GB-T微生物快速測定方法征求意見稿

ICS07.080

A20/39

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—XXXX

微生物快速測定方法

Rapiddeterminationofmicroorganisms

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

國家市場監(jiān)督管理總局

發(fā)布

中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會

GB/TXXXXX—XXXX

I

GB/TXXXXX—XXXX

微生物快速測定方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物快速測定分子馬達(dá)法和紅外免疫層析法的原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、測定

步驟、結(jié)果分析。

本標(biāo)準(zhǔn)中分子馬達(dá)法適用于單增李斯特菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、志賀

氏菌、甲型肝炎病毒的快速測定，紅外免疫層析法適用于進(jìn)出口食品中單增李斯特菌、副溶血弧菌、霍

亂弧菌、沙門氏菌、輪狀病毒、諾如病毒、甲型肝炎病毒的快速測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB19489實驗室生物安全通用要求

SN0330出口食品中微生物學(xué)檢驗通則

SN/T2424進(jìn)出口食品中副溶血性弧菌快速及鑒定檢測方法實時熒光PCR方法。

第一法分子馬達(dá)法

3原理

利用熒光探針DHPE標(biāo)記的載色體Chromatophore上的F0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器。生物傳感器

的設(shè)計基于其催化ATP合成過程中伴隨著H+的跨膜轉(zhuǎn)運。研究發(fā)現(xiàn)在ATP合酶ε亞基上連接不同分子量的

負(fù)載時，可以不同程度影響其質(zhì)子轉(zhuǎn)運。根據(jù)這一原理，以熒光探針DHPE標(biāo)記的chromatophore為材料

建立一個超靈敏的生物傳感器并用它檢測病原微生物。首先在chromatophore膜外標(biāo)上對pH敏感的熒光

探針DHPE用于表征ATP合成引起的質(zhì)子轉(zhuǎn)運，然后在ATP合酶的ε亞基連接上ε亞基抗體-生物素-鏈霉親

和素-生物素-核酸探針；將待測樣品和陰性對照分別與生物傳感器結(jié)合的同時啟動ATP合成，20~30分鐘

后比較其熒光強度的差別，可以對樣品中的食源性病原菌進(jìn)行檢測。

4試劑或材料

除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。

4.1水：GB/T6682二級。

4.2分子馬達(dá)生物傳感器檢測試劑盒：見附錄A。

5

GB/TXXXXX—XXXX

4.3細(xì)菌DNA提取試劑盒（商業(yè)）。

4.4緩沖蛋白胨水（BPW）。

4.5四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液。

4.6亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液。

4.7亞硫酸鉍（BS）瓊脂。

4.8HE瓊脂。

4.9木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂。

4.10胰蛋白胨大豆（TSA）瓊脂。

4.11甘氨酸緩沖液。

4.12PEG8000沉降液。

4.13甲肝減毒活疫苗：作為陽性對照添加于已知的食品中制成陽性質(zhì)控樣品。

5儀器設(shè)備

5.1恒溫培養(yǎng)箱：36±1℃。

5.2微量加樣器：單道20mL，50mL，100mL，1000mL；多道50～250mL）。

5.3電子天平，感量0.01g。

5.4熒光光譜儀。

5.5化學(xué)發(fā)光檢測儀。

6測定步驟

6.1取樣

貝類樣品：用滅菌蒸餾水將貝殼表面的污泥清洗十凈，打開貝殼后，倒掉腔內(nèi)的液體,使用滅菌消

毒的剪刀和鑷子取貝的消化道組織，均質(zhì)。

蝦類：用清水將蝦外表徹底洗凈，剝?nèi)ノr頭、皮和腿，用重蒸水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來物，

均質(zhì)。

魚類：用清水將魚外表徹底洗凈，剝?nèi)?nèi)臟、頭、鰓和皮，同重蒸水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來

物，均質(zhì)。

禽肉類：新鮮禽肉用清水淋洗表面，再用重蒸水淋洗，均質(zhì)。

加工品：蒸煮后冷凍或鮮凍品，在室溫下，使冷凍的樣品呈半冷凍狀態(tài)，使用6.2.1～6.2.4的方法

取試樣，均質(zhì)。

6.2樣品增菌及細(xì)菌分離

5

GB/TXXXXX—XXXX

樣品制備、增菌培養(yǎng)及細(xì)菌分離參照GB4789.3進(jìn)行。最后從BS、HE或XLD平板上挑取可疑菌落轉(zhuǎn)接

到TSA瓊脂上，36°C±1°C培養(yǎng)24h，用于DNA的提取。

6.3樣品保存

上述6.2中經(jīng)均質(zhì)處理的樣品如不能及時檢測，可取100g已均質(zhì)試樣置于4℃冷藏保存（盡可能及

時檢驗）。

6.4測定

見附錄B。

7結(jié)果及判定

見附錄F。

第二法紅外免疫層析法

8原理

近紅外免疫層析技術(shù)是將近紅外熒光與免疫層析法相結(jié)合的一種新型側(cè)向流技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)采用近紅

外熒光染料dylight800標(biāo)記的雙抗體夾心免疫層析試紙條檢測食源性致病菌或病毒。當(dāng)含有食源性致病

菌或病毒的樣品滴加到樣品墊上時，溶液將結(jié)合墊上固定的分子解離，靶標(biāo)致病菌或靶標(biāo)病毒與解離出

來的熒光標(biāo)記致病菌或病毒單抗形成復(fù)合物?？乖贵w復(fù)合物隨溶液向試紙條前端遷移，當(dāng)抗原抗體復(fù)

合物遷移至檢測線時，被固定于檢測線上的致病菌或病毒多克隆抗體捕獲。而游離的單抗分子/抗原抗

體復(fù)合物則隨溶液繼續(xù)遷移，到達(dá)質(zhì)控線時被交聯(lián)于質(zhì)控線上的參照物抗體所捕獲。檢測時采用專用便

攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別掃描質(zhì)控線和檢測線，以檢測線熒光強度檢測值對應(yīng)的目標(biāo)物的濃度

