酶功能改變方法及其突變體的制作方法

酶功能改變方法及其突變體的制作方法酶功能改變方法及其突變體的制作方法本發(fā)明的課題為提供變換中鏈脫氫酶/還原酶（MDR）家族酶的輔酶依賴性的酶改變方法。此外，本發(fā)明的課題為提供通過該改變方法轉(zhuǎn)換輔酶依賴性的MDR家族酶突變體，以及提供應(yīng)用該酶來以酶法制造光學(xué)活性醇的方法。本發(fā)明開發(fā)新的變換MDR家族酶的輔酶依賴性的酶改變方法，通過該酶改變方法，從將NADH作為輔酶利用的有用的MDR家族酶，合理地設(shè)計(jì)了將NADPH作為輔酶利用的酶突變體，并提供實(shí)際上具有這樣的功能的突變體?！緦＠f明】酶功能改變方法及其突變體【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及醇脫氫酶的輔酶依賴性的改變方法，特別是中鏈脫氫酶/還原酶(MDR:Medium-chainDehyrdrogenase/Reductase)的輔酶依賴性的改變方法。【背景技術(shù)】[0002]一般而言，在使用了氧化還原酶的光學(xué)活性醇類的制造中輔酶是必要的，因此為了避免因反應(yīng)進(jìn)行而引起的輔酶枯竭，與氧化還原并行而進(jìn)行輔酶的有效率的再生是重要的課題。作為光學(xué)活性醇類的制造中必要的輔酶，可舉出還原型β_煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH，其中，將氧化型記為NADP+)或者還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH，其中，將氧化型記為NAD+)等的吡啶核苷酸輔酶。作為將這些輔酶再生的方法，例如，周知使用葡萄糖脫氫酶(GDH)、甲酸脫氫酶(FDH)等的方法。[0003]以往，盡管存在具有優(yōu)異的物性(穩(wěn)定性、耐溶劑性、耐氧化性)、比活性的醇脫氫酶，但是其輔酶依賴性未被最優(yōu)化，即使將NADPH或者NADH中的任一個(gè)再生，光學(xué)活性醇類的生產(chǎn)率也受到限制?？紤]如果能夠?qū)⒋济摎涿傅妮o酶依賴性最優(yōu)化為輔酶再生酶的輔酶依賴性，即NADPH型或NADH型中的任一個(gè)，則在光學(xué)活性醇等的制造中的工藝最優(yōu)化會(huì)變得容易，能夠提供更有效率的制造方法。[0004]通過突變篩選取得輔酶依賴性被轉(zhuǎn)換的酶是需要龐大的勞力的，因此進(jìn)行了考慮酶的立體結(jié)構(gòu)信息來合理地設(shè)計(jì)輔酶依賴性被轉(zhuǎn)換的酶突變體的嘗試(專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)I)。[0005]醇脫氫酶(ADH)也可以說是通過該邏輯設(shè)計(jì)來取得輔酶依賴性被轉(zhuǎn)換的突變體的代表性酶家族。其中，關(guān)于氨基酸殘基數(shù)是250左右的短鏈脫氫酶/還原酶(SDR:Short-chainDehydrogenase/Reductase)家族的酶,近年已報(bào)道了成功地進(jìn)行輔酶依賴性的轉(zhuǎn)換的例子(非專利文獻(xiàn)2、非專利`文獻(xiàn)3)。但是，關(guān)于氨基酸殘基數(shù)為350左右的中鏈脫氫酶/還原酶(MDR)家族，沒有相同的報(bào)告例。[0006]專利文獻(xiàn)[0007]專利文獻(xiàn)1:國際公開第03/004653號(hào)小冊(cè)子[0008]非專利文獻(xiàn)[0009]非專利文獻(xiàn)I=PenningT.M.等著，“Chem.Rev.”，2001年，第101卷，第3027-3046頁[0010]非專利文獻(xiàn)2:MachielsenR.等著，“Eng.LifeSc1.”,2008年，第9卷，第38-44頁[0011]非專利文獻(xiàn)3:ZhangR.等著,“Appl.Environ.Microbiol.,2009年，第2176-2183頁【發(fā)明內(nèi)容】[0012]本發(fā)明的課題為將醇脫氫酶對(duì)NADPH或NADH中的任一個(gè)的依賴性最優(yōu)化，提高使輔酶再生系統(tǒng)共同作用時(shí)的光學(xué)活性醇類的生產(chǎn)率。[0013]但是，不可能將種類、同源性不同的酶的邏輯設(shè)計(jì)直接適應(yīng)于MDR。進(jìn)一步地，作為醇脫氫酶，使用由約350個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的MDR(中鏈脫氫酶/還原酶)家族酶的情況下，導(dǎo)入突變的位置的候補(bǔ)即使在導(dǎo)入I個(gè)突變的情況下也存在350處，在導(dǎo)入多個(gè)突變的情況下會(huì)存在龐大數(shù)量的候補(bǔ)。進(jìn)一步地，在各自的位置中，能夠向至少19種氨基酸進(jìn)行置換，從這些無數(shù)的候補(bǔ)中鑒別使對(duì)輔酶的依賴性轉(zhuǎn)換而成的突變體是非常困難的。[0014]本發(fā)明人等為了解決上述課題而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果開發(fā)了新的變換屬于MDR(中鏈脫氫酶/還原酶)家族的酶的輔酶依賴性的酶改變方法，成功地將導(dǎo)入突變的位置從多達(dá)350處的候補(bǔ)縮小成4處，且從19種存在的天然氨基酸中確定了最優(yōu)的氨基酸來作為突變后的氨基酸。由此，成功地從NADH/NAD+依賴性MDR(中鏈脫氫酶/還原酶)家族酶取得的NADPH/NADP+依賴性酶突變體，并從NADPH/NADP+依賴性MDR(中鏈脫氫酶/還原酶)家族酶取得NADH/NAD+依賴性酶突變體。