培養(yǎng)基及配制

關(guān)于培養(yǎng)基及配制培養(yǎng)基的成分3碳源和能源

4植物激素

1無(wú)機(jī)鹽

2有機(jī)物5瓊脂

6輔助物質(zhì)第2頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天1無(wú)機(jī)鹽

元素名稱(chēng)添加形式

NKNO3,NH4NO3大量PKH2PO4NaH2PO4元素KKClKNO3(≥0.5mmol/L)CaCaCl2·2H2OMgMg2SO4·7H2OSFeFeNa2-EDTA微量BH3BO3元素MnMnSO4(≤0.5mmol/L)CuCuSO4MoNa2MoO4·2H2OClCaCl2·2H2O第3頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天1）大量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動(dòng)中占有重要的位置。

P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4NaH2PO4等。

K對(duì)碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。第4頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對(duì)核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對(duì)細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。第5頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天2）微量元素

在微量元素中，鐵的使用最大，鐵是一些氧化酶的組成成分。同時(shí)又是葉綠素形成的必要條件。

由于培養(yǎng)基的pH較高，所以培養(yǎng)中幾乎都使用不易分解的乙二胺四乙酸鐵這種鰲合物來(lái)防止鐵的沉淀。第6頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天

硼與蛋白質(zhì)合成、糖類(lèi)運(yùn)輸有著密切的關(guān)系；銅是某些氧化酶的成分，能夠促進(jìn)離體根的生長(zhǎng)；錳參與植物的光合、呼吸代謝；鉬參與氮素的代謝；氯是光合作用水光解的活化劑。

微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。第7頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天NoMSsalts沒(méi)有任何生長(zhǎng)特征MSsalts0.47g.l-1

長(zhǎng)出更多的根MSsalts9.52g.l-1

長(zhǎng)大量的再生苗而無(wú)根第8頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天**

愈傷組織缺無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)表現(xiàn)癥狀

N----某些愈傷組織出現(xiàn)花青甙，沒(méi)有導(dǎo)管形成

N、P或K----細(xì)胞過(guò)度增大且形成層減少

S----愈傷組織非常明顯褪綠

Fe----細(xì)胞分裂停止

B----細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長(zhǎng)遲緩

Mg和Mn----影響細(xì)胞伸長(zhǎng)第9頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天2有機(jī)物2.1維生素2.2肌醇2.4氨基酸2.3天然復(fù)合物第10頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天種類(lèi)：

硫胺素---維生素B1VB1

吡哆素---維生素B6VB6

煙酸---維生素B3Vpp

抗壞血酸---維生素CVc以及B5、生物素、葉酸。濃度：0.1－1.0mg/L

作用：VB1促愈傷組織產(chǎn)生，提高活力VB6

促根生長(zhǎng)Vpp與代謝和胚發(fā)育有關(guān)Vc防組織褐變2.1維生素第11頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.2肌醇促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)、胚狀體和芽的形成對(duì)組織細(xì)胞繁殖、分化的促進(jìn)作用濃度100mg/L第12頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天2有機(jī)物2.1維生素2.2肌醇2.4氨基酸2.3天然復(fù)合物第13頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天椰乳：促愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)，用量10～20%。使用注意莖尖大小。

2.3天然復(fù)合物香蕉泥：對(duì)pH值緩沖大，用量150～200ml/L，應(yīng)用在蘭花組培。第14頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天

水解酪(乳)蛋白：濃度100-200mg/L，多用于微莖尖培養(yǎng)。天然復(fù)合物馬鈴薯提取液：對(duì)pH值緩沖大，用量150-200g/L，使苗壯。其它：第15頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.4氨基酸

種類(lèi)：甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及酰胺類(lèi)物質(zhì)（如天門(mén)冬酰胺）和多種氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。注意：氨基酸類(lèi)物質(zhì)只有在含有無(wú)機(jī)氮的情況下，對(duì)離體組織生長(zhǎng)才有較好的效果。第16頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的成分第一節(jié)3碳源和能源

4植物激素

1無(wú)機(jī)鹽

2有機(jī)物5瓊脂

6輔助物質(zhì)第17頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天3碳源和能源

種類(lèi)：蔗糖或葡萄糖、果糖、砂糖等。蔗糖濃度：1-5%，胚培養(yǎng)為4-15%。注意：高壓滅菌部分糖會(huì)分解。大生產(chǎn)時(shí)可用白砂糖。作用：

作為離體組織賴以生長(zhǎng)的碳源

使培養(yǎng)基維持一定的滲透壓（一般在1.5-4.1MPa）第18頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天蔗糖（0%）蔗糖含量（

1%）蔗糖含量（5%）在外植體上既沒(méi)有芽發(fā)生，也沒(méi)有根和愈傷組織產(chǎn)生在外植體上表面邊緣產(chǎn)生芽，也有一些根發(fā)生芽從外植體的上表面發(fā)生而根從下表面發(fā)生第19頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天4植物激素4.1.生長(zhǎng)素類(lèi)（1）種類(lèi)

IBA—吲哚丁酸；IAA—吲哚乙酸；NAA—萘乙酸；2,4-D---2,4-二氯苯氧乙酸

使用效價(jià)：

IAA<IBA<NAA<2,4-DNAA、IBA→生根培養(yǎng)

2,4-D→愈傷組織誘導(dǎo)與增殖（2）作用誘導(dǎo)愈傷組織和根分化，促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)。NAA和IBA常與細(xì)胞分裂素結(jié)合用于芽的增殖。（3）濃度

0.05－5mg/L（4）配制生長(zhǎng)素可溶解在稀NaOH中或溶于乙醇。第20頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.2細(xì)胞分裂素（CTK）（1）種類(lèi)：Kt---激動(dòng)素

BAP---芐氨基嘌呤

2－iP---異戊烯腺嘌呤

ZT-玉米素

TDZ（2）作用：?jiǎn)?dòng)脫分化、細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)愈傷組織芽分化、芽增殖，叢生芽。（3）濃度：0.05－10.0mg/L（4）配制：溶于稀酸或稀堿

第21頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天

激素配比模式生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素：它們的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長(zhǎng)根還是長(zhