植物根系分泌有機酸的收集、分離及檢測方法探析

植物根系分泌有機酸的收集、分離及檢測方法探析

摘要：根分泌物主要是以碳為基礎的低分子化合物和高分子化合物。植物分泌的有機酸主要有乙酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸和琥珀酸等,它們調節(jié)細胞代謝,為根際和微生物提供營養(yǎng)。植物根系分泌有機酸的研究對于了解植物的根際效應具有重要的學術意義。簡述了根系分泌物有機酸的收集、分離和檢測方法。

關鍵詞：根分泌物;有機酸;收集;分離;檢測;

Abstract：Rootexudatesincludelowmolecularcompounds,highmolecularcompounds,andprimarilycarbon-basedcompounds.Theorganicacidssecretedbyplantsaremainlyaceticacid,oxalicacid,citricacid,malicacid,tartaricacidandsuccinicacid,whichregulatecellmetabolismandprovidenutrientsfortherhizosphereandmicroorganisms.Thestudyofplantrootexudatesoforganicacidshasimportantacademicsignificanceforunderstandingtherhizosphereeffectsofplants.Thispaperbrieflydescribedthemethodsofcollection,separationanddetectionoforganicacidsinrootexudates.

Keyword：rootexudates;organicacid;collection;separation;detection;

0、引言

根際作為植物、微生物和土壤之間的交互作用區(qū)域,是根-土界面微生態(tài)系統(tǒng)的物質基礎和核心內容。植物在混雜的土壤環(huán)境中獲取營養(yǎng)物質時,根際系統(tǒng)起到重要作用:從土壤中吸收水分、無機鹽的同時向周圍釋放各種化合物。土壤有機碳很大一部分來自于植物根系【2】,同時根為根際微生物生長提供特定營養(yǎng)物質。引起根系周邊微生物發(fā)生改變,很重要的一個原因就是根系分泌物的快速釋放。

根分泌物是生長過程中植物根系主動或被動向根系周邊分泌各種有機化合物的總稱。根據分子量不同可分為2類:一類為氨基酸、有機酸、脂肪酸、糖、酚、黃酮和一些次生代謝物等的低分子化合物;另一類為蛋白質、酶和異源外激素等的高分子化合物。根據性質不同可分為3類:細胞脫落物和裂解物;高分子量凝膠狀物;低分子量有機化合物。根據來源不同可分為3類:分泌物、滲出物和裂解物。

植物分泌的有機酸在根際活化營養(yǎng)和改善環(huán)境脅迫方面起著至關重要的作用。研究表明,重金屬脅迫下植物根系會大量分泌多種分泌物,引起根際周邊的Eh和pH改變,從而影響根吸收重金屬的能力。有機酸與重金屬結合,發(fā)生螯合、絡合或沉淀作用,或將金屬滯留在土壤中,或進入到植物體內,同時使根際微生物的活性和組成發(fā)生變化,從而間接改變重金屬的活度、含量。這是植物抵抗重金屬毒性的一種有效機制,同時也是某些超富集植物能在體內吸收更多重金屬的原因。有機酸主要絡合Fe(Ⅲ)、Zn(Ⅱ)、Al(Ⅲ),檸檬酸、草酸絡合鋁的能力最大,還能有效提高Cd、Pb溶解度。

許多研究證實鋁脅迫下,大豆能在根尖分泌檸檬酸以緩解或解除鋁的毒性。Tu等研究顯示,As超富集植物蜈蚣草(PterisvittataL.)在As脅迫下根分泌物以草酸和植酸為主,雖然在As誘導下,非超富集植物波士頓蕨(Nephrolepisexaltata)也可以產生草酸和植酸,但前者分泌的草酸和植酸是波士頓蕨類植物的3～5倍、0.46～1.06倍,有機酸能活化As并將其轉移到葉片中。陳英旭等對蘿卜的研究表明,在不同濃度的鉛/鎘營養(yǎng)液中加入檸檬酸和酒石酸,檸檬酸對鉛、酒石酸對鎘具有顯著的解毒作用,檸檬酸能抑制蘿卜根系對鉛的吸收,酒石酸可降低對鎘的吸收。

1、植物培養(yǎng)方法和根分泌物收集方法

根據植株根系所處培養(yǎng)環(huán)境的不同,研究根系分泌物的植物培養(yǎng)方法包括土培法、砂培法、營養(yǎng)液培養(yǎng)法(水培法)和瓊脂培養(yǎng)法。