可以判斷樣品呈陽性還是陰性，并且可以定量檢測，能夠?qū)δ繕?biāo)檢測物濃度進(jìn)行定量分析。

9試劑或材料

9.1熒光染料dylight800

9.2緩沖蛋白胨水

9.3羊抗雞免疫球蛋白IgY

9.4磷酸緩沖鹽溶液PBS

9.5牛血清白蛋白BSA

9.6免疫球蛋白IgG

10儀器與設(shè)備

5

GB/TXXXXX—XXXX

10.1超聲破碎儀。

10.2便捷式高靈敏度近紅外點熒光掃描儀。

10.3近紅外免疫層析法檢測試紙條：見附錄D。

11測定步驟

11.1取樣

樣品采集數(shù)量和采集方法按SN0330進(jìn)行。

11.2樣品制備

11.2.1食源性致病菌

取食品樣品25g,用225mL含5%BSA，0.1%Tween20的PBS緩沖液稀釋樣品，取上清液作為檢樣，

吸取1ml上清液至EP管中，超聲破菌，∮3探頭，工作5s，休息15s，屏幕顯示能量為40%，共計30

次循環(huán)。

11.2.2食源性病毒

貝類、海螺絲、蟶子等前處理方法分別按照GB/T22287、SN/T2520、SN/T1635進(jìn)行

11.3測定

11.4見附錄E。

11.5測定

見附錄E。

12結(jié)果及判定

見附錄F。

5

GB/TXXXXX—XXXX

AA

附錄A

（資料性附錄）

試劑和培養(yǎng)基

A.1分子馬達(dá)生物傳感器試劑盒組成

表A.1分子馬達(dá)生物傳感器試劑盒組成

編號組分名稱數(shù)量儲存條件

1Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR20μL﹣20℃

合成buffer（0.1mMTricine，10%甘油，5mMNaH2PO4，

210mL室溫

5mMMgCl2，pH9.0）

3ADP（1.6mol/L）1mL﹣20℃

1×PBS（137mMNaCL，2.7mMKCL，10mMNa2HPO4，

425mL室溫

2mMKH2PO4，pH7.0。）

5熒光素酶/熒光素100U﹣20℃

6熒光素酶/熒光素重組緩沖液12mL﹣20℃

7無菌水5mL室溫

A.2緩沖蛋白胨水（BPW）

A.2.1成分

蛋白胨17.0g

氯化鈉3.0g

磷酸氫二鈉（含12個結(jié)晶水）9.0g

磷酸氫二鉀2.5g

蒸餾水1000mL

pH7.2±0.2

A.2.2制法

將各成分加入蒸餾水中，攪混均勻，靜置約10min，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH，121℃高壓滅菌15min。

A.3四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液

5

A.3.1基礎(chǔ)液

蛋白胨10.0g

氯化鈉3.0g

碳酸鈣45.0g

蒸餾水1000mL

pH7.0±0.2

除碳酸鈣外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，再加入碳酸鈣，調(diào)節(jié)pH，121℃高壓滅菌20min。

硫代硫酸鈉溶液

硫代硫酸鈉（含5個結(jié)晶水）50g

蒸餾水加至100mL

高壓滅菌121℃，20min。

A.3.2碘溶液

碘片20.0g

碘化鉀25.0g

蒸餾水加至100mL

將碘化鉀充分溶解于少量的蒸餾水中，再投入碘片，振搖玻瓶至碘片全部溶解為止，然后加蒸餾水

至規(guī)定的總量，貯存于棕色瓶內(nèi)，塞緊瓶蓋備用。

A.3.30.5%煌綠水溶液

煌綠0.5g

蒸餾水100mL

溶解后，存放暗處，不少于1d，使其自然滅菌。

A.3.4牛膽鹽溶液

牛膽鹽10.0g

蒸餾水100mL

加熱煮沸至完全溶解，高壓滅菌121℃，20min。

A.3.5制法

基礎(chǔ)液900mL

硫代硫酸鈉溶液100mL

碘溶液20.0mL

煌綠水溶液2.0mL

牛膽鹽溶液50.0mL

臨用前，按上列順序，以無菌操作依次加入基礎(chǔ)液中，每加入一種成分，均應(yīng)搖勻后再加入另一種

成分。

A.4亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液

A.4.1成分

7

蛋白胨5.0g

乳糖4.0g

磷酸二氫鈉10.0g

亞硒酸氫鈉4.0g

L-胱氨酸0.01g

蒸餾水1000mL

pH7.0±0.2

A.4.2制法

除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以無菌操作加入

亞硒酸氫鈉和1g/LL-胱氨酸溶液10mL（稱取0.1gL-胱氨酸，加1mol/L氫氧化鈉溶液15mL，使溶

解，再加無菌蒸餾水至100mL即成，如為DL-胱氨酸，用量應(yīng)加倍）。搖勻，調(diào)節(jié)pH。亞硫酸鉍（BS）

瓊脂

A.4.3成分

蛋白胨10.0g

牛肉膏5.0g

葡萄糖5.0g

硫酸亞鐵0.3g

磷酸氫二鈉4.0g

0.025g或5.0g/L水溶液5.0

煌綠

mL

檸檬酸鉍銨2.0g

亞硫酸鈉6.0g

瓊脂18.0-20g

蒸餾水1000mL

pH7.5±0.2

A.4.4制法

將前三種成分加入300mL蒸餾水（制作基礎(chǔ)液），硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉分別加入20mL和30mL

蒸餾水中，檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉分別加入另一20mL和30mL蒸餾水中，瓊脂加入600mL蒸餾水中。

然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。冷至80℃左右時，先將硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉混勻，倒入基礎(chǔ)液中，混

勻。將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉混勻，倒入基礎(chǔ)液中，再混勻。調(diào)節(jié)pH，隨即傾入瓊脂液中，混合均勻，

