GB-T豬牛羊體細胞克隆技術(shù)規(guī)范征求意見稿

ICS07.080

B20/39

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—2018

豬牛羊體細胞克隆技術(shù)規(guī)范

Technicalspecificationforsomaticcellcloningofpig,cattleand

sheep&goat

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局

發(fā)布

中國國家標(biāo)準(zhǔn)1化管理委員會

GB/T××××—201×

I

GB/T××××—201×

豬牛羊體細胞克隆技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬、牛、羊三種動物體細胞克隆技術(shù)的基本要求、清洗與消毒、體細胞克隆操作流程和

操作步驟等內(nèi)容。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬、牛、羊三種動物的體細胞克隆技術(shù)操作。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T24863畜禽細胞體外培養(yǎng)與冷凍保存技術(shù)規(guī)程

GB/T25881牛胚胎

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

體細胞克隆somaticcellcloning

體細胞核移植somaticcellnucleartransfer

將一個個體的體細胞(核供體細胞)移植到去核的卵母細胞（受體細胞）中，最終產(chǎn)生一個與核供體細

胞個體遺傳物質(zhì)一致的重構(gòu)胚的操作技術(shù)。

3.2

去核enucleation

去掉卵母細胞細胞核的操作過程。

3.3

移核injectionofdonorcells

將體細胞注射到去核卵母細胞卵周隙的操作過程。

3.6

重構(gòu)胚reconstructedembryo

去核移核后的卵母細胞，經(jīng)過融合操作后，體細胞融入卵母細胞的個體。

4縮略語

本標(biāo)準(zhǔn)涉及的縮略語見表1。

1

GB/T××××—201×

表1縮略語表

縮略語英文全稱中文全稱

COCsCumulus-oocytecomplexes卵母細胞與卵丘細胞復(fù)合體

DPBSDulbecco'sPhosphate-BufferedSaline杜氏磷酸緩沖溶液

EGFEpidermalgrowthfactor表皮生長因子

LHLuteinizinghormone促黃體激素

FSHFolliclestimulatinghormone促卵泡激素

mSOFaaModifiedsyntheticoviductfluidsupplementedwith添加氨基酸的改良型合成輸卵

aminoacids管液

PFFPorcinefollicularfluid豬卵泡液

PZM-5Porcinezygotemedium-5豬合子培養(yǎng)液-5

6-DMAP6-(Dimethylamino)purine6-(二甲氨基)嘌呤

5基本要求

5.1工作區(qū)條件

應(yīng)符合GB/T24863的要求。

5.2設(shè)備

倒置顯微鏡、顯微操作系統(tǒng)、電融合儀、體視顯微鏡、拉針儀、鍛針儀、磨針儀、CO2培養(yǎng)箱、超純

水裝置、熱臺等。

6清洗與消毒

應(yīng)符合GB/T24863的要求。

7體細胞克隆技術(shù)流程

見圖1。

2

GB/T××××—201×

圖1體細胞克隆技術(shù)流程

8豬體細胞克隆操作步驟

8.1豬卵母細胞采集

8.1.1采集前準(zhǔn)備

配制適量豬卵母細胞成熟培養(yǎng)液（參見附錄A），取其中部分添加半胱氨酸、EGF、LH、FSH以及PFF，

配制成完全的卵母細胞成熟培養(yǎng)液。取培養(yǎng)盤，每孔加入適量完全的卵母細胞成熟培養(yǎng)液，覆蓋礦物油，

標(biāo)記日期及編號。完全的卵母細胞成熟培養(yǎng)液應(yīng)該在卵巢采集當(dāng)天現(xiàn)配現(xiàn)用。成熟培養(yǎng)盤準(zhǔn)備好后，應(yīng)放

入38.5℃~39.0℃細胞培養(yǎng)箱，平衡后方可使用。生理鹽水、沖卵液、培養(yǎng)皿和顯微鏡載物臺恒溫板等應(yīng)預(yù)