1.1、土培法

土培法是在土壤基質上種植植物,土壤用作植物生長培養(yǎng)基。當植物生長到一定階段后,將根際土壤直接收取,適量加入殺菌劑,并添加浸提劑進行振蕩提取,通過過濾和離心后獲得的上清液即是根分泌物。土培法是反映植物自然生長和根系實際分泌的最合適栽培方法,因為機械阻力大,根分泌作用旺盛。與其他培養(yǎng)方式相比,土培法可以收集到更多的分泌物。但土培法難以收集根系分泌物,并且不能反映植物特定部位分泌特性,而分泌物原位收集更加困難。

1.2、砂培法

砂培法是將植物種植在石英砂中一段時間后,將石英砂泡入有機溶劑或蒸餾水中得到的溶液濃縮,濃縮液中含有根分泌物。相對于土培法而言,砂培法的栽培條件更易控制,管理方便,生長時不需支撐物,植物根系通氣性更好,能得到更多的分泌物。徐婉明等人研究香蕉根分泌物就采用砂培法。

然而砂培法也有其缺點。植物根系生長受到很大阻力,植物在外源脅迫下會誘導分泌更多有機質,無法準確反映植物自然生長環(huán)境下根系分泌物的分泌。且砂培法洗砂、淘砂繁瑣。在植物栽培過程中,應注意石英砂容易生長苔蘚,這會對整個實驗造成一定干擾。

1.3、營養(yǎng)液培養(yǎng)法

營養(yǎng)液培養(yǎng)法是將幼苗或無菌種子移植到營養(yǎng)液中,進行一段時間的脅迫處理,無菌水沖洗后,放入有微生物抑制劑的溶液中培養(yǎng)一定時間得到溶液(即浸根法收集),或利用外源脅迫一定時間得到營養(yǎng)液(即特定營養(yǎng)液收集),收集到的溶液為根系分泌物。Tu等利用營養(yǎng)液培養(yǎng)植株,用浸根法收集分泌物,分離并測定草酸和植酸。李勇等利用營養(yǎng)液培養(yǎng)法培養(yǎng)人參種苗,將第3次換下的營養(yǎng)液分離出來研究營養(yǎng)元素虧缺下人參根分泌物的主要成分。

溶液培養(yǎng)法簡單易操作,反映了全部根系分泌物的變化,容易排除外來物質干擾。但對于特定營養(yǎng)液收集而言,營養(yǎng)液中鹽分含量較高,需要脫鹽,脫鹽方法繁瑣,容易影響實驗結果。

王樹起等的研究顯示,大豆分別用水培法和砂培法培養(yǎng),其根系分泌的有機酸各組分基本相同,主要是草酸、檸檬酸、蘋果酸和酒石酸。與水培條件相比,砂培條件下分泌的有機酸是水培的2～3倍。

收集根系分泌物的最常用方法是浸根法,取出根后先用蒸餾水清洗根部3～5次,再用去離子水或重蒸水清洗,用濾紙吸干根部表面水分,將根置于盛有去離子水的燒杯中,燒杯用黑色塑料布包裹,放入植物培養(yǎng)箱內不斷通氣收集數小時,得到的溶液即為根系分泌物。徐根娣等在收集鋁脅迫下大豆根系分泌的有機酸時就采用浸根法。收集根分泌物時須加入微生物抑制劑,如CaCl2、百里酚、氯霉素等防止微生物分解有機質,收集時需過濾去除殘根、雜質。根分泌有機酸會被溶液大量稀釋,收集液體積大、濃度低,因此,必須進行冷凍干燥或用真空旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮等前處理,需要專門設備,耗能較大,周期長、誤差較大。

1.4、瓊脂培養(yǎng)法

瓊脂培養(yǎng)法是現在較為流行的培養(yǎng)方法,它是將經消毒、浸泡等處理后的種子播于經處理的瓊脂培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),或者將幼苗種植在瓊脂培養(yǎng)基,經過一段時間的脅迫后,收集附著在根部和根部周邊的瓊脂,經加熱、溶解、過濾,收集的溶液即為根分泌物。雖然該方法是目前比較流行的培育方式,但只適用于體積較小的植物或幼苗階段,培養(yǎng)過程中應注意防止微生物污染。

2、幾種新型原位根分泌物收集系統(tǒng)

