GB-T植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性測定 指示植物法征求意見稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—201XGB/TXXXXX—201X

植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性測定

指示植物法

Detectionofthebiologicalactivityforplanthormonessecondary

metabolites——Indicatorplantmethod

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實施

國家市場監(jiān)督管理總局

發(fā)布

中國國家標準化管理委員會

1

GB/T××××—201×

GB/T××××—201×

植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性測定指示植物法

1范圍

本標準規(guī)定了植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性指示植物法測定的原理、儀器設(shè)備及器具、試劑

和材料、操作步驟和結(jié)果計算。

本標準適用于植物激素類次生代謝產(chǎn)物生長素、細胞分裂素和赤霉素的活性測定。

生長素活性檢出限為10-6E；細胞分裂素活性檢出限為10-5E；赤霉素活性檢出限為10-5.5E。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。

3術(shù)語、定義和縮略語

下列術(shù)語、定義和縮略語適用于本文件。

3.1術(shù)語和定義

3.1.1

植物激素類次生代謝產(chǎn)物secondarymetabolitesofplanthormones

來自植物自身合成的以及通過微生物發(fā)酵或人工合成獲得的具有調(diào)控植物生長、發(fā)育與休眠的活性

物質(zhì)。

3.1.2

生物活性biologyactivity

單位濃度的植物激素類次生代謝產(chǎn)物與其相對應(yīng)的標準物促進或抑制植物生長、發(fā)育與休眠能力的

相對值。

注：單位用E表示。

3.2縮略語

GB/T××××—201×

下列縮略語適用于本文件。

3.2.1NAA：萘乙酸（1-naphthylaceticacid）。

3.2.2ZT：玉米素（zeatin）。

3.2.3GA：赤霉酸（gibberellicacid）。

4原理

一定濃度范圍內(nèi)，植物激素類活性物質(zhì)的濃度與其促進相應(yīng)指示植物的特定組織生長或特定物質(zhì)合

成的能力成正比，通過比較響應(yīng)單位濃度試樣和標準物的特定組織生長量或特定物質(zhì)合成量，進而得出

其生物活性。

5試劑或材料

除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。

5.1水：GB/T6682二級。

5.2小麥種子

小麥（TriticumaestivumL.），長麥6135。當年采收，顆粒飽滿，發(fā)芽率≥90%。

5.3尾穗莧種子

尾穗莧（AmaranthuscaudatusL.），紅色品種。當年采收，顆粒飽滿，發(fā)芽率≥90%。

5.4大麥種子

大麥（HordeumvulgareL.），二棱大麥。當年采收，顆粒飽滿，發(fā)芽率≥90%。

5.51%（w/v）次氯酸鈉溶液

量取100mL10%次氯酸鈉，用水定容至1000mL，臨用前配制。

5.60.1%（w/v）淀粉溶液

稱取可溶性淀粉1.00g，加蒸餾水至50mL，加熱至完全溶解后，再加入磷酸二氫鉀8.16g，待其溶

解后定容至1000mL。臨用前配制。

5.7I2-KI溶液

GB/T××××—201×

稱取碘化鉀0.60g，碘0.06g，用0.05N的鹽酸溶解并定容至1000mL，臨用前配制。

5.810-8mol/L乙酸緩沖液

稱取三水合乙酸鈉136mg，用水定容至1000mL，配制成10-3mol/L的乙酸鈉溶液；用移液槍吸取57

