動(dòng)物微生物病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷

關(guān)于動(dòng)物微生物病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷然后根據(jù)可疑病毒的生物學(xué)特點(diǎn)、機(jī)體免疫應(yīng)答和臨床過程，以及病人當(dāng)前所處的時(shí)機(jī)，確定實(shí)驗(yàn)診斷方法。第2頁,共63頁，2024年2月25日，星期天1.對(duì)潛伏期短，發(fā)病時(shí)尚無抗體產(chǎn)生，可選擇測定病毒顆粒、病毒抗原或核酸。第3頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.對(duì)潛伏期超過十天的感染，可檢測特異性的IgM抗體來進(jìn)行早期快速診斷，及區(qū)別初次和再次感染。第4頁,共63頁，2024年2月25日，星期天3.對(duì)可在體內(nèi)形成持續(xù)感染或潛伏感染的病毒，可檢測急性期和恢復(fù)期雙份血清的IgG抗體有無4倍以上升高，或直接檢測病毒核酸。第5頁,共63頁，2024年2月25日，星期天4.對(duì)原因不明或有新病毒感染時(shí)，應(yīng)采集標(biāo)本進(jìn)行病毒分離，同時(shí)應(yīng)采取雙份血清以確認(rèn)分離的病毒為病原體。第6頁,共63頁，2024年2月25日，星期天5.對(duì)同一癥狀可有多種病毒引起的情況，應(yīng)同時(shí)檢測幾種相關(guān)病毒的病毒顆粒、抗原或抗體，6.對(duì)由多個(gè)型別組成的病毒可測定它們的共同抗原。第7頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)標(biāo)本采集與運(yùn)送

一、標(biāo)本的采集1.采樣時(shí)間盡可能在發(fā)病的初期，急性期或患者人院的當(dāng)天進(jìn)行。

第8頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.標(biāo)本種類的選擇根據(jù)臨床感染的癥狀及流行病學(xué)資料，判斷可能感染病毒種類，選擇相應(yīng)部位采取標(biāo)本。第9頁,共63頁，2024年2月25日，星期天常見分離病毒標(biāo)本的選擇

病毒咽拭子糞便血液腦脊液唾液

組織

柯薩奇A和B組

+++心

單純皰疹病毒

+腦膜

腮腺炎病毒

+++流感病毒

+輪狀病毒

+HAV+HIV+

精液第10頁,共63頁，2024年2月25日，星期天3．常見標(biāo)本的采集方法

(1)血液：以無菌取抗凝血10ml?？鼓x用100n／ml肝素鈉。用于分離CMV、HSV，、黃病毒、EBV、HIV-1及新生兒腸道病毒。第11頁,共63頁，2024年2月25日，星期天(2)腦脊液：以無菌取腦脊液

1～2ml，冰浴立即送檢。在4℃可存放72h。用于分離柯薩奇病毒、ECHO病毒、腸道病毒、腮腺炎病毒。第12頁,共63頁，2024年2月25日，星期天(3)宮頸或陰道拭子：采取病灶部位分泌物，或?qū)⑹米由烊藢m頸約lcm停留5秒取出，冰浴立即送檢。用于分離HSV、CMV。第13頁,共63頁，2024年2月25日，星期天(4)糞便標(biāo)本：取2～4ｇ糞便加

10ml運(yùn)送液立即送檢，用于分離腺病毒、腸道病毒和輪狀病毒。第14頁,共63頁，2024年2月25日，星期天(5)含漱液：用無菌生理鹽水讓患者含漱。用于分離流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、

RSV等。

第15頁,共63頁，2024年2月25日，星期天(6)喉拭子：用壓舌板避免唾液污染，用拭子采取咽喉部表面。用于分離腺病毒、CMV、腸道病毒、HSV、流感病毒等。第16頁,共63頁，2024年2月25日，星期天(7)尿道拭子及尿液標(biāo)本：尿道拭子伸人尿道4cm轉(zhuǎn)動(dòng)3次，以獲得較多的上皮細(xì)胞，用于分離