根分泌物原位收集比較困難,一般是直接取植物根際土壤,而原位根分泌物收集系統(tǒng)就能有效解決這個問題。原位收集是將植物移栽到底部有收集器的培養(yǎng)容器中,培養(yǎng)液向下滲流的同時根分泌物被淋洗到收集器內。該方法不僅可原位收集根分泌物,還可連續(xù)收集而不破壞根系環(huán)境。

賈黎明等和廖繼佩等設計出一種原位收集根分泌物的連續(xù)裝置,該裝置是讓植物在石英砂、河砂和鵝卵石的混合基質內生長,用水定期洗脫根部,分泌物與淋洗液一起循環(huán),從而在樹脂管中收集分泌物,然后洗脫樹脂,最終得到根分泌物。

王占義等研究設計的土壤栽培條件下植物根分泌物的收集裝置如圖1所示。將植物栽培到生長箱內,重力作用下玻璃板壁對根系造成定向引導,根系通過瓊脂后進入收集箱內,累積達到所需體積后,對收集介質進行淋洗,定期洗脫樹脂。研究結果表明,該裝置收集有機酸加標回收率>70%,蘋果酸回收率為81%。

羅小三等等設計的原位溶液采樣器,可動態(tài)地研究根分泌物的組成。該裝置是將原位采樣管環(huán)平置放在所需土層,填入土壤后壓實,然后種植相關植物,當需要采集土壤溶液或根分泌物時,土壤保持一定的濕度,通過收集器對管路施加負壓,土壤溶液會流入收集器中,滿足所需的收集量后,收集器和輸送管斷開連接,收集到的溶液可用于后續(xù)測定和分析。該裝置埋置可多次抽取,并且可收集多個土壤斷面(橫/豎)溶液,具有不會擾動、損傷根系和土壤環(huán)境、操作簡單、價格低廉的優(yōu)點。該裝置還用于土壤重金屬遷移的研究。

為了解根際分泌物不同距離對外源污染物的降解效果,并對根際分泌物進行原位收集,何艷設計了利用特殊的層片根箱的水平多層法,如圖2所示。根際培養(yǎng)箱大小為150mmx140mmx230mm;分為三個區(qū)域:根系生長室(中室),寬20mm,根系生長區(qū);左右兩邊的根際室,60mm寬,根際室又被分成6個室,包括1mm、2mm、3mm、4mm、5mm的近根區(qū),>5mm的遠根區(qū),每個室用尼龍網分隔(根系生長室>遠根際室,而沒有根系的土壤PCP濃度在各個土壤位置相同,和非根際土壤相比,根際附近的土壤通過增加土壤微生物量、磷酸酶和尿素酶等的活性來增強對PCP的降解能力。He等用同樣的裝置,調查了黑麥草在根際利用磷脂脂肪酸(PLAF)含量,反映根際微生物群落在毫米范圍內,說明根際表面距離對PCP的非線性降解機制。He等利用相同的裝置證實,不同于根分泌物和礦物營養(yǎng)物質隨根際表面距離的增加呈線性的逐漸減少,PCP變化呈非線性規(guī)律,并且快速消失是在離根際2mm或3mm的根際層。根際土壤的原位采集用水平多隔層法效果較好,能較為準確地反應根際周圍不同距離根際分泌物的情況。

原位收集應該注意防止培養(yǎng)容器、收集裝置被細菌污染,對培養(yǎng)液循環(huán)的流速要嚴格控制。

3、根分泌物有機酸的分離及后續(xù)處理

根分泌物成分比較復雜,需進行分離預處理后才能用于檢測和分析。

3.1、萃取法

萃取法是利用有機酸和其他物質在溶劑中不同分配能力,而實現分離和純化。徐婉明等用CH2Cl2萃取了根分泌物,其方法是提取15mL的根分泌物,然后加入等體積的CH2Cl2來提取根,再將CH2Cl2過0.45m膜,于旋轉蒸發(fā)儀上45℃減壓至干,加入CH2Cl22mL,以備GC-MS分析。在對橡膠樹幼苗根分泌物進行測定時,王文斌等先將過濾液用45mL乙酸乙酯(EAC)萃取得到中性成分,然后用1mol/LHCl將水相pH值調節(jié)到3,用45mLEAC萃取得到酸性成分,最后用1mol/LNaOH將水相調節(jié)pH值到8,用45mLEAC萃取后得到堿性組分,在減壓條件下分別將酸性、堿性和中性(原液)的EAC萃取液濃縮至1mL(35℃),用于GC-MS測定分析。