[0015]gp，本發(fā)明涉及:[0016][I]一種蛋白質(zhì),屬于中鏈氧化還原酶家族,并具有選自下述的(a)~(d)中的至少一種氣基酸殘基:[0017]Ca)與序列號(hào)I的Asp-201在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Ala或Ser，[0018](b)與序列號(hào)I的Lys-202在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Arg，[0019](c)與序列號(hào)I的Lys-203在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Ser,以及，[0020](d)與序列號(hào)I的Ala-206在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Lys;[0021][2]根據(jù)[I]所述的蛋白質(zhì)，其由與序列號(hào)I所示的氨基酸序列具有85%以上的序列同源性的氨基酸序列構(gòu)成；[0022][3]根據(jù)[I]或[2]所述的蛋白質(zhì)，其中，由在序列號(hào)I所示的氨基酸序列中導(dǎo)入有選自下述的(e)~(h)中的至少一種突變的氨基酸序列構(gòu)成:[0023](e)將Asp-201置換為Ala或Ser，[0024](f)將Lys-202置換為Arg,[0025](g)將Lys-203置換為Ser，以及，[0026](h)將Ala-206置換為Lys;[0027][4]根據(jù)[I]~[3]中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其由序列號(hào)2~8中任一項(xiàng)所述的氨基酸序列構(gòu)成；[0028][5]由編碼[I]~[4]中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的堿基序列構(gòu)成的DNA;[0029][6]一種DNA，選自以下(A)、(B)以及(C):[0030](A)由序列號(hào)25~31中的任一個(gè)所述的堿基序列構(gòu)成的DNA，[0031](B)與包含與序列號(hào)25~31中的任一個(gè)所述的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且由編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列構(gòu)成的DNA，[0032](C)與序列號(hào)25~31中的任一個(gè)所述的堿基序列具有85%以上的序列同源性、且由編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列構(gòu)成的DNA;[0033][7]一種載體，包含[6]所述的DNA;[0034][8]一種轉(zhuǎn)化體，是用[7]所述的載體轉(zhuǎn)換宿主細(xì)胞而得到的；[0035][9][8]所述的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物；[0036][10]一種氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，包括如下工序:用[I]~[5]中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，使還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸進(jìn)行變換，得到氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；[0037][11]一種還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，包括如下工序:用[I]或[2]所述的蛋白質(zhì)，變換氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，得到還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；[0038][12]一種還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，通過使還原酶作用于由[10]所述的方法得到的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸來進(jìn)行；[0039][13]一種氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，通過使氧化酶作用于由[II]所述的方法得到的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸來進(jìn)行；[0040][14]根據(jù)[10]~[13]中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，利用權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化體或權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)物；[0041][15]通過[10]~[14]中任一項(xiàng)所述的制造方法制造的化合物。[0042]由于醇脫氫酶(ADH)，特別是中鏈脫氫酶/還原酶(MDR)家族的輔酶依賴性得到最優(yōu)化，因此能夠提高使輔酶再生系統(tǒng)共同作用時(shí)的光學(xué)活性醇類的生產(chǎn)率。[0043]作為NADP+還原酶，近年發(fā)現(xiàn)物性優(yōu)異的源自乳酸菌的⑶H(國際公開第09/041415號(hào)小冊(cè)子)。但是，源自麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)的MDR家族酶RMA由于野生型是NADH依賴性的，因此難以將作為NADP+還原酶的源自乳酸菌的GDH用作輔酶再生酶。與此相對(duì)，如果是通過輔酶依賴性的轉(zhuǎn)換而得到的本發(fā)明的蛋白質(zhì)，則能夠?qū)⒃醋匀樗峋淖鳛镹ADP+還原酶的GDH用作輔酶再生酶，制造工藝構(gòu)建上的優(yōu)點(diǎn)極其大。[0044]此外，在將利用NADPH/NADP+依賴性酶的反應(yīng)和利用NADH/NAD+依賴性酶的反應(yīng)在一個(gè)反應(yīng)溶液中實(shí)施的多階段反應(yīng)的情況下，能夠改變輔酶依賴性，因此本技術(shù)達(dá)到反應(yīng)工藝最優(yōu)化的優(yōu)點(diǎn)很大?！緦＠綀D】【附圖說明】[0045]圖1為本發(fā)明的實(shí)施例4涉及的反應(yīng)示意圖。