CMV和HSV。(8)尸檢標(biāo)本：死亡后盡早采集各種器官，分別使用器械和容器。第17頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、標(biāo)本的運(yùn)送和保存

病毒抵抗力弱，室溫中容易滅活，用于分離培養(yǎng)的標(biāo)本要盡快送檢，4℃下數(shù)ｈ或-70℃。凍存液中加入甘油或二甲基亞砜(DMSO)等作保護(hù)。第18頁,共63頁，2024年2月25日，星期天病毒傳送培養(yǎng)基以Hanks液為基礎(chǔ)加滅活的小牛血清。為抑制細(xì)菌生長加青霉素100U／ml和鏈霉素100μg／ml，為了抑制真菌的生長加入2．5μg／ml二性霉素B或40μg／ml制霉菌素。第19頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)病毒分離與鑒定

一、病毒的分離方法1.組織細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞的來源、特性和傳代次數(shù)分為：(1)原代細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞懸液。加入營養(yǎng)液培養(yǎng)。形成的單層細(xì)胞，稱之為原代細(xì)胞。第20頁,共63頁，2024年2月25日，星期天(2)二倍體細(xì)胞株：仍保持二倍體特性。壽命一般為40～50代，如人胚肺細(xì)胞。廣泛用于病毒分離和疫苗制備。第21頁,共63頁，2024年2月25日，星期天(3)傳代細(xì)胞系：來于腫瘤細(xì)胞，染色體特征類似腫瘤細(xì)胞。常用的有人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人喉上皮癌細(xì)胞(Hep-2)。第22頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2．雞胚接種雞胚是用于分離粘病毒科、皰疹病毒、痘類病毒的較為理想的材料。第23頁,共63頁，2024年2月25日，星期天3．動(dòng)物接種動(dòng)物對(duì)病毒的敏感性是不同的，選擇合適動(dòng)物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分離病毒。第24頁,共63頁，2024年2月25日，星期天常用于病毒分離的細(xì)胞

細(xì)胞種類可分離的病毒

原代細(xì)胞

非洲綠猴腎細(xì)胞人單核細(xì)胞人胚腎、肺細(xì)胞恒河猴獼猴腎細(xì)胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒

HIV、HTLV、HHV-6腮腺炎病毒、腺病毒ECHO、脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A、B組、RSV

二倍體細(xì)胞株

人胚肺成纖維細(xì)胞株

WI-38、MRC—5CMV、VZV、鼻病毒腮腺炎病毒、腺病毒

傳代細(xì)胞系

HelaHep-2Vero

柯薩奇A、B組、RSV腺病毒、RSVHSV、RSV、風(fēng)疹病毒、輪狀病毒、麻疹病毒第25頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三、病毒的鑒定

必須通過全面了解其特性才能得到鑒定。1.根據(jù)臨床特點(diǎn)，流行病學(xué)資料，標(biāo)本來源，大致了解病毒的一些特性，有助于確認(rèn)病毒的種類。第26頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.動(dòng)物感染范圍及特點(diǎn)病毒感染動(dòng)物的范圍、發(fā)病的潛伏期。3.細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)。綜合上述資料作出鑒定。第27頁,共63頁，2024年2月25日，星期天病毒鑒定的方法1.細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果觀察

病毒增殖后導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生:①細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。細(xì)胞腫大，變圓堆積成葡萄狀，細(xì)胞溶解出現(xiàn)空斑，細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞，胞漿內(nèi)或核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性或嗜堿性包涵體等；第28頁,共63頁，2024年2月25日，星期天②不出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象。③細(xì)胞培養(yǎng)液pH的變化。第29頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.中和試驗(yàn)病毒與特異性抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，使病毒失去感染性，在細(xì)胞培養(yǎng)和活的機(jī)體內(nèi)不出現(xiàn)病變的試驗(yàn)。常用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行中和試驗(yàn)。如果特異性抗體能中和病毒，使之失去感染性，不出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，則該病毒為特異性抗體的同型病毒，第30頁,共63頁，2024年2月25日，星期天用于病毒的分型診斷最具敏感和準(zhǔn)確性。也可用于檢查患者病后或人工免疫后，機(jī)體血清中抗體增加情況。