熱到38.5℃~39.0℃。

8.1.2卵巢

應(yīng)挑選無囊腫，無充血，而且卵泡直徑在3mm~6mm之間的新鮮卵巢，在38.5℃~39.0℃的生理鹽水

中保溫運輸。卵巢帶回實驗室后，用生理鹽水清洗3~4次。

8.1.3卵泡

應(yīng)挑選直徑3mm~6mm，卵泡液色澤清亮，無充血、無發(fā)黑的卵泡，用抽卵法或者割卵法采集卵泡

液。將采集好的卵泡液收集到離心管中，靜置形成沉淀后棄去上清，用沖卵液（參見附錄A）洗3~4次。

8.1.4COCs

應(yīng)挑選形態(tài)規(guī)則，細胞質(zhì)均勻，而且外圍有3層以上卵丘細胞緊密包圍的COCs，在沖卵液中清洗2~3

次后，放入到按8.1.1準(zhǔn)備的卵母細胞成熟培養(yǎng)液中洗2次。

8.2豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)

3

GB/T××××—201×

將漂洗后的COCs放入8.1.1制備的培養(yǎng)盤中，在38.5℃~39.0℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)44h~46

h。

8.3豬成熟卵母細胞準(zhǔn)備

將培養(yǎng)后的卵母細胞轉(zhuǎn)移到離心管中，加入卵丘細胞消化液（參見附錄A），反復(fù)吹打脫去卵丘細胞，

然后將其轉(zhuǎn)移到含胚胎操作液（參見附錄A）的培養(yǎng)皿中，洗掉卵丘細胞。

應(yīng)選擇第一極體已經(jīng)排出，細胞膜完整，卵周隙清晰可見的卵母細胞用于去核操作。

8.4豬核供體細胞準(zhǔn)備

應(yīng)選擇大小均一，細胞形態(tài)完整且核型正確的原代體細胞，消化后用于移核。

8.5豬去核移核操作

8.5.1操作盤準(zhǔn)備

用含有細胞松弛素的胚胎操作液（參見附錄A）在培養(yǎng)皿中間制作一條長液滴條，用不含有細胞松弛

素的胚胎操作液在長液滴旁邊制作一條短液滴條。液滴條做好后，覆蓋礦物油。長液滴條用于放置卵母細

胞以及進行去核、移核操作，短液滴條用于洗針以及放置體細胞。

8.5.2去核移核操作

在顯微鏡下，利用顯微操作系統(tǒng)控制持定針和去核移核針進入卵母細胞液滴中，用持定針固定一個卵

母細胞后，用去核移核針吸除極體以及周邊部分細胞質(zhì)。去核操作完成后，將去核移核針吸取一個供核體

細胞，注射到去核卵母細胞的卵周隙中，并用去核移核針輕輕擠壓，使體細胞緊貼卵細胞膜。最后持定針

釋放卵母細胞，進行下一個卵母細胞的去核移核操作。

8.5.3清洗

將去核移核后的卵母細胞在胚胎操作液中漂洗3次，然后在卵母細胞成熟培養(yǎng)液中洗3次，記錄去核、

注核的卵母細胞數(shù)量。

8.6豬重構(gòu)胚制備

8.6.1電融合

將移核后的卵母細胞放入融合液（參見附錄A）平衡1min左右后移至融合槽內(nèi)，用撥卵針調(diào)整重構(gòu)體

位置，使體細胞與卵母細胞接觸面垂直于電流方向后進行電擊融合，電場強度為1.6kV/cm，2次直流脈沖

（脈沖間隔100μs），脈沖時長100μs。

8.6.2激活

將卵母細胞轉(zhuǎn)移到胚胎操作液中，清洗3次，再轉(zhuǎn)移至PZM-5培養(yǎng)液（參見附錄A）中漂洗3次。放至

培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h~2h左右。然后挑出細胞膜完整且體細胞已融入的個體移入到預(yù)先平衡好的輔助激活液（參