冷至50℃-55℃。加入煌綠溶液，充分混勻后立即傾注平皿。

A.5HE瓊脂（HektoenEntericAgar）

A.5.1成分

蛋白胨12.0g

牛肉膏3.0g

蔗糖12.0g

7

乳糖12.0g

水楊素2.0g

瓊脂18.0-20.0g

蒸餾水1000mL

0.4%溴麝香草酚藍(lán)溶液16.0mL

Andrade指示劑20.0mL

甲液20.0mL

乙液20.0mL

pH7.5±0.21000mL

A.5.2制法

將前面七種成分溶解于400mL蒸餾水內(nèi)作為基礎(chǔ)液；將瓊脂加入于600mL蒸餾水內(nèi)。然后分別攪

拌均勻，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基礎(chǔ)液內(nèi)，調(diào)節(jié)pH。再加入指示劑，并與瓊脂液合并，待冷至

55℃-55℃傾注平皿。

注：1.本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避免降低其選擇性。

2.甲液的配制

硫代硫酸鈉34.0g

檸檬酸鐵銨4.0g

蒸餾水100mL

3.乙液的配制

去氧膽酸鈉10.0g

蒸餾水100mL

4.Andrade指示劑

酸性復(fù)紅0.5g

1mol/L氫氧化鈉溶液16.0mL

蒸餾水100mL

將復(fù)紅溶解于蒸餾水中，加入氫氧化鈉溶液。數(shù)小時后如復(fù)紅褪色不全，再加入氫氧化鈉溶液1-2

mL。

A.6木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂

A.6.1成分

酵母膏3.0g

L-賴氨酸5.0g

木糖3.75g

乳糖7.5g

蔗糖7.5g

去氧膽酸鈉2.5g

檸檬酸鐵銨0.8g

硫代硫酸鈉6.8g

氯化鈉5.0g

瓊脂15.0g

7

酚紅0.08g

蒸餾水1000mL

pH7.4±0.2

A.6.2制法

除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400mL蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。另將瓊脂加入600mL蒸

餾水中，煮沸溶解。

將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑，待冷至50℃-55℃傾注平皿。

注：本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避免降低其選擇性，貯于室溫暗處。本培養(yǎng)基宜于當(dāng)

天制備，第二天使用。

A.7胰蛋白胨大都（TSA）瓊脂

A.7.1成分

胰蛋白胨15.0g

大豆蛋白胨5.0g

瓊脂3.5g

蒸餾水1000mL

A.7.2制法

將上述各成分混合，加熱并輕輕攪拌至溶解，121℃高壓滅菌15min，調(diào)節(jié)pH7.3±0.2。

7

BB

附錄B

（資料性附錄）

操作步驟

B.1甲肝病毒檢測

B.1.1病毒的采集

稱取10g試樣(精確至0.1g)，樣品中加人70mL甘氨酸緩沖液(樣品質(zhì)量與緩沖液體積之比為1:7)，

紐織勻漿器中充分破碎混勻2min。取出勻漿液30mL，置37℃孵育30min.。于4℃,15000g，離心2

0min。收集上清液，加人等體積三氯甲烷，渦旋混勻1min，室溫放置5min，1700g，4℃，離心30

min。從上層液相取出15rnL上清液，加人等體積的PEG8000溶液(PEG終濃度為8%)，于4℃過夜沉降

病毒。10000g，4℃，離心5min。棄上清，保留沉淀進(jìn)行RNA提取。

B.1.2病毒RNA提取

向沉淀中加入6mol/L的異硫硫氰酸胍溶液1mL盡量使沉淀充分溶解，渦旋混勻，使用Qiagen的

QIAampViralRNAMiniKit或其他等效產(chǎn)品進(jìn)行RNA提取。按照廠家的試劑盒使用說明進(jìn)行操作。

B.1.3RNA的保存

制備好的RNA應(yīng)盡快進(jìn)行檢測。若暫時不能進(jìn)行檢測，應(yīng)與-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

B.1.4分子馬達(dá)生物傳感器對食品中甲肝病毒RNA進(jìn)行檢測

B.1.4.1取1.5mLEP管，加入待測樣本10μL。6.2將EP管放入95℃水浴5min，立即轉(zhuǎn)移至50℃水浴1

min。

B.1.4.2取2μLchroHAV，用合成buffer稀釋到一定的倍數(shù)。取稀釋后的chroHAV10μL加入上述E

P管中。

B.1.4.3向EP管中加入30μL啟動buffer，振蕩使反應(yīng)體系混勻，然后立即短暫離心以除去管蓋內(nèi)壁

上的水珠。

B.1.4.4將上述反應(yīng)體系放入37℃恒溫?fù)u床中溫育30min。將EP管從搖床中取出，分別加入450μL

PBS緩沖液，振蕩使體系混勻。

B.1.4.5將最終反應(yīng)體系加入到96孔板中，每個體系重復(fù)三孔，每孔加樣50μL，然后對每個加樣孔

分別加入30μL已配置好的熒光素酶溶液，用槍反復(fù)吹打幾次使體系混勻。

B.1.4.6設(shè)定儀器于450nm處，將96孔板上機檢測，測定熒光度值（OD值）。

B.1.5空白對照及本底對照試驗

B.1.5.1空白對照：在EP管中加入10μL無菌水作為空白對照，其他均完全按照6.1進(jìn)行。

B.1.5.2本底對照：在EP管中加入10μL無菌水作為本底對照，將EP管放入95℃水浴5min，立即轉(zhuǎn)移

至50℃水浴1min。再加入10μL合成buffer作為本底對照，短暫振蕩使反應(yīng)體系混勻。其他均完全按

照B.1進(jìn)行。

7

B.2單增李斯特菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、志賀氏菌檢測

B.2.1B.2.1細(xì)菌DNA提取

將培養(yǎng)獲得的可疑細(xì)菌用DNA提取試劑盒（商業(yè)）進(jìn)行提取，詳細(xì)操作步驟見試劑盒說明書。最

后獲得的離心管中的液體就是菌體的DNA提取液，用作分子馬達(dá)傳感器的目標(biāo)檢測物。

制備好的DNA樣品應(yīng)盡快進(jìn)行檢測。若暫時不能進(jìn)行檢測，應(yīng)置于冰箱中﹣20°C保存，使用時

置于室溫自然解凍，然后用振蕩器振蕩混勻。

B.2.2檢測

B.2.2.1取4個1.5mLEP管，各加入待測樣本10μL。將EP管放入沸水浴中加熱3min，然后立即轉(zhuǎn)移

到冰上至完全冷卻。

B.2.2.2分別取2μLChro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR，用合成buffer稀釋到一定的倍數(shù)。