第31頁,共63頁，2024年2月25日，星期天3.空斑或蝕斑形成試驗(yàn)

空斑是指在單層細(xì)胞中被病毒感染引起死亡的細(xì)胞區(qū)域，周圍被活細(xì)胞包圍。一般而言，一個(gè)空斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒感染所引起的。不同的病毒引起的空斑形態(tài)和大小不同?？蛇M(jìn)行病毒顆粒的計(jì)數(shù)、純化，結(jié)合中和試驗(yàn)可進(jìn)行病毒的鑒定。第32頁,共63頁，2024年2月25日，星期天4.干擾現(xiàn)象

某些病毒間存在著干擾現(xiàn)象，如某些型別的鼻病毒能干擾以后進(jìn)入的副流感病毒的增殖，從而阻抑后者的紅細(xì)胞吸附作用。第33頁,共63頁，2024年2月25日，星期天5.紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗(yàn)正粘病毒，副粘病毒感染的宿主細(xì)胞，病毒增殖后產(chǎn)生細(xì)胞病變，但在細(xì)胞表面含有病毒某些抗原成分(血凝素)，能吸附雞、豚鼠或猴紅細(xì)胞。第34頁,共63頁，2024年2月25日，星期天可作為初步鑒定。如果在培養(yǎng)瓶中加入相應(yīng)的血凝素抗血清后，不出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，是為紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)陽性，可作為病毒鑒定的依據(jù)。第35頁,共63頁，2024年2月25日，星期天4．血凝試驗(yàn)及血凝抑制試驗(yàn)

某些病毒可與一定種類的哺乳動(dòng)物或禽類的紅細(xì)胞產(chǎn)生血凝現(xiàn)象。加入相應(yīng)的血凝素抗體可抑制血凝現(xiàn)象的發(fā)生，是為血凝抑制試驗(yàn)。可作為病毒型別確定的依據(jù)。第36頁,共63頁，2024年2月25日，星期天5．病毒的大小及形態(tài)

可用電子顯微鏡觀察病毒的大小及形態(tài)。第37頁,共63頁，2024年2月25日，星期天6．核酸類型鑒別及序列測定

利用5—溴-2-脫氧尿苷(BUDR)抑制DNA復(fù)制的特性，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入該物質(zhì)，可抑制DNA病毒的復(fù)制和增殖，抑制細(xì)胞病變的出現(xiàn)，但對(duì)

RNA病毒無抑制作用，以此判斷病毒核酸類型。第38頁,共63頁，2024年2月25日，星期天對(duì)病毒核酸特異序列或全序列的堿基排列測定或DNA雜交、DNA-RNA雜交來鑒定病毒。第39頁,共63頁，2024年2月25日，星期天7．耐酸試驗(yàn)

腸道病毒對(duì)酸有耐受力，而鼻病毒在酸性環(huán)境下易被滅活。

第40頁,共63頁，2024年2月25日，星期天8．乙醚敏感試驗(yàn)

病毒外圍如有類脂包膜，則易被乙醚破壞，而失去感染性，不能感染細(xì)胞?？勺鳛椴《臼欠窬哂蓄愔さ囊罁?jù)，也可用氯仿或去膽酸鈉代替乙醚進(jìn)行試驗(yàn)。

第41頁,共63頁，2024年2月25日，星期天9．免疫熒光抗體染色

將感染細(xì)胞固定，用特異抗血清熒光標(biāo)記染色，在熒光顯微鏡下，可見細(xì)胞內(nèi)熒光，即可確定型別。第42頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)病毒感染快速診斷

通過測定病毒的特異標(biāo)志成分，如特殊形態(tài)、特異的抗原成分及病毒的核酸，早期確認(rèn)病毒的感染，是病毒學(xué)診斷的重大發(fā)展。第43頁,共63頁，2024年2月25日，星期天一、形態(tài)學(xué)檢查