3.2、樹脂法

樹脂法分為交換樹脂法和吸附樹脂法兩種。交換樹脂法是利用各種有機酸之間極性差異,使用特定填料作為固定相,并且根據固定相上各組分的交換能力差異實現分離。吸附樹脂法利用吸附樹脂吸附、富集有機酸,以實現分離和純化。

尤江峰等在研究脫落酸在鋁脅迫下調控有機酸分泌機理時,溶液通過裝有5gH+型陽離子交換樹脂(AmberliteIR-120B型)的陽離子交換柱(16mmx14mm),然后通過裝有2.5gAG1-X8型陰離子交換樹脂(100-200目,甲酸型)的陰離子交換柱(16mmx14mm),控制流速保證過柱時間約為3h,從而完全吸附。再用1mol/LHCl(10mL)分3次洗脫陰離子樹脂,然后收集洗脫液到蒸餾瓶中,在40℃條件下將洗脫液旋轉蒸發(fā)至干后定容,用反相高效液相色譜(RP-HPLC)測定有機酸種類、含量。Tu等用樹脂膜法提取和分離在蜈蚣草和波士頓蕨在As脅迫下的根分泌物低分子量有機酸,成功地分離出了植酸和草酸。在研究越橘根分泌物中有機酸時,李學淳等將濃縮后的溶液先流過732型陽離子交換樹脂柱,用去離子水洗脫后,通過低溫旋轉蒸發(fā)濃縮,然后通過717型陰離子交換樹脂柱,用1mol/L的HCl洗脫有機酸,將洗脫液在低溫濃縮至微量后用pH值為2.1的HClO4溶液定容至1.00mL后,用于高效液相色譜(HPLC)分析。

楊建峰等用HPD-400型大孔吸附樹脂比較蘋果酸、檸檬酸和酒石酸在水溶液中的吸附能力,結果表明,HPD-400型大孔吸附樹脂在相同條件下吸附能力強弱依次是檸檬酸>蘋果酸>酒石酸,均符合Freundlich等溫吸附方程。李勇等測定有機酸是將第3次換下的溶液以25mL/min的流速通過XAD-4大孔吸附樹脂柱,用去離子水沖洗多次,再用300mL甲醇洗脫吸附在XAD-4大孔吸附樹脂柱上的分泌物組分,在旋轉蒸發(fā)儀上洗脫液在50℃減壓條件下濃縮至微量后,轉入5mL儲液瓶后減壓濃縮至干后,于-20℃保存用以GC-MS測定。研究鋁脅迫下誘導決明子分泌特定檸檬酸時,Ma等用樹脂法對有機酸進行分離時是將溶液先通過5gAmberliteIR-120B型陽離子交換樹脂的陽離子交換柱,然后通過內裝2gDovex1x8陰離子樹脂的陰離子交換柱,再用10mL1mol/LHCl洗脫陰離子樹脂上的保留物,減壓濃縮干后,用HClO4溶解定容,以備HPLC分析。

樹脂法是分離有機酸常用的方法,實用性強、吸附容量高,對低濃度有機酸具有良好吸附效果,脫附再生容易,穩(wěn)定性好,使用壽命長,操作簡單,可脫附再生,無二次污染。

3.3、層析法

層析法是通過利用固定相和流動相中組分的分配平衡常數的差異,在固定相中經反復平衡后分離組分的方法。李德華等比較研究了有機酸采用DEAE纖維素層析柱和陰離子交換樹脂層析柱的分離效果,結果表明,DEAE纖維素層析柱比陰離子交換樹脂層析柱具有更好的分離效果,各有機酸的回收率在93.7%～102.3%。利用層析法在玉米根分泌物中分離并檢測出檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、乙酸、馬來酸等。

4、有機酸的鑒定和檢測技術

分析測定有機酸的方法包括色譜法、毛細管電泳法、比色法、分光光度法和酶法等。但根分泌物中物質很復雜,且有機酸含量很低,有機酸的鑒定和檢測很困難,這里主要介紹色譜法和毛細管電泳(CE)。

4.1、高效液相色譜法(HPLC)