取稀釋后的分型裝置分別加入上述EP管。

B.2.2.3陰性對照用10μL無菌水代替DNA提取液進(jìn)行。另取1個EP管加入10μL無菌水，沸水浴中加熱

3min，然后立即轉(zhuǎn)移到冰上至完全冷卻，再加入10μL合成buffer作為本底對照，短暫振蕩使反應(yīng)體

系混勻。

B.2.2.4向上述EP管中分別加入30μL啟動buffer（由ADP和上述合成buffer配置，體積比1：3），振

蕩使反應(yīng)體系混勻，然后立即短暫離心以除去管蓋內(nèi)壁上的水珠。將上述反應(yīng)體系放入37℃恒溫?fù)u床中

溫育30min，然后將EP管從搖床中取出，分別加入450μLPBS緩沖液，振蕩使體系混勻。

B.2.2.5取一塊干凈的96孔板，將各管中的最終反應(yīng)體系加入其中，每個體系加3孔，每孔加樣50μL，

然后對每個加樣孔分別加入30μL已配置好的熒光素酶溶液（將熒光素酶/熒光素重組緩沖液加入裝有

熒光素酶/熒光素的棕色玻璃瓶中，蓋上瓶塞，反復(fù)顛倒幾次混勻，不可振蕩。使用前應(yīng)將混合液在室

溫放置1h），用槍反復(fù)吹打幾次使體系混勻。

B.2.2.6將96孔板上機檢測，讀取各孔熒光值，然后用樣本數(shù)值減去本底數(shù)值即為樣本的實際熒光值。

7

CC

附錄C

（資料性附錄）

結(jié)果計算及表述

C.1甲肝病毒檢測

C.1.1計算百分比熒光差值

樣品的百分比熒光差值等于樣品的吸光度值平均值減去空白對照及本底對照的吸光度值除以樣品

的吸光度值與本底熒光值之差，再乘以100%（見式（1））。

BBOBHO

百分熒光差值（%）=2100%………………（C.1）

BBO

式中：

B——樣品熒光度值；

B0——空白熒光度值；

B1——本底熒光度值。

C.1.2結(jié)果表述

C.1.2.1樣品百分熒光差值大于10%，則為陽性。

C.1.2.2樣品百分熒光差值小于等于10%，則為陰性。

C.1.3結(jié)果判定

方法在食品中甲肝病毒RNA最低檢出濃度為0.01ng/mL。

C.2單增李斯特菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、志賀氏菌檢測

將樣本熒光值絕對值與H2O的陰性對照熒光值絕對值進(jìn)行單因素方差分析，若差異顯著（p＜0.05）

表示檢出該基因。

7

DD

附錄D

（規(guī)范性附錄）

近紅外免疫層析法檢測試紙條制備

D.1近紅外免疫層析法檢測單增李斯特氏菌試劑條

D.1.1近紅外免疫層析法檢測單增李斯特氏菌試紙條的結(jié)構(gòu)

圖D.1低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的單增李斯特菌免疫層析試紙條的側(cè)面示意圖

注：樣品墊；2：結(jié)合墊（含有近紅外熒光染料標(biāo)記抗體的玻璃纖維素膜）；3：抗體承載膜（硝酸纖維素膜）4：

檢測線；5：質(zhì)控線；6：吸水墊；7：反應(yīng)支撐介質(zhì)

如圖D.1，試紙條包括，底板7以及沿底板7的長度方向上依次粘附在底板上的樣品墊1、結(jié)合墊2、

抗體承載膜3和吸水墊6，且樣品墊1、結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6之間，依次與且僅與相鄰部位相

接觸且部分重疊；抗體承載膜3上粘附于底板7的中間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測線4的質(zhì)控線5，檢

測線4靠近結(jié)合墊2，質(zhì)控線5靠近吸水墊6。質(zhì)控線4與檢測線5平行設(shè)置，檢測線和質(zhì)控線間距0.5cm。

結(jié)合墊2上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標(biāo)記的可與單增李斯特菌特異性結(jié)合的單克隆抗體-鼠抗單增

李斯特菌單克隆抗體；檢測線4由可與所述單增李斯特菌特異性結(jié)合的多克隆抗體鼠抗單增李斯特菌多

克隆抗體涂層形成；質(zhì)控線5由與單增李斯特菌以及所述可與單增李斯特菌特異性結(jié)合的多克隆抗體均

無關(guān)的羊抗鼠IgG多克隆抗體涂層形成。低噪聲激發(fā)式熒光染料為發(fā)射波長為777nm，發(fā)射光波長為790nm

的NHS活化的低噪聲激發(fā)式熒光染料DyLight800作為熒光分子。

D.1.2近紅外免疫層析法檢測單增李斯特氏菌試紙條的制備

D.1.2.1將dylight800原液用PBS緩沖液稀釋10倍，取1.4μL與20μg單增李斯特菌單克隆抗體輕柔混

合均勻后于室溫避光反應(yīng)2小時。反應(yīng)結(jié)束后，將標(biāo)記產(chǎn)物放入透析袋中，用PBS4℃透析過夜，去除游

離的熒光染料。標(biāo)記好的抗體溶液中添加終濃度為1.5%BSA和0.15%Tween20,疊氮化鈉0.15‰，4℃保存。

使用前標(biāo)記產(chǎn)物以層析緩沖液稀釋20000倍；

D.1.2.2選取玻璃纖維素膜為結(jié)合墊2，在結(jié)合墊2上噴涂以層析緩沖液稀釋10000倍后的所述標(biāo)記產(chǎn)