1．光學(xué)顯微鏡觀察病毒感染細(xì)胞出現(xiàn)的包涵體。根據(jù)特點(diǎn)可作出輔助診斷?？袢〔《驹谀X細(xì)胞出現(xiàn)嗜酸性的圓形或橢圓形包涵體，稱為內(nèi)基小體。巨細(xì)胞病毒在上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)周圍繞有一輪暈似“貓頭鷹眼”樣大型嗜酸性包涵體。第44頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2．電子顯微鏡檢查

(1)電鏡直接檢查：早期病毒感染標(biāo)本的病毒顆粒。如“秋季瀉”患兒糞便中的輪狀病毒、甲肝患者糞便中的HAV，皰疹病毒的皰疹液，

HBV患者血清，均可觀察到特征性病毒顆粒。

第45頁,共63頁，2024年2月25日，星期天(2)免疫電鏡檢查：在標(biāo)本中加入抗體。使病毒聚集成塊負(fù)染觀察，更易發(fā)現(xiàn)病毒體，靈敏度可提高100倍。第46頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

二、病毒抗原檢測

病毒抗原是病毒特異性的標(biāo)志，通過免疫學(xué)技術(shù)檢測標(biāo)本中特異性抗原存在，可以早期診斷病毒感染。第47頁,共63頁，2024年2月25日，星期天1．免疫熒光技術(shù)適合于型別少，細(xì)胞培養(yǎng)難以成功的病毒，如流感病毒、副流感病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒等。肝活檢組織中的肝炎病毒、神經(jīng)組織中的單純皰疹病毒、腦組織中的狂犬病毒或其他脫落細(xì)胞和活檢組織中的病毒抗原檢測。第48頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2．酶免疫技術(shù)有酶免疫組化和酶免疫吸附(ELlSA)試驗(yàn)法。測定標(biāo)本中游離的抗原或抗體。如檢測乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)，HIV感染病人的P24

抗體等。第49頁,共63頁，2024年2月25日，星期天3.其他技術(shù)如固相放射免疫技術(shù)、發(fā)光免疫分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)等。第50頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三、早期抗體檢測

檢測病毒感染機(jī)體后產(chǎn)生的早期特異性抗體，如測定特異性IgM可以快速明確診斷各種病毒引起的新生兒先天性感染，測定HAV感染后抗HAV的IgM抗體可以明確診斷HA等。第51頁,共63頁，2024年2月25日，星期天四、病毒核酸檢測

只要有完整的特異基因片段存在，就可進(jìn)行診斷。第52頁,共63頁，2024年2月25日，星期天1．斑點(diǎn)雜交法

將待測的DNA或RNA直接點(diǎn)在雜交濾膜上，變性后，用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。用32p或131I同位素標(biāo)記的探針通過放射白顯影，可直接觀察?，F(xiàn)用地高辛、生物素等非同位素物質(zhì)標(biāo)記，然后采用酶反應(yīng)或酶免疫技術(shù)進(jìn)行檢測，已被越來越多的實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。第53頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2．固相雜交技術(shù)

將核酸探針包被聚苯乙烯微孔板中，加人待測的核酸序列和標(biāo)記的指示探針雜交液中進(jìn)行雜交，洗滌后，用酶免疫技術(shù)進(jìn)行檢測。第54頁,共63頁，2024年2月25日，星期天3.原位分子雜交技術(shù)

在細(xì)胞原位暴露DNA或RNA，加入標(biāo)記特異核酸探針進(jìn)行雜交。通過顯色技術(shù)可顯示特定雜交探針在細(xì)胞內(nèi)的位置和核酸的數(shù)量。第55頁,共63頁，2024年2月25日，星期天4.Southern印跡和Northern印跡法

Southern印跡法用于DNA的雜交。提取

DNA,用內(nèi)切酶切割后，進(jìn)行瓊脂糖電泳按分子量使DNA分開，將DNA移至硝酸纖維膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交?？梢詸z測病毒DNA特異序列。

Northern印跡法用于RNA雜交分析。將瓊脂糖電泳后的RNA移至DBM膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。用于檢測RNA或mRNA。第56頁,共63頁，2024年2月25日，星期天5．聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

選擇病毒的特異保守片段作為靶基因，