[0046]圖2為示出本發(fā)明的實(shí)施例4涉及的反應(yīng)中的光學(xué)活性醇的變換率和光學(xué)純度的分析結(jié)果的圖。【具體實(shí)施方式】[0047]本說明書中，“蛋白質(zhì)”這一術(shù)語是包含具有多肽結(jié)構(gòu)的所有分子的物質(zhì)，被片段化或通過肽鍵連接的多肽鏈也被包含在“蛋白質(zhì)”這一術(shù)語中。[0048]本發(fā)明的蛋白質(zhì)是通過對(duì)屬于中鏈脫氫酶/還原酶家族的蛋白質(zhì)導(dǎo)入氨基酸置換突變而得到的。中鏈脫氫酶/還原酶(Medium-chainDehydrogenase/Reductase,MDR)家族是屬于醇脫氫酶(ADH，ECl.1.1.1.)的家族之一，由350~375個(gè)殘基構(gòu)成，基本都含有鋅(Zn)。中鏈脫氫酶/還原酶家族由各種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(Bioinformaticsdatabase)進(jìn)行了登記?分類?定義。例如，與PfamChttp://pfam.sanger.ac.uk/)的家族ID“PF00107”相關(guān)聯(lián)的酶全部屬于中鏈脫氫酶/還原酶家族，在2011年4月這一時(shí)間點(diǎn)，超過20000個(gè)的序列得到登記。屬于中鏈脫氫酶/還原酶家族的酶參與醇發(fā)酵、醛解毒、木質(zhì)素的生物合成、脂肪酸的生物合成或免于氧化損傷的保護(hù)等廣泛的生理功能。[0049]就屬于中鏈脫氫酶/還原酶家族的蛋白質(zhì)而言，作為輔酶的吡啶核苷酸是必要的。所謂吡啶核苷酸是指煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(將還原型記為NADPH，將氧化型記為NADP+)或β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(將還原型記為NADH，將氧化型記為NAD+)。[0050]此外，即使是新發(fā)現(xiàn)的未登記的序列，如果與中鏈脫氫酶/還原酶家族酶的序列同源性高，則也被分類為中鏈脫氫酶/還原酶家族酶?！靶蛄型葱浴笔悄軌蛲ㄟ^前述的使用了PROGRAMBLAST的氨基酸序列同源性解析來確定的。在BLAST分析中評(píng)價(jià)同源性時(shí)，可使用E-value這一統(tǒng)計(jì)值，同源性越高，該數(shù)值越無限接近于O。從序列同源性判斷是否是MDR家族酶時(shí)，相對(duì)于公知的MDR家族酶，E-value優(yōu)選為IX10_5以下，更優(yōu)選為IX10,以下，進(jìn)一步優(yōu)選為IXIO45以下。用于實(shí)施BLAST分析的軟件可通過NationalCenterforBiotechnologyInformation(/)進(jìn)行利用。[0051]作為成為導(dǎo)入氨基酸置換突變的對(duì)象的中鏈脫氫酶/還原酶家族酶，優(yōu)選為蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫UniProtKB(http://www.uniprot.0rg/)收載的酶。作為能夠應(yīng)用變換成NADPH/NADP+依賴性的技術(shù)的NADH/NAD+依賴性中鏈脫氫酶/還原酶家族酶，例如可舉出源自酵母的ADHl(P00330)、源自芽孢桿菌的ADH-HT(P42328)以及源自人的ADHlβ(Ρ00325)等。同樣地，作為能夠應(yīng)用變換成NADH/NAD+依賴性的技術(shù)的NADPH/NADP+依賴性MDR家族酶，例如可舉出源自酵母的ADH6(Q04894)、源自美國白楊的芥子(sinapyl)ADH(Q94G59)以及源自人的PIG3(Q53FA7)等。應(yīng)予說明，括號(hào)內(nèi)是前述數(shù)據(jù)庫中的編碼號(hào)碼。[0052]突變導(dǎo)入前的蛋白質(zhì)優(yōu)選為由相對(duì)于源自麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)的被包含在MDR家族中的酶(國際公開第08/066018號(hào)小冊(cè)子，以下簡(jiǎn)寫為RMA)，具有高的序列同源性的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)?！靶蛄型葱浴笔窃谙嗤膮^(qū)域中完全一致的氨基酸殘基數(shù)所占的比例，可通過前述的BLAST分析求出，由“Identities”標(biāo)記。[0053]突變導(dǎo)入前的蛋白·質(zhì)相對(duì)于序列號(hào)I的氨基酸序列的序列同源性優(yōu)選為85%以上，更優(yōu)選為90%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為95%以上。突變導(dǎo)入前的蛋白質(zhì)最優(yōu)選為由序列號(hào)I的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是源自麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)的MDR家族酶(國際公開第08/066018號(hào)小冊(cè)子，以下簡(jiǎn)寫為RMA)。RMA例如將NADH作為輔酶，將酮還原，催化生成光學(xué)活性醇的反應(yīng)。在由序列號(hào)I的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)(RMA)中導(dǎo)入氨基酸置換突變而設(shè)計(jì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的情況下，能夠?qū)⑤o酶依賴性從NADH依賴性轉(zhuǎn)換為NADPH依賴性。本發(fā)明是通過利用該RMA(序列號(hào)I)的模擬立體結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)的。