物，然后室溫風(fēng)干，備用；

D.1.2.3選取纖維素膜為樣品墊1，使用含5%BSA，0.1%Tween20的PBS緩沖液噴涂在樣品墊1上，室溫

風(fēng)干后，備用；

D.1.2.4選取硝酸纖維素膜為抗體承載膜3，分別取單增李斯特菌多克隆抗體和羊抗鼠IgG多克隆抗體

用劃線機在抗體承載膜3上劃檢測線4和質(zhì)控線5，室溫風(fēng)干，備用。

7

D.1.3近紅外免疫層析法檢測單增李斯特氏菌試紙條的組裝

將上述步驟D.1獲得的樣品墊1、所述結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6沿底板7的長度方向上依次粘

附，具體為在底板7中間先鋪設(shè)抗體承載膜3，然后在抗體承載膜3的與質(zhì)控線5相臨近的一端鋪吸水墊6，

使吸水墊6與抗體承載膜3部分重疊，然后在抗體承載膜3的與檢測線4相臨近的一端鋪結(jié)合墊2，使抗體

承載膜3與結(jié)合墊2的一端部分重疊，隨后在結(jié)合墊2的另一端再部分重疊的鋪設(shè)樣品墊1，最后切割成

0.5cm寬，即得試紙條。

D.1.4實驗步驟

D.1.4.1樣品采集

樣品采集數(shù)量和采集方法按SN0330進(jìn)行。

D.1.4.2樣品制備

取食品樣品25g,用225mL含5%BSA，0.1%Tween20的PBS緩沖液稀釋樣品，取上清液作為檢樣，吸取

1ml上清液至EP管中，超聲破菌，∮3探頭，工作5s，休息15s，屏幕顯示能量為40%，共計30次循環(huán)。

D.1.4.3定性檢測

吸取100μL經(jīng)超聲處理的檢樣滴加到樣品墊1（圖D.1）上，待吸收干后再滴加50μL層析液，另取

所述緩沖液作為陰性對照，用低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的單增李斯特菌免疫層析試紙條進(jìn)行免疫層析，室

溫放置15min后，用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀讀數(shù)。

D.1.4.4定量檢測

13取105CFU/mL的單增李斯特菌純菌，用含5%BSA，0.1%Tween20，PBS稀釋液將所述純菌進(jìn)行

倍數(shù)系列稀釋，制成0.5×105CFU/mL、1×104CFU/mL、0.5×104CFU/mL、1×103CFU/mL、0.5×103CFU/mL、

1×102CFU/mL、10CFU/mL的樣品；依照5.2中方法進(jìn)行超聲破菌處理。吸取100μL以上樣本滴加到

樣品墊上，待樣品吸收后再滴加50μL層析液。室溫靜置10分鐘，將上述試紙條放入便攜式近紅外熒

光掃描儀中讀數(shù)。上述系列稀釋的單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行檢測，掃描獲得檢測線和質(zhì)控線的熒

光值，同時出現(xiàn)檢測區(qū)域熒光峰和質(zhì)控區(qū)域熒光峰方表明反應(yīng)正常。每個稀釋度樣本平行測量兩次，取

平均值作為測量值，以該值相應(yīng)的樣品濃度作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

D.1.5結(jié)果及判定

D.1.5.1定性檢測結(jié)果及判定

用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別測定檢測線4和質(zhì)控線5（圖D.1）區(qū)域的熒光強度，若所

述質(zhì)控線5區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述檢測線4區(qū)域同時出現(xiàn)熒

光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果（圖D.2），反之則為陰性。

7

圖D.2單增李斯特氏菌檢測陽性結(jié)果圖

D.1.5.2定量檢測結(jié)果

被測樣品按D.1.4.4操作進(jìn)行定量檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計算出被檢樣中單增李斯特氏菌的濃度。

D.2副溶血弧菌免疫層析試紙條

試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜、吸水墊及反應(yīng)支持基質(zhì)組成，按次序依次搭接，而后以切

割機切成試紙條。結(jié)合墊：選取玻璃纖維素膜，噴涂上述稀釋好的標(biāo)記抗體，室溫風(fēng)干。樣品墊：選取

纖維素膜帶，將封閉液（5%BSA，0.1%Tween20，PBS)噴灑在膜帶上，室溫風(fēng)干后備用。抗體承載膜：選

取硝酸纖維素膜，將副溶血弧菌捕獲多克隆抗體和羊抗鼠IgG多克隆抗體用劃線機在膜上劃檢測線和質(zhì)

控線，間距0.5cm，室溫風(fēng)干。

試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜、吸水墊及反應(yīng)支持基質(zhì)組成。樣品墊為玻璃纖維素膜；結(jié)

合墊是噴涂了近紅外熒光染料標(biāo)記的O1群小川型霍亂弧菌單克隆抗體的玻璃纖維素膜；抗體承載膜為

硝酸纖維素膜；檢測線上包被了O1群小川型霍亂弧菌多克隆抗體；質(zhì)控線上包被了羊抗鼠IgG多克隆抗

體；吸水墊為吸水紙；反應(yīng)支撐介質(zhì)為PVC膜。其結(jié)構(gòu)見圖D.1。

D.2.1O1群小川型霍亂弧菌菌懸液

取1.0×106CFU/mL的O1群小川型霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，用含5%BSA，0.1%Tween20的PBS稀釋液將

純菌進(jìn)行倍數(shù)系列稀釋，制成不同濃度的O1群小川型霍亂弧菌菌懸液。

D.3霍亂弧菌免疫層析試紙條

試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜、吸水墊及反應(yīng)支持基質(zhì)組成。樣品墊為玻璃纖維素膜；結(jié)

合墊是噴涂了近紅外熒光染料標(biāo)記的O1群小川型霍亂弧菌單克隆抗體的玻璃纖維素膜；抗體承載膜為

硝酸纖維素膜；檢測線上包被了O1群小川型霍亂弧菌多克隆抗體；質(zhì)控線上包被了羊抗鼠IgG多克隆抗

體；吸水墊為吸水紙；反應(yīng)支撐介質(zhì)為PVC膜。其結(jié)構(gòu)見圖D.1?；诘驮肼暭ぐl(fā)式熒光標(biāo)記的O1群小

7

川型霍亂弧菌免疫層析試紙條，低噪聲激發(fā)式熒光染料為發(fā)射波長為650-1100nm。優(yōu)選的，基于低噪聲

激發(fā)式熒光標(biāo)記的染料為發(fā)射波長為777nm，發(fā)射光波長為790nm的熒光分子。

D.4沙門氏菌免疫層析試紙條

D.4.1沙門氏菌免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)