見附錄A）中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。

4

GB/T××××—201×

8.6.3培養(yǎng)

培養(yǎng)4h后，將重構(gòu)胚用預(yù)熱的PZM-5培養(yǎng)液漂洗5次，然后轉(zhuǎn)移到覆蓋有石蠟油的PZM-5液滴中，放

入培養(yǎng)箱中，在38.5℃~39℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

8.7胚胎移植

8.7.1豬體細胞克隆胚胎質(zhì)量

評定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2豬體細胞孔胚胎質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)

質(zhì)量分級評定標(biāo)準(zhǔn)

胚胎形態(tài)完整，輪廓清晰，呈球形，卵裂球大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊。胚胎細

A級胞團呈均勻?qū)ΨQ的球形，單個卵裂球（或細胞）的大小、顏色、密度一致。胚

胎的發(fā)育階段與預(yù)期的發(fā)育階段一致，透明帶光滑。

輪廓清晰，卵裂球或細胞團的大小、性狀、顏色或密度存在一定的不規(guī)則，

B級

胚胎的發(fā)育階段與預(yù)期的發(fā)育基本階段一致。

卵裂球或細胞團的大小、性狀、顏色或密度嚴重不規(guī)則，胚胎的發(fā)育階段

C級

與預(yù)期的發(fā)育階段不一致。

D級死亡或退化的胚胎，輪廓不清晰，結(jié)構(gòu)松散，有碎片。

8.7.2用于移植的豬克隆胚胎其評級應(yīng)當(dāng)達到B級（含B級）以上。

9牛體細胞克隆操作步驟

9.1牛卵母細胞的采集

9.1.1采集前準(zhǔn)備

配制適量牛卵母細胞成熟培養(yǎng)液（參見附錄B），并制作成熟培養(yǎng)盤，操作應(yīng)符合8.1.1給出的細節(jié)。

9.1.2卵巢

應(yīng)選擇無囊腫，無充血，無變色發(fā)黑且卵泡直徑在3mm~8mm之間的新鮮卵巢，其余操作按8.1.2的

規(guī)定進行。

9.1.3卵泡

應(yīng)選擇直徑3mm~8mm，卵泡液色澤清亮，無充血、發(fā)黑的牛卵泡，卵泡液的采集操作按8.1.3的規(guī)

定進行。

9.1.4COCs

按8.1.4的規(guī)定進行。

9.2牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)

5

GB/T××××—201×

將漂洗后的COCs放入9.1.1制備的培養(yǎng)盤中，在38.5℃~39.0℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)18h~22

h。

9.3牛成熟卵母細胞準(zhǔn)備

按8.3的規(guī)定進行。

9.4牛供核體細胞準(zhǔn)備

應(yīng)選擇大小均一，細胞形態(tài)完整且核型正確的原代體細胞，在去核移核操作前至少2天進行血清饑餓，

或者在核移核操作前至少3天進行細胞接觸抑制誘導(dǎo)來誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細胞進入G0期，消化后用于移

