的結(jié)合產(chǎn)物。用免疫原理測試電泳結(jié)果。提高了對蛋白質(zhì)的鑒別能力。電泳與酶學(xué)技術(shù)結(jié)合

發(fā)現(xiàn)了同功能，關(guān)于酶的催化與調(diào)節(jié)功能有了更深入的熟悉，因此電泳技術(shù)是醫(yī)學(xué)科學(xué)中的

重要研究技術(shù)。

下面介紹幾個在生化實驗工作中常用的電泳技術(shù)。

（一）紙電泳：是以濾紙為支持物來進行電泳，它常與其它層析方法配合使用，以提高分

析效果，紙電泳通常用于物質(zhì)分離分析、測定等電點、鑒別顆粒電荷的符號與推斷樣品的純

度等方面。

由于紙電泳具有設(shè)備簡單，化費少與操作方便等優(yōu)點，因此目前仍為實驗室常用電泳

技術(shù)之一。然而，紙電泳所用濾紙有較大的吸附力與電滲作用，使樣品顆粒泳動易受影響，

因此不適用于進行測定遷移率。

（二）醋酸纖維素膜電泳。醋酸纖維素是Kohn（1975）首先用于區(qū)帶電泳，它是由高純度的

醋酸纖維素制成的一種細(xì)密而又薄的微孔膜。醋酸纖維素膜電泳的原理基本上與紙電泳原理

相同，但由于作為支持物的醋酸纖維素膜對樣品的吸附性較濾紙小得多，因此，少量的樣品，

甚至大分子物質(zhì)都能得以較高的分辨率。又由于醋酸纖維素親水性較小，故而電滲作用較紙

小，同時它所容納的緩沖液也較少，因此電泳的大部分由樣品傳導(dǎo)，能夠加速樣品分離，大

大節(jié)約電泳時間。

盡管醋酸纖維素膜電泳的分辨能力比聚丙烯酰胺凝膠電泳與淀粉膠電泳等要低,但它具

有簡單、快速、定量容易等優(yōu)點，特別較紙電泳分辨力強、區(qū)帶清晰、靈敏度高與便于儲存、

照相等，因此醋酸纖維素膜電泳已取代紙電泳而被廣泛應(yīng)用于科學(xué)實驗、生化產(chǎn)品分析與臨

床化驗，如血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白'、同工酶等的分離分析，也用于免疫電泳層析技

術(shù)上。

（三）瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳是一種以瓊脂糖凝膠為支持物的凝膠電泳，其分析原理與

其它支持物電泳的最要緊區(qū)別是：它兼有“分子篩”與“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具

有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，直接參與帶電顆粒的分離過程，在電泳中，物質(zhì)分子通過空隙時會受到阻力，

大分子物質(zhì)在泳動時受到的阻力比小分子大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅依靠

于凈電荷的性質(zhì)與數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大地提高了分辨能力。

瓊脂糖凝膠通常制成板狀，凝膠濃度以0.8—1%為宜，由于此濃度制成的凝膠富有彈

性，牢固而不脆，但是在制備過程中應(yīng)避免長時間加熱。

電泳緩沖液的pH多在6-9之間，離子強度最適為0.02-0.05。離子強度過高時，將

有大量電流通過凝膠，使凝膠中水份大量蒸發(fā)，甚至造成凝膠干裂，電泳中應(yīng)加以避免。

由于瓊脂糖電泳具有較高分辨率、重復(fù)性好，區(qū)帶易染色、洗脫與定量與干膜能夠長期

儲存等優(yōu)點，因此常用于大分于物質(zhì)如蛋白費等的分離分析；與免疫化學(xué)反應(yīng)相結(jié)合進展成

為免疫電泳技術(shù)，用于分離與檢測抗原。若對目前常用的瓊脂糖進行某些修飾，如引入化學(xué)

基團羥乙基，則可使瓊脂糖在6512左右便能熔化，被稱之低熔點瓊脂糖。該溫度低于DNA

的熔點，而且凝膠強度又無明顯改變。以此為支持物進行電泳，稱之低熔點瓊脂糖凝膠電泳，

要緊用于DNA研究。如在分子生物學(xué)實驗中，用來回收或者制備DNA。

表2-3瓊脂糖凝膠濃度與適宜分離的核酸大小

膠濃度（％）核酚分子大?。ê宋羲釘?shù)）

Agarose0.35~60kb

0.61~20kb

0.70.8?10kb

0.90.5~7kb

1.20.4~6kb

1.50.2?4kb

2.00.1~3kb

（四）聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegeldectrophoresis,PAGE）

聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，具有機械強度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)固性