[0054]在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是指，基于氨基酸序列信息來預(yù)測(cè)突變導(dǎo)入前的蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，與由序列號(hào)I的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較時(shí)，與由序列號(hào)I的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)中同等的位置存在的氨基酸殘基。[0055]以下，例示使用序列號(hào)I作為突變導(dǎo)入前的蛋白質(zhì)時(shí)的氨基酸置換突變的邏輯設(shè)計(jì)方法。RMA的立體結(jié)構(gòu)的邏輯設(shè)計(jì)可通過利用RMA的模擬立體結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)。應(yīng)予說明，關(guān)于由序列號(hào)I所示的野生型RMA，未進(jìn)行以X射線晶體結(jié)構(gòu)分析為首的結(jié)構(gòu)解析等實(shí)驗(yàn)，其立體結(jié)構(gòu)是未知的。[0056]基于RMA的氨基酸序列信息，利用ProgramClustalX(Thompson、J.D.等著，“NucleicAcidRes.”，1994年，第22卷，第4673-80頁)，完成與具有氨基酸序列同源性且立體結(jié)構(gòu)被登記在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBank,PDB)的酶的多重氨基酸序列比對(duì)。與RiA具有氨基酸序列同源性的蛋白質(zhì)能夠通過如下方式進(jìn)行選擇，即，以被登記在PDB的蛋白質(zhì)的氨基酸序列為對(duì)象,使用PROGRAMBLAST(Altschul,S.F.等著，“NucleicAcidRes.”1997年，第25卷，第3389-3402頁)或PS1-BLAST(ShafferA.A.等著，“Bioinfomatics”，2000年，第164卷，第88-489頁)進(jìn)行氨基酸序列同源性的檢索。[0057]接下來，這些立體結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)的三元立體結(jié)構(gòu)比對(duì)可通過Swiss-PDBViewer(GuexN.等著，“Electrophoresis”，1997年，第18卷，2714-2723)等的三維繪圖程序、VASTSearch(GibratJ.F.等著，“Curr.0pin.Struct.Biol.”，1996年，第6卷，377-)等的立體結(jié)構(gòu)比較.類似結(jié)構(gòu)檢索服務(wù)器進(jìn)行。首先將僅由氨基酸序列得到的多重比對(duì)，基于立體結(jié)構(gòu)的類似性進(jìn)行修正，將以得到的序列比對(duì)為基礎(chǔ)被推定為立體結(jié)構(gòu)的類似性高的蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)(PDB編碼:1LLU)作為分子模擬的模板蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇。使該模板蛋白質(zhì)由ProgramSwissPDB-Viewer表示,按照序列比對(duì)，以適于RMA的氨基酸序列(序列號(hào)I)的方式進(jìn)行氨基酸殘基的置換。關(guān)于插入、缺失部位，從PDB檢索最優(yōu)的類似部分結(jié)構(gòu)，置換為該部分結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)建立體結(jié)構(gòu)模型。[0058]以該立體結(jié)構(gòu)模型為基礎(chǔ)，以輔酶結(jié)合口袋周圍為中心，確定被預(yù)測(cè)為對(duì)與輔酶的結(jié)合產(chǎn)生較大影響、且對(duì)輔酶結(jié)合性以外的功能幾乎沒有影響的被預(yù)測(cè)部位(殘基)。接下來，通過使NADH以及NADPH虛擬對(duì)接的立體結(jié)構(gòu)的模型構(gòu)建、以及利用了該對(duì)接結(jié)構(gòu)的計(jì)算化學(xué)方法進(jìn)行的自由能計(jì)算，設(shè)計(jì)對(duì)NADH的親和性降低且對(duì)NADPH的親和性變高的突變。一般而言，關(guān)于酶(蛋白質(zhì))和輔酶(底物)復(fù)合體的穩(wěn)定性，能夠根據(jù)自由能進(jìn)行討論(A.R.Leach著，“分子模擬概論”，2004年，第11章)。[0059]若利用分子模擬結(jié)構(gòu)(主鏈的骨架)，則能夠通過利用了分子力場(chǎng)法的分子模擬計(jì)算(能量極小化計(jì)算)來算出輔酶不結(jié)合的狀態(tài)(apo)與輔酶結(jié)合的狀態(tài)(holo)的自由能差分值。該邏輯的詳細(xì)情況可以說是設(shè)計(jì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物的方法的應(yīng)用。LBDD配體?基的自由能差與野生型相比，在NADH的情況下對(duì)apo有利,且在NADPH的情況下對(duì)holo有利這一趨勢(shì)特別強(qiáng)的突變可以說對(duì)轉(zhuǎn)換輔酶依賴性是有用的。具體地，通過使用ProgramShrike(日本特許公開第2001-184381號(hào)公報(bào))的計(jì)算機(jī)篩選，進(jìn)行氨基酸突變候補(bǔ)的縮小。[0060]通過上述方法，能夠提取在由350個(gè)左右殘基構(gòu)成的MDR(中鏈脫氫酶/還原酶)家族酶中的對(duì)輔酶的識(shí)別重要的部位，且能夠發(fā)現(xiàn)為了獲得作為目標(biāo)的輔酶依賴性而最優(yōu)的各部位的氨基酸的種類(及其組合)。在MDR(中鏈脫氫酶/還原酶)家族酶中，容易確定與序列號(hào)I的第201位、第202位、第203位或第206位在立體結(jié)構(gòu)上同等的位置。利用前述的VASTSearch等立體結(jié)構(gòu)比較.類似結(jié)構(gòu)檢索服務(wù)器，進(jìn)行立體結(jié)構(gòu)已知的氨基酸序列(例如，本次發(fā)明中使用的PDB編碼:1LLU的氨基酸序列)與以立體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的氨基酸序列的比對(duì)，從而能夠容易地鑒定在立體結(jié)構(gòu)上同等的位置。