HPLC對低分子有機酸測定分離效果好,靈敏度高,分析速度快,測定準確,并且能連續(xù)進樣,操作方便,因此在有機酸測定方面運用廣泛。HPLC測定的有機酸包括:乙酸、草酸、丙二酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸、馬來酸、乙醇酸、富馬酸等。HPLC的測定條件基本一致,色譜柱C18反相柱,4.6mmx250mm,5m,流動相是20～25mmol/L的KH2PO4溶液,用H3PO4調節(jié)pH值到2.5左右,流速0.5～1Ml/min,檢測波長210～220nm,柱溫30℃,進樣量為10mL。為保持柱效,樣品的測定時間應比標準品的測定時間長,使色譜柱里的各種物質充分洗脫,使下一樣品的測定不受影響。施積炎等用HPLC分析測定了根分泌物中的草酸、檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸等。

HPLC分離過程中,硝酸、硫酸等無機酸易干擾有機酸的分離,俞樂等在流動相中添加了配對的離子四丁基硫酸銨(TBA),并延長草酸停留時間,消除了無機酸的干擾。為保證測定質量,田中民等在測定缺磷情況下根分泌的有機酸時,每測10個樣品加測1次標準品,對難以確定有機酸的吸收峰,改變流動相的pH值和流速。

4.2、氣質聯用法(GC-MS)

GC-MS是以氣體作為流動相,測試樣能在流動相和固定相間瞬間平衡,分離效率高,并能同時測定多種有機酸,且對樣品需求量小、靈敏度高,能對有機酸有效鑒定。有機酸的測定條件基本一致,毛細管柱為30mmx0.25mmx0.25m,進樣1L,進樣口溫度為250℃,載氣為He,離子源:EI+,70eV,掃描范圍30～600amu,離子源溫度230℃。

檢測出來的物質不僅包括有機酸酸,還有醇類、脂肪酸、酚酸、酮類、烷烴等,但對熱穩(wěn)定性差的草酸、檸檬酸等卻不能檢測出來。所以對于熱穩(wěn)定性差、易于分解的有機酸,需在測定之前進行衍生化,如甲酯化。李勇等在檢測根分泌物時,向1.5mL樣品中加入足量的CaCl2,75℃下放置1h,確保樣品徹底干燥,再在樣品中加入250L硅烷化試劑,75℃衍生化1.5h再進行GC-MS的測定。

4.3、熒光光譜分析法

熒光光譜分析法測定植物根分泌物的種類,具有操作簡便、快速、高效的優(yōu)點。陸松柳等用此法檢測了三種濕地植物美人蕉、茭白、水柳的根分泌物,主要為小分子有機酸和芳香族蛋白質。

4.4、毛細管電泳法

毛細管電泳(CE)是一種強大的非分離技術,樣品盒溶劑具有用量少、毛細管便宜、更換簡單的優(yōu)點,可快速、準確地測定植物根系土壤中的有機酸。但和其他方法相比,其靈敏度和重現性相對較差。

大部分低分子有機酸以離子形式存在于中性介質中,因此采用毛細管區(qū)帶電泳模式較多,影響分離的因素主要是電解質溶液的pH值、類型、電滲流改性劑和添加劑。Mala等人利用含有染料的電解質溶液和圖層毛細管分離并測定了丙二酸、檸檬酸、富馬酸。徐根娣等用CE分離、測定出了大豆根分泌物中的草酸、檸檬酸和琥珀酸。林琦等在研究根分泌物與重金屬間的化學行為時,用CE測定了煙草和玉米分泌物中的有機酸、糖類、氨基酸。

5、研究展望

由于技術上的困難,對根分泌物的機理研究大都局限于外在的根分泌物種類和含量,分泌物是由哪些特定的細胞(根冠、側根、表皮細胞、根毛細胞)分泌出的不詳,對其內在分泌機理的研究較少。更深一層的機理研究需要更精密的儀器和實驗設計來揭示。根際土壤和微生物之間的關系,應多利用分子技術、基因工程、同位素跟蹤法等方法來研究內在機理。

大部分植物的培養(yǎng)和收集都是采用水培或砂培,使根際生長條件和實際情況差異較大,忽視了土壤微生物、動物及土壤溫度等的影響。應多考慮實際情況,采用與實際土壤差別較小的實驗方案,從而反映根分泌物與土壤之間的真實關聯。

針對污染物的降解或重金屬的吸收,是分泌物在起主要作用,還是其周圍微生物的作用,還是二者協(xié)同作用的結果,仍需考證。

對根分泌有機酸的研究大多限于理論方面,實際運用較少。應多加研究,以利用特定分泌物的理化性質、外源添加提高植物對重金屬的吸收或抵御、對有毒化合物的去除和妨害。

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