高、無電滲作用、設(shè)備簡單、樣品量小（1—100微克）、分辨率高等優(yōu)點，并可通過操縱單體

濃度或者單體與交聯(lián)劑的比例聚合成不一致大小孔徑的凝膠，可用于蛋白質(zhì)，核酸等分子大

小不一致的物質(zhì)的分離、定性與定量分析。還可結(jié)合解離劑十二烷基硫酸鈉（SDS）,以測定

蛋白質(zhì)亞基分子量。

聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理

1.丙烯酰胺的聚合聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（Act）與交聯(lián)劑甲撐雙烯酰胺（Bis）在

催化劑作用下，通過聚合交聯(lián)形成含有親水性酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，相鄰的西個鏈通過

甲撐橋交鏈起來的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。

2.聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小決定凝膠孔徑的大小要緊是凝膠的濃度，比如7.5%

的凝膠孔徑平均為50A,30%的為20A左右。但交聯(lián)劑對電泳泳動率亦有影響，交聯(lián)劑重

量對總單體重量的百分比愈大，則電泳泳動率愈小。不管交聯(lián)劑是以何種方式影響電泳時的

泳動率，總之它是影響凝膠孔徑很重要的一個參數(shù)，為了使試驗的重復(fù)性較高，在制備凝膠

時對交聯(lián)劑的濃度、交聯(lián)劑與丙烯酰胺的比例、催化劑的濃度、聚膠所需時間這些影響泳動

率的因子都應(yīng)盡可能保持恒定。

ooo

III

CHi-CH-C-NHj?CHi-CH—C-NH-CHi-NH-C-CH-CHi

(Acr)(Bin)

|

CH,'

圖2-7聚丙烯酰胺凝膠的形成

要想將一個蛋白質(zhì)或者核酸之類的大分子混合物很好地分開，并在膠柱上形成明顯的

帶，選擇一定孔徑的凝膠是很關(guān)鍵的。有用中，常按樣品的分子量大小來選擇適宜的凝膠孔

徑。

表2-4聚丙烯酰胺濃度與適宜分離的蛋白質(zhì)與核酸大小

分子量范圍凝膠濃度％

蛋白質(zhì)

<10,00020—30

10,000—40,00015-20

40,000—100,00010-15

100,000—500,0005—10

>500,0002—5

核酸

<10,00015—20

10,000—100,0005—10

100,000—2,000,0002—2.6

3,緩沖系統(tǒng)目前常用的分離膠緩沖系統(tǒng)有三大類：高pH(pH9左右)、低2H(pH4左

右)與中性。選擇的pH應(yīng)使蛋白質(zhì)分子處于最大電荷狀態(tài)，使樣品中各類蛋白質(zhì)分子表現(xiàn)

出泳動率的差別最大。酸性蛋白質(zhì)在高pH條件下，堿性蛋白質(zhì)在低pH條件下常得到較好

的解離，電泳分離效果較好。假若蛋白質(zhì)樣品經(jīng)電泳后還希望保留生物活性，則pH值不應(yīng)

過大或者過小〈大于9或者小于4)?

在考慮離子種類與離子強度時，原則上只要有導(dǎo)電離子存在的任何溶劑就能用于電泳，

但要避免因離子種類與離子強度選擇不當(dāng)使樣品中各蛋白質(zhì)分于之間相互作用而造成人為

假象。常選用0.01—0.Imo"L低離子強度的緩沖液。離子強度低，從而電導(dǎo)低，低電

導(dǎo)能產(chǎn)生高電壓梯度，電泳分離過程短，產(chǎn)生熱量較小，分離效果好。

4.聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳這里要緊簡單介紹不連續(xù)盤狀電泳的基本原理。

不連續(xù)盤狀電泳有較高的分辨力，這里因力有三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)，在樣品膠與濃縮

膠中進行(如不用樣品膠，則在濃縮膠中進行)；電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)在分離膠中進行。

(1)濃縮效應(yīng)：管中置三種不一致的凝膠層，即上層為樣品膠，第二層為濃縮膠，這兩

層均為大孔膠、Tris-HCl緩沖液、pH值6.7,第三層為分離膠，該層為小孔膠、Tris—HC1

緩沖液、pH值8.9o在上下兩電泳槽中充以Tris一甘氨酸緩沖液，pH值8.3。這樣造成

凝膠孔徑、pH值、緩沖液的不連續(xù)性。在此條件下，HC1幾乎全部電離為C1-,甘氨酸有

極少部分的分子解離成NH2cH2co0-,通常酸性蛋白質(zhì)也能解離帶負(fù)電荷。當(dāng)電泳系統(tǒng)通

電后.這三種離子都向正極移動，根據(jù)有效泳動率的大小，最快的稱之快離于或者先行離子

(這里是C1-),最慢的稱之慢離子或者隨后離子(這里是NH2cH2co0-)。電泳開始后，快離

子在前，在它的后邊形成一離子濃度低的區(qū)域即低電導(dǎo)區(qū)。電導(dǎo)與電壓梯度成