該VASTSearch也能夠通過美國生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)進(jìn)行利用。[0061]本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選屬于中鏈脫氫酶/還原酶家族，并具有選自下述(a)~(d)中的至少一種氨基酸殘基:[0062](a)與序列號(hào)I的Asp-201在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Ala或Ser，[0063](b)與序列號(hào)I的Lys-202在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Arg，[0064](c)與序列號(hào)I的Lys-203在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Ser,以及，[0065]Cd)與序列號(hào)I的Ala-206在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Lys。[0066]進(jìn)一步地，更優(yōu)選屬于中鏈脫氫酶/還原酶家族，并包含下述(e)~(g)中的全部氣基酸殘基:[0067](e)與序列號(hào)I的Asp-201在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Ser，[0068](f)與序列號(hào)I的Lys-202在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Arg，以及，[0069](g)與序列號(hào)I的Ala-206在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Lys。[0070]通過上述(a)~(d)或(e)~(g)的突變導(dǎo)入，能夠?qū)⑤o酶依賴性是NADH(或NAD+)依賴性的醇脫氫酶轉(zhuǎn)換為NADPH(或NADP+)依賴性。[0071]突變導(dǎo)入后的蛋白質(zhì)相對(duì)于序列號(hào)I的氨基酸序列的序列同源性優(yōu)選為85%以上，更優(yōu)選為90%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為95%以上。具體而言，突變導(dǎo)入后的蛋白質(zhì)優(yōu)選具有序列號(hào)2~8所示的氨基酸序列，更優(yōu)選具有序列號(hào)2~3所示的氨基酸序列。[0072]此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選具有醇脫氫活性，并具有選自下述(i)~(I)中的至少一種氨基酸殘基:[0073](i)與序列號(hào)I的Asp-201在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Asp，[0074](j)與序列號(hào)I的Lys-202在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Lys，[0075](k)與序列號(hào)I的Lys-203在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Lys，以及，[0076](I)與序列號(hào)I的Ala-206在立體結(jié)構(gòu)上同等位置的氨基酸殘基是Ala。[0077]通過上述(i)~(I)的突變導(dǎo)入，能夠?qū)⑤o酶依賴性是NADPH(或NADP+)依賴性的醇脫氫酶轉(zhuǎn)換為NADH(或NAD+)依賴性。[0078]本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選相對(duì)于突變導(dǎo)入前顯示高氧化(或還原，以后簡(jiǎn)寫為“氧化/還原”)活性的輔酶的氧化/還原活性降低?；蛘?，優(yōu)選相對(duì)于突變導(dǎo)入前顯示低的氧化/還原活性(或完全不顯示)的輔酶的氧化/還原活性提高。進(jìn)一步地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)更優(yōu)選具有這兩方的特征。[0079]所謂輔酶氧化/還原活性比是指，將突變導(dǎo)入后顯示依賴性的輔酶的氧化/還原活性，用突變導(dǎo)入前顯示依賴性的其他的輔酶的氧化/還原活性去除而得的值。例如，RMA的情況下，輔酶氧化/還原活性比由氧化活性比(NADPH/NADH)表示。輔酶氧化/還原活性比優(yōu)選為I以上，更優(yōu)選為5以上，進(jìn)一步優(yōu)選為10以上。在希望僅將突變導(dǎo)入后顯示依賴性的輔酶有選擇地氧化/還原的情況下，可要求嚴(yán)密的輔酶選擇性，因此進(jìn)一步更優(yōu)選為20以上，在要求更嚴(yán)密的輔酶選擇性的情況下，最優(yōu)選30以上。例如，同時(shí)進(jìn)行利用煙酰胺輔酶依賴性的酶的兩個(gè)反應(yīng)時(shí)，在相互的酶的輔酶依賴性不同的情況下，通常要求嚴(yán)密的選擇性。應(yīng)予說明，突變導(dǎo)入前的輔酶氧化/還原活性比即使很高，也為0.1左右，如果大于該值，則原本就是在兩方顯示依賴性的酶。[0080]輔酶氧化/還原活性，在RMA的情況下，是將在I分鐘內(nèi)將IμmoI的NADPH(或NADH)氧化為NADP+(NAD+)的酶活性定義為I個(gè)單位而算出的。在突變導(dǎo)入前后，為了算出輔酶氧化/還原活性的反應(yīng)液組成、酶濃度設(shè)為相同條件。輔酶氧化/還原活性的測(cè)定條件，在RMA的情況下，優(yōu)選為pH4.0~10.0、溫度為4°C~80°C的一定溫度下，一定時(shí)間的通氣攪拌處理的條件，但是也可以考慮組合的輔酶再生酶的物性來進(jìn)行設(shè)定，并不受到這些條件的限制。本發(fā)明的蛋白質(zhì)若除去輔酶依賴性被轉(zhuǎn)換的特征，則維持例如底物特異性等本來的功能。[0081]本發(fā)明的DNA是由編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的堿基序列構(gòu)成。