μL冰乙酸溶液，用水定容至1000mL，配制成10-3mol/L的乙酸溶液。分別量取590mL10-3mol/L的乙酸

鈉溶液與10-3mol/L乙酸溶液410mL，混合后，加入1g鏈霉素，搖勻。

5.9磷酸緩沖液

稱取L-酪氨酸0.20g，用5.5mL0.5N的鹽酸溶解；稱取十二水合磷酸氫二鈉2.39g，磷酸二氫鉀0.91

g，用水溶解后定容至100mL。將兩者混勻后定容至500mL。4℃保存?zhèn)溆没蛸徺I同類商品化產(chǎn)品。

5.10磷酸-檸檬酸緩沖液，pH5.0

稱取磷酸氫二鉀1.80g，檸檬酸1.02g，蔗糖20g，用水溶解后定容至1000mL，充分混勻后，用磷

酸氫二鉀或檸檬酸調(diào)整pH至5.0，4℃保存?zhèn)溆没蛸徺I同類商品化產(chǎn)品。

5.11NAA標準樣品：純度≥99%。

5.12GA3標準樣品：純度≥99%。

5.13ZT標準樣品：純度≥99%。

5.141mg/mLNAA標準貯備液

稱取10.0mgNAA標準品，用0.5mL無水乙醇溶解，用水定容至10mL，充分混勻后，4℃冰箱冷藏，

保存期1個月。

5.151mg/mLGA3標準貯備液

稱取10.0mgGA3標準品，用0.5mL無水乙醇溶解，用水定容至10mL，充分混勻后，4℃冰箱冷藏，

保存期1個月。

5.161mg/mLZT標準貯備液

稱取10.0mgZT標準品，用0.5mL無水乙醇溶解，用水定容至10mL，充分混勻后，4℃冰箱冷藏，

保存期1個月。

5.17NAA標準工作液

GB/T××××—201×

吸取1mLNAA標準貯備液，用磷酸-檸檬酸緩沖液定容至10mL，混勻，得到10-1mg/mL溶液。吸

取316μLNAA標準貯備液，684μL磷酸-檸檬酸緩沖液，混勻，得到3.16×10-1mg/mL溶液。依次10倍稀

釋得到10-4mg/mL，3.16×10-5mg/mL，10-5mg/mL，3.16×10-6mg/mL，10-6mg/mLNAA標準工作液。臨

用前配制。

5.18GA3標準工作液

-1

吸取1mLGA3標準貯備液，用磷酸-檸檬酸緩沖液定容至10mL，混勻，得到10mg/mL溶液。吸取

316μLNAA標準貯備液，684μL磷酸-檸檬酸緩沖液，混勻，得到3.16×10-1mg/mL溶液。依次10倍稀釋

-4-5-5-6-6

得到10mg/mL，3.16×10mg/mL，10mg/mL，3.16×10mg/mL，10mg/mLGA3標準工作液。臨用前

配制。

5.19ZT標準工作液

吸取1mLZT標準貯備液，用磷酸-檸檬酸緩沖液定容至10mL，混勻，得到10-1mg/mL溶液。吸取

316μLNAA標準貯備液，684μL磷酸-檸檬酸緩沖液，混勻，得到3.16×10-1mg/mL溶液。依次10倍稀釋

得到10-4mg/mL，3.16×10-5mg/mL，10-5mg/mL，3.16×10-6mg/mL，10-6mg/mLZT標準工作液。臨用前

配制。

6儀器設(shè)備

6.1帶蓋托盤：不透光。

6.2微量移液器。

6.3容量瓶。

6.4pH計：精度0.01。

6.5電子分析天平：精度0.1mg，0.01g，1g。

6.6生化培養(yǎng)箱：25℃±1℃，遮光處理。

6.7搖床：25℃±1℃，遮光處理。

6.8冷凍盒：規(guī)格50mL，16格。

6.9帶圖像處理系統(tǒng)的體式顯微鏡：測量精度1μm。

6.10綠光暗室：波長492~455nm。

GB/T××××—201×

6.11研磨珠子：直徑1~2mm。

6.12恒溫水浴鍋：30℃±1℃。

7測定步驟

7.1試樣制備

按供試樣品的有效物質(zhì)（或待測物質(zhì)）質(zhì)量換算，稱量足量固體樣品或量取足量液體樣品，按產(chǎn)品

或待測物質(zhì)特性選擇合適的試劑或水溶解配制有效物質(zhì)（或待測物質(zhì)）的母液，濃度記為c0（mg/mL）。

待測時進行10倍梯度稀釋。試樣至少制備3個濃度梯度。

7.2生長素測定

7.2.1小麥胚芽鞘切段獲取

小麥種子用現(xiàn)配1%次氯酸鈉溶液浸泡殺菌15min，蒸餾水洗凈，重復一次。然后放置在底層鋪好

兩層蒸餾水浸潤的濾紙的托盤上排列整齊，覆膜加蓋后在無光照的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。幼苗生長至約