核。

9.5牛去核移核操作

牛的去核移核操作步驟按照8.5的規(guī)定進行。

9.6牛重構(gòu)胚制備

9.6.1電融合

牛移核后的卵母細胞宜采用微電極的方法進行融合。融合前，將移核后的卵母細胞放入電融合液（參

見附錄B）中預(yù)平衡3min。設(shè)定融合儀參數(shù)：電壓32V、脈沖時長20μs、2次脈沖間隔10ms。使用操作臂

調(diào)整移核后的卵母細胞使得注入卵母細胞透明帶下的體細胞在3點鐘方向，再用微電極到卵母細胞的兩端，

將電極截面較尖的一段對準(zhǔn)注入的體細胞，另一端對準(zhǔn)較鈍的一端電極，兩個電極相互配合夾住卵母細胞。

點擊電融合儀器，開始融合。重復(fù)該操作，直到完成全部卵子和體細胞的融合。

9.6.2激活

將卵母細胞移出融合液，放置于卵母細胞培養(yǎng)液（參見附錄B）中，清洗3次，移至卵母細胞培養(yǎng)液并

放至培養(yǎng)箱恢復(fù)1h~2h。此時，預(yù)熱離子霉素和6-DMAP以及培養(yǎng)胚胎用的mSOFaa培養(yǎng)液（參見附錄B）。

之后觀察體細胞是否融入卵母細胞，記錄未融合個數(shù)，計算融合率。此時體細胞融入的卵母細胞即為重構(gòu)

胚。挑出細胞膜完整的且體細胞已融入的重構(gòu)胚進行激活，用口吸管將重構(gòu)胚移入離子霉素激活液（參見

附錄B）中洗1次，再移入另一個離子霉素激活液液滴中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)3min~4min。然后移入mSOFaa

胚胎培養(yǎng)液（參見附錄B）中洗3次，再移入6-DMAP激活液滴中漂洗1次，再移入到另一個6-DMAP激活

液滴中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h~5h。

9.6.3培養(yǎng)

將重構(gòu)胚移入mSOFaa胚胎培養(yǎng)液中洗6次，再移入覆蓋石蠟油的mSOFaa胚胎培養(yǎng)液，放于培養(yǎng)箱中，

在38.5℃，5%~7%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。

9.7牛胚胎移植

9.7.1牛體細胞克隆胚胎質(zhì)量評定按照GB/T25881中的要求進行。

6

GB/T××××—201×

9.7.2用于移植的豬克隆胚胎其評級應(yīng)當(dāng)達到B級（含B級）以上。

10羊體細胞克隆操作步驟

10.1羊卵母細胞的采集

10.1.1采卵前準(zhǔn)備

配制適量羊卵母細胞成熟培養(yǎng)液（參見附錄C），并制作成熟培養(yǎng)盤，操作應(yīng)符合8.1.1給出的細節(jié)。

10.1.2卵巢

按8.1.2的規(guī)定進行。

10.1.3卵泡

按8.1.3的規(guī)定進行。

10.1.4COCs的選擇

按8.1.4的規(guī)定進行。

10.2羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)

將漂洗后的COCs放入10.1.1制備的培養(yǎng)盤中，在38.5℃~39.0℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)18h~22

h。

10.3羊成熟卵母細胞的準(zhǔn)備

按8.3的規(guī)定進行。

10.4羊核供體細胞準(zhǔn)備

按8.4的規(guī)定進行。

10.5去核移核操作

羊的去核移核操作步驟按照8.5的規(guī)定進行。

10.6羊重構(gòu)胚制備

10.6.1電融合

羊移核后卵母細胞的電融合參數(shù)為：電場強度為1.9kV/cm、2次直流脈沖（脈沖間隔0.1s）脈沖時長

20μs。操作按8.6.1進行。

10.6.2激活

將卵母細胞轉(zhuǎn)移到卵母細胞成熟培養(yǎng)液中（參見附錄C），清洗3次，再轉(zhuǎn)移至另一個含有卵母細胞成

熟培養(yǎng)液的培養(yǎng)盤中，放至培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h~2h左右。挑出細胞膜完整的且體細胞已融入的重構(gòu)胚進行激活，

將重構(gòu)胚放入含有7%乙醇的成熟液中激活7min，然后在含2mM6-DMAP的mSOFaa胚胎培養(yǎng)液（參見附

錄C）中38.5℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)4h。

7

GB/T××××—201×

10.6.3培養(yǎng)

按9.6.3的規(guī)定進行。

10.7羊胚胎移植

10.7.1胚胎質(zhì)量

評定標(biāo)準(zhǔn)參見表3。

表3羊體細胞孔胚胎質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)