只要是按照后述的方法，在被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞內(nèi)能表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA，就可以為任意的DNA，也可以包含任意的非翻譯區(qū)域。只要能夠設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)，就能夠通過由作為導(dǎo)入突變前的蛋白質(zhì)的起源的生物，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法取得導(dǎo)入突變前的DNA并導(dǎo)入突變，從而取得本發(fā)明的DNA。[0082]向編碼野生型MDR家族酶的DNA進(jìn)行的部位特異性突變的導(dǎo)入，能夠使用重組DNA技術(shù)、PCR法等進(jìn)行。利用重組DNA技術(shù)的突變的導(dǎo)入，在野生型酶基因中的希望導(dǎo)入突變的目標(biāo)部位的兩側(cè)存在適當(dāng)?shù)南拗泼缸R(shí)別序列的情況下，能夠通過盒式突變法進(jìn)行，所述盒式突變法為用前述制限酶切斷此處，將包含希望導(dǎo)入突變的部位的區(qū)域除去后，利用化學(xué)合成等僅在目標(biāo)部位插入導(dǎo)入突變的DNA片段。此外，利用PCR進(jìn)行的部位特異性突變的導(dǎo)入是通過如下方式進(jìn)行的，即，用在野生型編碼基因中的希望導(dǎo)入突變的目標(biāo)部位導(dǎo)入了目標(biāo)突變的突變引物和不具有包含前述基因的一個(gè)末端部位的序列的突變的擴(kuò)增用引物來擴(kuò)增前述基因的單側(cè)，用具有相對(duì)于前述突變用引物互補(bǔ)的序列的突變用引物和不具有包含前述基因的另一個(gè)末端部位的序列的突變的擴(kuò)增用引物來擴(kuò)增另一側(cè)，將得到的兩個(gè)擴(kuò)增片段進(jìn)行退火操作，然后進(jìn)一步地用前述2種擴(kuò)增用引物進(jìn)行PCR操作。除了這些重組DNA技術(shù)、PCR法之外，也可以通過化學(xué)合成來取得編碼導(dǎo)入了突變的氨基酸序列的DNA。[0083]作為這樣得到的編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA，例如，可舉出由序列號(hào)25~31中的任一個(gè)所述的堿基序列構(gòu)成的DNA。[0084]此外，作為本發(fā)明的DNA，可舉出與包含與序列號(hào)25~31中的任一個(gè)所述的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且由編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列構(gòu)成的DNA。[0085]此外，作為本發(fā)明的DNA，可舉出與序列號(hào)25~31中的任一個(gè)所述的堿基序列具有85%以上的序列同源性、且由編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列構(gòu)成的DNA。[0086]此處，“與包含與序列號(hào)25~31中的任一個(gè)所述的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且由編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列構(gòu)成的DNA”是通過將包含與序列號(hào)25~31中的任一個(gè)所述的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA作為探針，在嚴(yán)格條件下使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或者SOUTHERN雜交法等而得到的DNA，且是指編碼具有氧化還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。[0087]雜交可按照MolecularCloning,Alaboratorymanual,secondedition(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)等中記載的方法進(jìn)行。此處嚴(yán)格條件下雜交的DNA”可舉出，例如通過如下方法取得的DNA，即，通過使用將源自菌落或者噬菌斑的DNA進(jìn)行了固定化的過濾器，在0.7~1.0M的NaCl存在的條件下、65°C時(shí)進(jìn)行雜交之后，使用2倍濃度的SSC溶液(I倍濃度的SSC溶液的組成由150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉構(gòu)成)，65°C的條件下，清洗過濾器而取得DNA。優(yōu)選65°C時(shí)以0.5倍濃度的SSC溶液清洗，更優(yōu)選65°C時(shí)以0.2倍濃度的SSC溶液清洗，進(jìn)一步優(yōu)選65°C時(shí)以0.1倍濃度的SSC溶液清洗而取得的DNA。[0088]雖然記在了以上這樣的雜交條件，但是本發(fā)明并不特別局限于這些條件。作為對(duì)雜交的嚴(yán)格性造成影響的要素，可考慮溫度、鹽濃度等多個(gè)要素，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就能夠?qū)@些要素進(jìn)行適宜選擇來實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的嚴(yán)格性。[0089]作為通過上述條件能夠雜交的DNA，可舉出與序列號(hào)25~31中的任一個(gè)所述的堿基序列的序列同源性是85%以上，優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上的DNA，被編碼的多肽只要具有氧化還原酶活性，就被包括在上述DNA中。