如圖D.1結(jié)合墊2上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標(biāo)記的可與沙門氏菌特異性結(jié)合的單克隆抗體鼠

抗沙門氏菌單克隆抗體；檢測線4由可與沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗體鼠抗沙門氏菌多克隆抗體鼠

抗沙門氏菌多克隆抗體涂層形成；質(zhì)控線5由與沙門氏菌以及可與沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗體均

無關(guān)的羊抗鼠IgG多克隆抗體涂層形成。由此，低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條制備

完成。

D.4.2沙門氏菌免疫層析試紙條制備

D.4.2.1取以pH為7.4的PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式熒光染料，染料與沙門氏菌單克隆抗

體以1:2質(zhì)量比混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2h，隨后將所得的標(biāo)記產(chǎn)物放入含有PBS緩沖液的透析

袋中，4℃透析4h，向所述標(biāo)記好的標(biāo)記產(chǎn)物中添加終濃度為1.5%BSA、0.15%Tween20和0.15‰疊氮

化鈉，4℃保存，備用；在玻璃纖維素膜結(jié)合墊上噴涂以層析緩沖液稀釋1000倍后的上述步驟中的所

述標(biāo)記產(chǎn)物，然后室溫風(fēng)干，備用；

D.4.2.2使用含5%BSA，0.1%Tween20的PBS（pH7.4）緩沖液噴涂在所述纖維素膜樣品墊，室溫風(fēng)干

后，備用；

D.4.2.3分別取所述沙門氏菌多克隆抗體和所述與沙門氏菌以及可與沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗

體均無關(guān)的抗體用劃線機在硝酸纖維素抗體承載膜上劃所述檢測線和所述質(zhì)控線，室溫風(fēng)干，備用；

D.5諾如病毒免疫層析試紙條

D.5.1制作結(jié)合墊

選取玻璃纖維素膜為結(jié)合墊，在其上噴涂上述稀釋的標(biāo)記抗體，室溫風(fēng)干。

D.5.2制作樣品墊

選取纖維素膜帶，將封閉液（5%BSA，0.1%Tween20，PBS）噴涂在膜帶上，室溫風(fēng)干后備用。

D.5.3抗體承載膜

選取硝酸纖維素膜，將兔抗諾如病毒多克隆抗體（劃膜抗體）1.5mg/mL和羊抗雞IgY多克隆抗體用

劃線機在膜上劃檢測線和質(zhì)控線，二者間距0.5cm，室溫風(fēng)干。

D.5.4組裝免疫層析試紙條

將樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜、吸水墊及反應(yīng)支持基質(zhì)按圖D.1所示方式依次搭接，而后以切割

機切成試紙條。

D.6輪狀病毒免疫層析試紙條

7

D.6.1制作結(jié)合墊

選取玻璃纖維素膜為結(jié)合墊，在其上噴涂上述稀釋的標(biāo)記抗體，室溫風(fēng)干。

D.6.2制作樣品墊

選取纖維素膜帶，將封閉液（5%BSA，0.1%Tween20，PBS）噴涂在膜帶上，室溫風(fēng)干后備用。

D.6.3抗體承載膜

選取硝酸纖維素膜，將羊抗甲肝病毒多克隆抗體（劃膜抗體）1.5mg/mL和羊抗雞IgY多克隆抗體用劃

線機在膜上劃檢測線和質(zhì)控線，二者間距0.5cm，室溫風(fēng)干。

D.6.4組裝免疫層析試紙條

將樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜、吸水墊及反應(yīng)支持基質(zhì)按圖D.1所示方式依次搭接，而后以切割機

切成試紙條。

D.7甲型肝炎病毒的快速檢測

D.7.1制作結(jié)合墊

選取玻璃纖維素膜為結(jié)合墊，在其上噴涂上述稀釋的標(biāo)記抗體，室溫風(fēng)干。

D.7.2制作樣品墊

選取纖維素膜帶，將封閉液（5%BSA，0.1%Tween20，PBS）噴涂在膜帶上，室溫風(fēng)干后備用。

D.7.3抗體承載膜

選取硝酸纖維素膜，將羊抗甲肝病毒多克隆抗體（劃膜抗體）1.5mg/mL和羊抗雞IgY多克隆抗體用劃

線機在膜上劃檢測線和質(zhì)控線，二者間距0.5cm，室溫風(fēng)干。

D.7.4組裝免疫層析試紙條

將樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜、吸水墊及反應(yīng)支持基質(zhì)按圖D.1所示方式依次搭接，而后以切割機

切成試紙條。

7

EE

附錄E

（規(guī)范性附錄）

試驗方法

E.1近紅外免疫層析法檢測單增李斯特氏菌

E.1.1樣品采集

樣品采集數(shù)量和采集方法按SN0330進(jìn)行。

E.1.2樣品制備

取食品樣品25g,用225mL含5%BSA，0.1%Tween20的PBS緩沖液稀釋樣品，取上清液作為檢樣，吸取

1ml上清液至EP管中，超聲破菌，∮3探頭，工作5s，休息15s，屏幕顯示能量為40%，共計30次循環(huán)。

E.1.3定性檢測

吸取100μL經(jīng)超聲處理的檢樣滴加到樣品墊1（圖D.1）上，待吸收干后再滴加50μL層析液，另取

所述緩沖液作為陰性對照，用低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的單增李斯特菌免疫層析試紙條進(jìn)行免疫層析，室