質(zhì)量分級評定標(biāo)準(zhǔn)

胚胎形態(tài)完整，輪廓清晰，呈球形，卵裂球大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊。胚胎細

A級胞團呈均勻?qū)ΨQ的球形，單個卵裂球（或細胞）的大小、顏色、密度一致。胚

胎的發(fā)育階段與預(yù)期的發(fā)育階段一致，透明帶光滑。

輪廓清晰，卵裂球或細胞團的大小、性狀、顏色或密度存在一定的不規(guī)則，

B級

胚胎的發(fā)育階段與預(yù)期的發(fā)育基本階段一致。

卵裂球或細胞團的大小、性狀、顏色或密度嚴重不規(guī)則，胚胎的發(fā)育階段

C級

與預(yù)期的發(fā)育階段不一致。

D級死亡或退化的胚胎，輪廓不清晰，結(jié)構(gòu)松散，有碎片。

10.7.2用于移植的羊克隆胚胎其評級應(yīng)當(dāng)達到B級（含B級）以上。

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GB/T××××—201×

附錄A

（資料性附錄）

豬體細胞克隆操作所需試劑配方

A.1沖卵液（PVA-TLHepes）

配方見表A.1。

表A.1沖卵液配方

成分含量/L

Polyvinylalcohol(PVA)0.100g

NaCl6.663g

KCl0.237g

NaH2PO40.041g

NaHCO30.168g

Hepes2.383g

D-sorbitol2.186g

Sodiumpyruvate0.022g

Nalactatesolution1.868mL

PenicillinG0.065g

Gentamicin0.025g

MgCl2·6H2O0.102g

CaCl2·2H2O0.294g

A.2卵母細胞成熟培養(yǎng)液

配方見表A.2。

表A.2卵母細胞成熟培養(yǎng)液配方

成分含量/100mL

Medium1990.950g

PVA0.100g

NaHCO30.030g

D-Glucose0.055g

SodiumPyruvate0.010g

以上試劑用超純水溶解后定容至100mL，用0.22μm濾膜過濾后即為基礎(chǔ)卵母細胞成熟培養(yǎng)液，4℃

保存，3周內(nèi)有效。

在采集卵巢當(dāng)天，向上述溶液中添加0.57mM半胱氨酸以及10ng/mL表皮生長因子(epidermal

growthfactor,EGF)，0.5μg/mL促黃體激素(luteinizinghormone,LH)，0.5μg/mL促卵泡激素(follicle

stimulatinghormone,FSH)以及10%的豬卵泡液（porcinefollicularfluid,PFF）即為完全的卵母細胞成熟培養(yǎng)