[0090]此處，“序列同源性(％)”是由使被對(duì)比的兩個(gè)DNA進(jìn)行最優(yōu)地比對(duì)排列，將核酸堿基(例如、A、T、C、G、U或I)在兩個(gè)序列中一致的位置的數(shù)量用比較堿基的總數(shù)去除，然后將該結(jié)果乘以100而得到的數(shù)值表示。[0091]本發(fā)明的載體可以通過將本發(fā)明的DNA插入適當(dāng)?shù)妮d體而得到。用于插入DNA的空載體，只要在宿主細(xì)胞中能夠進(jìn)行自主復(fù)制，就無特別限制，可將質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA作為載體使用。例如，在使用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞的情況下，可使用pBR322、pUC18、pBluescriptll等質(zhì)粒DNA、EMBL3、M13、λgtll等噬菌體DNA等。在使用酵母作為宿主細(xì)胞的情況下，可使用YEpl3、YCp50等。在使用植物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的情況下，可使用pBI121、pBI101等，在使用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的情況下，可使用pcDNAI等作為載體。[0092]本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可通過使用上述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到。宿主生物，只要是能夠由包含編碼DNA的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將導(dǎo)入的DNA編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)的生物，就無特別限制。作為能夠利用的微生物，例如，可舉出大腸埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)屬、沙雷氏菌屬(Serratia)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)以及乳桿菌屬(Lactobacillus)等宿主載體系統(tǒng)中被開發(fā)的細(xì)菌；紅球菌屬(Rhodococcus)以及鏈霉菌屬(Streptomyces)等宿主載體系統(tǒng)中被開發(fā)的放線菌；酵母菌屬(Saccharomyces)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)屬、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)屬、耶氏酵母屬(Yarrowia)、絲抱酵母屬(Trichosporon)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、畢赤酵母屬(Pichia)以及假絲酵母屬(Candida)等宿主載體系統(tǒng)中被開發(fā)的酵母；脈孢菌屬(Neurospora)、曲霉屬(Aspergillus)、頭孢菌屬(Cephalosporium)以及木霉屬(Trichoderma)等宿主載體系統(tǒng)中被開發(fā)的霉菌等。此外，除了微生物以外，植物、動(dòng)物中各種宿主.載體系統(tǒng)也正被開發(fā)，特別是在使用了蠶的昆蟲或菜籽、玉米、土豆等植物中大量開發(fā)表達(dá)不同種類蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，能夠合適地利用。其中，從導(dǎo)入以及表達(dá)效率的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)`選細(xì)菌，更優(yōu)選大腸桿菌。[0093]作為轉(zhuǎn)化的方法，向細(xì)菌導(dǎo)入重組體DNA的情況下，例如可舉出使用鈣離子的方法、電穿孔法等。作為向酵母的導(dǎo)入重組體DNA的方法，例如，可舉出電穿孔法、原生質(zhì)體法、醋酸鋰法等。作為向植物細(xì)胞導(dǎo)入重組體DNA的方法，可舉出農(nóng)桿菌(Agrobacterium)感染法、基因槍(particlegun)法、聚乙二醇法等。作為向動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入重組體DNA的方法，例如，可舉出電穿孔法、磷酸鈣法等。[0094]本發(fā)明的培養(yǎng)物可通過將上述轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)而得到。將轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使蛋白質(zhì)在培養(yǎng)菌體中或培養(yǎng)上清中生成蓄積，采集前述酶突變體，從而能夠得到包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)物。[0095]轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)，按照在宿主培養(yǎng)中使用的常規(guī)方法進(jìn)行。作為培養(yǎng)以大腸桿菌等細(xì)菌為宿主而得到的轉(zhuǎn)換細(xì)胞的培養(yǎng)基，可舉出完全培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基，例如，可舉出LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基、M9培養(yǎng)基等。此外，通過在培養(yǎng)溫度20~40°C下進(jìn)行有氧培養(yǎng)，使本發(fā)明的酶突變體在菌體內(nèi)蓄積并進(jìn)行回收。酶突變體的精制可通過如下方式進(jìn)行，即，將通過前述的養(yǎng)法得到的培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離并回收，對(duì)細(xì)胞用超聲波儀等進(jìn)行破碎，將親和色譜法、陽離子或陰離子交換色譜法、凝膠過濾等單獨(dú)或適當(dāng)組合，從而進(jìn)行酶突變體的精制。