25~35mm時（約3天），選取長度為25~30mm的幼苗株，從基部取下芽鞘，在綠光暗室中切去3~5mm

頂端，切取接下來的約6mm切段，放入盛有磷酸-檸檬酸緩沖液的大培養(yǎng)皿中，置于搖床中搖1.5h（≤80

r/min），每半小時換一次溶液。

7.2.2胚芽鞘長度測量

準備冷凍盒，對每格進行編號，將切段一對一放入冷凍盒格子中，置于體式顯微鏡下測量長度后記

錄每格中胚芽鞘切段的長度（L0）。一個盒子為一個處理，每格中加入5mL相應(yīng)濃度的標準品工作液

或試樣溶液。以磷酸-檸檬酸緩沖液為對照。生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。然后將處理后的胚芽鞘置于體式顯

微鏡下測量長度并記錄（L）。

7.2.3標準曲線繪制

按表1進行數(shù)據(jù)測量記錄并計算胚芽鞘實際伸長長度ΔL，每一處理組至少需測定15個重復，取重復

測試結(jié)果絕對差值不超過算術(shù)平均值的20%的至少5組數(shù)據(jù)，計算ΔL的平均值。以10為底取標準品工作

液濃度的對數(shù)值x為自變量，以處理組和對照組中胚芽鞘切斷的平均伸長長度比值（ΔLn/ΔL0）為因變

量y，繪制標準曲線。

表1標準曲線制作相關(guān)試驗處理設(shè)置及數(shù)據(jù)記錄表

組號（Pn）對照組處理組

GB/T××××—201×

P0P1P2P3P4P5

原胚芽鞘切段長度L0（μm）L00L01L02L03L04L05

-6-6-5-5-4

標準工作液濃度（mg/mL）0103.16×10103.16×1010

標準工作液濃度的對數(shù)值x——-6-5.5-5-4.5-4

處理后胚芽鞘切段長L（μm）L0L1L2L3L4L5

處理后胚芽鞘實際伸長長度ΔL0=ΔL1=ΔL2=ΔL3=ΔL4=ΔL5=

ΔL（μm）L0-L00L1-L01L2-L02L3-L03L4-L04L5-L05

7.2.4測量

測量試樣溶液處理的胚芽鞘切段長度后計算實際伸長長度ΔL，每一組至少需測定15個重復，取重

復測試結(jié)果絕對差值不超過算術(shù)平均值的20%的至少5組數(shù)據(jù)，計算ΔL的平均值。獲得試樣組和對照組

中胚芽鞘切斷的平均伸長長度比值y（ΔLn/ΔL0），試驗得到的y值在標準曲線線性范圍的試驗視為有效

試驗，記錄試樣濃度c，無效試驗所獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)舍去。然后依據(jù)有效y值從標準曲線中計算x，依據(jù)（1）

式計算試樣中生長素類物質(zhì)的生物活性，若有多個有效y值，則按（1）式計算后取其平均值。

7.3細胞分裂素測定

7.3.1試驗用尾穗莧幼苗的獲取

將足量（2g左右）尾穗莧種子用現(xiàn)配的2%次氯酸鈉溶液浸泡殺菌15min，蒸餾水洗凈，重復一次。

然后置于25℃生化培養(yǎng)箱吸脹5h，然后放于盛有消毒后的定性濾紙的18cm大培養(yǎng)皿中，加入9mL蒸餾

水，覆膜加蓋，25℃黑暗培養(yǎng)72h發(fā)芽。選取子葉大小均一的黃化幼苗。

7.3.2莧紅素濃度測量

分別挑選長勢均勻的黃化苗30株移入墊有兩層濾紙的6cm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿為一個處理，分別