溫放置15min后，用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀讀數(shù)。

E.1.4定量檢測

14取105CFU/mL的單增李斯特菌純菌，用含5%BSA，0.1%Tween20，PBS稀釋液將所述純菌進(jìn)行

倍數(shù)系列稀釋，制成0.5×105CFU/mL、1×104CFU/mL、0.5×104CFU/mL、1×103CFU/mL、0.5×103CFU/mL、

1×102CFU/mL、10CFU/mL的樣品；依照5.2中方法進(jìn)行超聲破菌處理。吸取100μL以上樣本滴加到

樣品墊上，待樣品吸收后再滴加50μL層析液。室溫靜置10分鐘，將上述試紙條放入便攜式近紅外熒

光掃描儀中讀數(shù)。上述系列稀釋的單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行檢測，掃描獲得檢測線和質(zhì)控線的熒

光值，同時出現(xiàn)檢測區(qū)域熒光峰和質(zhì)控區(qū)域熒光峰方表明反應(yīng)正常。每個稀釋度樣本平行測量兩次，取

平均值作為測量值，以該值相應(yīng)的樣品濃度作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

E.2近紅外免疫層析法檢測副溶血弧菌

E.2.1樣品采集

15樣品采集數(shù)量和采集方法按SN0330進(jìn)行。

E.2.2樣品制備

樣品制備方法按SN/T2424-2010進(jìn)行。

E.2.3細(xì)菌培養(yǎng)

7

將-80℃保存的副溶血弧菌劃線接種于SS瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)18h后挑取典型單菌落

接種于液體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18h。

E.2.4近紅外熒光染料標(biāo)記副溶血弧菌單抗

將dylight800原液用PBS緩沖液稀釋10倍，取1.4μL與20μg副溶血弧菌單克隆抗體（上?；?/p>

耘生物科技有限公司）輕柔混合均勻后于室溫避光反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，將標(biāo)記產(chǎn)物放入透析袋中，

用PBS4℃透析過夜，去除游離的熒光染料。標(biāo)記好的抗體溶液中添加終濃度為1%BSA和0.1%Tween20，

疊氮化鈉0.1‰，4℃保存。使用前標(biāo)記產(chǎn)物以層析緩沖液稀釋10000倍。

E.2.5定性檢測

取副溶血弧菌稀釋液，吸取1ml樣本至7mlPBS緩沖液中，超聲破菌，工作15s，休息15s，40%

能量，共計30次循環(huán)。吸取100μL經(jīng)超聲處理的樣本滴加到樣品墊上，待吸收干后再滴加50μL層

析液。室溫放置15min后，用便攜式近紅外熒光掃描儀讀數(shù)。若檢測線區(qū)域和質(zhì)控區(qū)域同時出現(xiàn)熒光

峰為陽性結(jié)果。

E.2.6定量檢測

取107CFU/mL的副溶血弧菌純菌（ATCC），用PBS（pH7.4）稀釋液將所述純菌進(jìn)行倍數(shù)系列稀釋，

制成2.4×105CFU/mL、1.2×105CFU/mL、2.4×104CFU/mL、1.2×104CFU/mL、2.4×103CFU/mL、1.2

×103CFU/mL、2.4×102CFU/mL、1.2×102CFU/mL菌液進(jìn)行檢測限檢測。依照上述方法進(jìn)行超聲破菌

處理。吸取100μL經(jīng)超聲處理的樣本滴加到樣品墊上，待吸收干后再滴加50μL層析液。室溫靜置10分鐘，

將試紙條放入便攜式近紅外熒光掃描儀讀數(shù)。上述系列稀釋的副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行檢測，掃描獲

得檢測線和質(zhì)控線的熒光值，同時出現(xiàn)檢測區(qū)域熒光峰和質(zhì)控區(qū)域熒光峰方表明反應(yīng)正常。每個稀釋度

樣本平行測量兩次，取平均值作為測量值，以該值對應(yīng)的樣品濃度作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

E.3近紅外免疫層析法檢測霍亂弧菌

E.3.1樣品采集

樣品采集數(shù)量和采集方法按SN0330進(jìn)行。

E.3.2樣品制備

樣品制備方法按SN/T1022進(jìn)行。

E.3.3普通樣品

從混合樣品中取出代表性樣品，將可食部分充分混勻。用四分法分出不小于500g作為試樣，裝入滅

菌容器內(nèi)，加封標(biāo)識。

E.3.4帶殼貝類

應(yīng)先在清潔的流水中洗凈外殼，用70%的乙醇消毒，然后以無菌操作切斷閉殼肌，打開貝殼。取出

含內(nèi)臟的全部貝肉和貝液。每個檢測樣品至少應(yīng)包括6個貝殼個體。

E.3.5樣品保存

7

樣品采集后應(yīng)立即在7℃～10℃保存，24h內(nèi)檢驗。如果樣品需要冷凍，與-18℃保存，24h內(nèi)檢

驗。為了最大限度地保證弧菌的存活率，應(yīng)避免樣品與冰直接接觸。

E.3.6定性檢測

分別移取100μL經(jīng)經(jīng)超聲破菌處理的被測樣品、陽性對照和陰性對照，分別滴加到同一批次的免疫

層析快速檢測試紙條樣品墊上，待吸收干后再滴加50μL層析液。室溫放置15min后，用便攜式近紅外

熒光掃描儀讀數(shù)。

E.3.7定量檢測

取O1群小川型霍亂弧菌菌懸液（附錄A.1），其濃度分別為1.0×106CFU/mL、0.5×106CFU/mL、1.0×105

CFU/mL、0.5×105CFU/mL、1.0×104CFU/mL、0.5×104CFU/mL、1.0×103CFU/mL、1.0×102CFU/mL。

超聲破菌處理。移取100μL上述樣本滴加到樣品墊上，待樣品吸收后再滴加50μL層析液。室溫靜置10

min，將上述試紙條放入便攜式近紅外熒光掃描儀中讀數(shù)。上述系列稀釋的霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行檢

測，掃描獲得檢測線和質(zhì)控線的熒光值。每個稀釋度樣本平行測量兩次，取平均值作為測量值，以測量

值為橫坐標(biāo)X，對應(yīng)的樣品中菌落濃度對數(shù)為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