得到的精制物質(zhì)是目標(biāo)酶的確認(rèn)可通過常規(guī)方法，例如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western印跡法等進(jìn)行。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物的精制處理是指在不損失酶活性的情況下，將目標(biāo)酶以外的雜質(zhì)去除；精制處理物是通過前述處理而得到的含酶物。作為精制處理物，例如可舉出通過破碎細(xì)胞而得到的無細(xì)胞提取液、精制得到的酶溶液、或者酶溶液的冷凍干燥物。[0096]將在具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)導(dǎo)入選自上述(a)~(d)中至少一種的氨基酸置換突變而得到的蛋白質(zhì)，與置換突變導(dǎo)入前的蛋白質(zhì)相比較，對(duì)NADPH的依賴性提高，對(duì)NADH的依賴性降低。因此，使用該蛋白質(zhì)，能夠變換還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，得到氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)。[0097]此外，由于該反應(yīng)是平衡反應(yīng)，因此使用該蛋白質(zhì)，也能夠變換氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，得到還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。[0098]將具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)導(dǎo)入選自上述(i)~(1)中的至少一種的氨基酸置換突變而得到的蛋白質(zhì)，與置換突變導(dǎo)入前的蛋白質(zhì)相比較，對(duì)NADH的依賴性提高，對(duì)NADPH的依賴性降低。因此，使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)能夠變換還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),得到氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。[0099]此外，由于該反應(yīng)是平衡反應(yīng)，因此使用該蛋白質(zhì)，也能夠變換氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，得到還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。[0100]在本發(fā)明的蛋白質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)中通過使輔酶再生系統(tǒng)共同作用，能夠提高光學(xué)活性醇的生產(chǎn)率。[0101]使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)制造的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，通過與輔酶再生系統(tǒng)作用，能夠制造還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。這樣的輔酶再生系統(tǒng)是具有還原氧化型輔酶的活性的酶，作為具體例，可舉出葡萄糖脫氫酶(GDH)、甲酸脫氫酶(FDH)、乳酸脫氫酶(LDH)以及蘋果酸脫氫酶(MDH)。[0102]此外，使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)制造的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，通過使輔酶再生系統(tǒng)起作用，能夠制造氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。這樣的輔酶再生系統(tǒng)是具有將還原型輔酶進(jìn)行氧化的活性的酶，作為具體例，可舉出葡萄糖脫氫酶(GDH)、甲酸脫氫酶(FDH)、乳酸脫氫酶(LDH)以及蘋果酸脫氫酶(MDH)。[0103]這些還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、或者氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的制造，可使用上述的轉(zhuǎn)化體及其培養(yǎng)物進(jìn)行。[0104]實(shí)施例[0105]關(guān)于置換氨基酸的突變的標(biāo)記，進(jìn)行如下標(biāo)記:在置換位置的序號(hào)之前，附上野生型或非突變型的氨基酸，在置換位置序號(hào)之后，附上突變的氨基酸。例如，將201位的Asp置換為Ala的突變記為D201A。[0106](實(shí)施例1)包含RMA突變體基因的重組載體的制作以及重組大腸桿菌的制作[0107]為了使源自麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)的MDR(中鏈脫氫酶/還原酶)家族酶(國際公開第08/066018號(hào)小冊(cè)子，以下簡(jiǎn)寫為RMA)的突變體在大腸桿菌中表達(dá)，使用該文獻(xiàn)中記載的PNCM載體(RMA野生型表達(dá)質(zhì)粒)，制備各種突變體的表達(dá)質(zhì)粒。[0108]關(guān)于突變的導(dǎo)入，將pNCM載體作為模板，通過使用以在意圖的部位能夠?qū)胪蛔兊姆绞蕉O(shè)計(jì)的2種合成引物的QuickChange法，得到包含各種RMA突變體基因的重組質(zhì)粒。關(guān)于QuickChange法，使用QuickChangeSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene公司制),按照添加的程序進(jìn)行。首先，將pNCM(序列號(hào)9)作為模板DNA,應(yīng)用使用序列號(hào)10~11所示的2種合成引物，實(shí)施QuickChange法,制備導(dǎo)入突變A206K的RMA突變