加入1mL不同濃度的標準工作液或試樣溶液，以磷酸緩沖液作為對照，于黑暗條件下，在培養(yǎng)箱中繼

續(xù)培養(yǎng)48h，用鑷子選取大小、顏色相對均一的子葉40個并將其轉(zhuǎn)入盛有1mL蒸餾水的離心管中，加入

適量研磨珠，用高速震蕩研磨儀在50Hz頻率下震蕩研磨5min破碎細胞，10000rpm離心5min后，取0.8

mL紅色上清液加入事先加好4.2mL蒸餾水的離心管，以對照管調(diào)零，用紫外分光光度計在波長為534nm

和650nm處分別讀取光密度值OD534和OD650，記錄相減的差數(shù)（OD534–OD650），即指示莧紅素濃度的

光密度值D。

GB/T××××—201×

7.3.3標準曲線繪制

按表2進行數(shù)據(jù)測量記錄并計算光密度值D（OD534–OD650）。以10為底取標準品工作液濃度的對數(shù)

值x為自變量，以處理組中光密度值Dn為因變量y，繪制標準曲線。

表2標準曲線制作相關(guān)試驗處理設(shè)置及數(shù)據(jù)記錄表

組號（Pn）P1P1P2P3P4P5

標準工作液濃度

010-53.16×10-510-43.16×10-410-3

（mg/mL）

標準工作液濃度

對照-5-4.5-4-3.5-3

的對數(shù)值X

OD534——OD5341OD5342OD5343OD5344OD5345

OD650——OD6501OD6502OD6503OD6504OD6505

光密度差值

——D1D2D3D4D5

D=OD534-OD650

7.3.4測量

測量并計算試樣溶液處理后莧紅素濃度的光密度值D，D值在標準曲線線性范圍的試驗視為有效試

驗，記錄試樣濃度c，無效試驗所獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)舍去。然后依據(jù)有效y值從標準曲線中計算x，依據(jù)（1）

式計算試樣中細胞分裂素類物質(zhì)的生物活性，若有多個有效y值，則按（1）式計算后取其平均值。

7.4赤霉素測定

7.4.1試驗用無胚大麥半粒種子的獲取

將約200粒大麥種子用手術(shù)刀片橫切兩半，選擇無胚的一半，用現(xiàn)配的1%次氯酸鈉溶液浸泡殺菌15

min，蒸餾水洗凈，重復一次。然后放于盛有濕潤消毒濾紙的大培養(yǎng)皿中吸脹48h，取出放進50mL離心

管中，以50~100r/min揺1.5h，每0.5h換一次水，于濾紙上輕輕吸干后，備用。

7.4.2α-淀粉酶活性測量

分別在10mL離心管中放入已吸脹的10個大麥無胚半粒種子，每個離心管為一個處理，分別加入1

mL不同濃度的標準品溶液或待測樣品，以乙酸緩沖液為對照。將試管放進搖床中60~100rpm震蕩培養(yǎng)

24h。用研棒將種子研碎混勻后低速離心，使種子碎屑沉淀，然后從每個離心管中吸取上清液0.4mL至

新的10mL離心管中，加入1.6mL0.1%淀粉溶液，混勻，30℃水浴10min。再加入I2-KI溶液2mL，蒸餾

GB/T××××—201×

水定容至5mL，充分搖勻（溶液呈藍色），以對照管調(diào)零，用紫外分光光度計讀取每管中溶液的OD580

值，指示α-淀粉酶活性。

7.4.3標準曲線繪制

按表3進行數(shù)據(jù)測量記錄并計算光密度值D（OD580）。以10為底取標準品工作液濃度的對數(shù)值x為

自變量，以處理組的光密度值Dn為因變量y，繪制標準曲線。

表3標準曲線制作相關(guān)試驗處理設(shè)置及數(shù)據(jù)記錄表

組號（Pn）P