E.4近紅外免疫層析法檢測沙門氏菌

E.4.1取樣

取樣按照按SN0330中的規(guī)定進(jìn)行。

E.4.2樣品制備

取樣品25g，剪碎，用225mL的pH為7.4的含5%BSA，0.1%Tween20的PBS緩沖液稀釋樣品，

取上清液作為檢樣，吸取1mL上清液至EP管中，超聲破菌，直徑3mm探頭，工作5s，休息15s，

40%能量，共計30次循環(huán)。

E.4.3定性檢測

吸取100μL經(jīng)超聲處理的檢樣滴加到樣品墊1上，待吸收干后再滴加50μL上述的PBS緩沖液，

用所述的試紙條進(jìn)行免疫層析；室溫放置15min后，用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別測定所述

檢測線和質(zhì)控線的熒光強度，分析結(jié)果。

E.4.4定量檢測

E.4.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稀釋的沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品：0.5×105CFU/mL、1×104CFU/mL、0.5×104CFU/mL、1×103CFU/mL、

0.5×103CFU/mL、1×102CFU/mL、10CFU/mL的樣品分別進(jìn)行檢測，掃描獲得檢測線和質(zhì)控線的熒

光值，同時出現(xiàn)檢測區(qū)域熒光峰和質(zhì)控區(qū)域熒光峰方表明反應(yīng)正常。每個稀釋度樣本平行測量兩次，取

平均值作為測量值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

E.4.4.2定量檢測

檢測方法同E.3.7。

E.5近紅外免疫層析法檢測諾如病毒

7

E.5.1近紅外熒光染料標(biāo)記病毒單抗

將兔抗諾如病毒衣殼蛋白多克隆抗體用劃膜液稀釋為1.5mg/ml，作為劃膜抗體。將鼠抗諾如病毒衣殼

蛋白單克隆抗體1F10、4G5分別用PBS稀釋為1mg/mL,取100μL，加入7μL熒光染料dylight800，渦旋混

勻后于室溫避光靜置1小時，1小時后加入100μLPBS稀釋混勻，終濃度為0.5mg/ml，做為標(biāo)記抗體。將標(biāo)

記抗體放入透析袋，于PBS中4℃過夜透析，回收抗體作為最終標(biāo)記抗體。

E.5.2定性檢測

標(biāo)記抗體鼠抗諾如病毒單抗用層析緩沖液1:50稀釋，羊抗雞抗體IgY1:2000稀釋（濃度0.5mg/mL)，

鼠抗諾如病毒單抗與IgY1:1（90μL+90μL）稀釋得混合液mix，將諾如病毒稀釋，每100μL病毒稀釋液+4

μL混合液mix，渦旋混勻，滴加至試紙條，室溫放置15min后，用便攜式近紅外熒光掃描儀讀數(shù)。若檢測

線區(qū)域和質(zhì)控區(qū)域同時出現(xiàn)熒光峰為陽性結(jié)果。

E.6近紅外免疫層析法檢測輪狀病毒

E.6.1定性檢測

標(biāo)記抗體鼠抗甲肝病毒單抗用層析緩沖液1:50稀釋，羊抗雞抗體IgY1:2000稀釋（濃度0.5mg/mL)，

鼠抗甲肝病毒單抗與IgY1:1（90μL+90μL）稀釋得混合液mix，將甲肝病毒稀釋，每100μL病毒稀釋液+4μL

混合液mix，渦旋混勻，滴加至試紙條，室溫放置15min后，用便攜式近紅外熒光掃描儀讀數(shù)。若檢測線區(qū)

域和質(zhì)控區(qū)域同時出現(xiàn)熒光峰為陽性結(jié)果。

E.6.2定量檢測

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：取1mg/ml的HAV抗原（HAV抗原為猴腎細(xì)胞培養(yǎng)后的滅活全病毒)，用含5%BSA，

0.1%Tween20，PBS稀釋液將所述抗原進(jìn)行倍數(shù)系列稀釋，制成1μg/mL、5μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、

50μg/mL、100μg/mL的樣品；熒光掃描檢測線和質(zhì)控線，分別測定檢測線和質(zhì)控線區(qū)域的熒光強度，制

作抗原濃度與熒光強度比之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合方程；每個稀釋度樣本平行測量兩次，取平均值作

為測量值，以該值對應(yīng)的樣品濃度作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

E.7近紅外免疫層析法檢測甲肝病毒

E.7.1定性檢測

標(biāo)記抗體鼠抗甲肝病毒單抗用層析緩沖液1:50稀釋，羊抗雞抗體IgY1:2000稀釋（濃度0.5mg/mL)，

鼠抗甲肝病毒單抗與IgY1:1（90μL+90μL）稀釋得混合液mix，將甲肝病毒稀釋，每100μL病毒稀釋液+4

μL混合液mix，渦旋混勻，滴加至試紙條，室溫放置15min后，用便攜式近紅外熒光掃描儀讀數(shù)。若檢測

線區(qū)域和質(zhì)控區(qū)域同時出現(xiàn)熒光峰為陽性結(jié)果。

E.7.2定量檢測

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：取1mg/mL的HAV抗原（HAV抗原為猴腎細(xì)胞培養(yǎng)后的滅活全病毒)，用含5%BSA，

0.1%Tween20，PBS稀釋液將所述抗原進(jìn)行倍數(shù)系列稀釋，制成1μg/mL、5μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、

50μg/mL、100μg/mL的樣品；熒光掃描檢測線和質(zhì)控線，分別測定檢測線和質(zhì)控線區(qū)域的熒光強度，

7

制作抗原濃度與熒光強度比之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合方程；每個稀釋度樣本平行測量兩次，取平均

值作為測量值，以該值對應(yīng)的樣品濃度作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

7

FF

附錄F

（規(guī)范性附錄）

試驗結(jié)果及判定

F.1近紅外免疫層析法檢測單增李斯特氏菌

F.1.1定性檢測結(jié)果及判定

用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別測定檢測線4和質(zhì)控線5區(qū)域的熒光強度，若所述質(zhì)控線5

區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表