液。

A.4卵丘細胞消化液

9

GB/T××××—201×

0.1%透明質(zhì)酸酶，100mg透明質(zhì)酸酶溶解于胚胎操作液中。

A.5胚胎操作液

配方見表A.5。

表A.5胚胎操作液配方

成分含量/L

Medium1990.950g

NaHCO30.005g

Hepes0.075g

NaCl0.175g

牛血清白蛋白（BSA）0.300g

青霉素0.005g

鏈霉素0.006g

A.6胚胎電融合激活液

配方見表A.6。

表A.6胚胎電融合激活液

成分含量/100mL

Mannitol5.465g

CaCl22H2O0.015g

MgCl26H2O0.002g

Hepes0.012g

A.7輔助激活液

輔助激活液由PZM-5中加入細胞松弛素(10mg/L)和放線菌酮(10mg/L)構(gòu)成。

A.8PZM-5胚胎培養(yǎng)液

配方見表A.8

表A.8PZM-5胚胎培養(yǎng)液

成分含量/100mL

NaCl0.631g

KCl0.074g

KH2PO40.005g

MgSO47H2O0.010g

NaHCO30.211g

Sodiumpyruvate0.002g

Ca(lactate)25H2O0.017g

L-Glutamine0.015g

Hypotaurine0.110g

EAA(Essentialaminoacids)2mL

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GB/T××××—201×

NEAA(Nonessentialaminoacids)1mL

Gentamicin5mg

BSA0.3g

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GB/T××××—201×

附錄B

（資料性附錄）

牛體細胞克隆操作所需試劑及配制方法

B.1牛用改良沖卵液

配方見表B.1。

表B.1牛用改良沖卵液配方

成分含量/100mL

NaCl0.805g

KCl0.020g

Na2HPO40.1153g

KH2PO40.020g

D-Glucose1.000g

Gentamicin0.005g

MgCl2·6H2O0.0121g

CaCl2·2H2O0.0132g

B.2牛卵母細胞成熟培養(yǎng)液

配方見表B.2。

表B.2牛卵母細胞成熟培養(yǎng)液配方

成分含量/100mL

Medium19990mL

EGF1μg

SodiumPyruvate0.002g

Gentamicin0.0025g

Estradiol-17β0.1mg

FSH10μg/mL

LH1μg/mL

FBS10mL

B.4卵丘細胞消化液

0.5%透明質(zhì)酸酶，100mg透明質(zhì)酸酶溶解于Medium199,Hepes中。

B.5牛胚胎操作液

配方見表B.5。

表B.5牛胚胎操作液配方

成分含量/500mL

Medium199,Hepes450mL

FBS50mL

青霉素0.025g

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鏈霉素0.030g

B.6牛胚胎電融合液

配方見表B.6。

表B.6牛胚胎電融合液配方

成分含量/100mL

Mannitol5.465g

CaCl22H2O0.015g

MgCl26H2O0.002g

Hepes0.012g

B.7胚胎離子霉素激活液

稱量1mg離子霉素溶解于267.6μLDMSO中，-20℃保存。用前將其用mSOFaa稀釋1000倍即為胚胎

離子霉素激活液體。

B.8牛胚胎6-DMAP激活液

稱量6-DMAP163mg溶解于5mLDPBS溶液中，溶解時用85℃水浴加熱促進溶解，-20℃保存。用之

前將其用mSOFaa稀釋100倍即為胚胎離子霉素激活液體。

B.9牛mSOFaa胚胎培養(yǎng)液

配方見表B.9。

表B.9牛mSOFaa培養(yǎng)液配方

成分含量/100mL

NaCl0.629g

KCl0.053g

KH2PO40.016g

MgSO47H2O0.010g

NaHCO30.211g

Sodiumpyruvate0.003g

CaCl25H2O0.025g

Glutamax1mL

Sodiumlactate77.55μL

Sodiumcitrate0.015g

Myo-inositol0.050g

EAA(Essentialaminoacids)2mL

NEAA(Nonessentialaminoacids)1mL

Gentamicin5mg

EFAFBSA(essentiallyfattyacidfree0.8g

BSA)

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附錄C

（資料性附錄）

羊體細胞克隆操作所需試劑及配制方法

C.1羊用沖卵液

配方見表C.1。

表C.1羊用沖卵液配方

成分含量/100mL

Medium199100mL

Heparin0.025g

BSA0.300g

Gentamicin0.005g

C.2羊卵母細胞成熟培養(yǎng)液

配方見表C.2。

表C.2羊卵母細胞成熟培養(yǎng)液配方

成分含量/100mL

Medium19990mL

FBS10mL

Hepes23.8mg

SodiumPyruvate2.0mg

Gentamicin2.5mg

Estradiol-β1.0μg

FSH0.2AU

LH0.1IU

C.4卵丘細胞消化液

0.5%透明質(zhì)酸酶，100mg透明質(zhì)酸酶溶解于M199，Hepes（10mM）中。

C.5羊用胚胎操作液

配方見表C.5。

表C.5羊用胚胎操作液配方

成分含量/500mL

Medium199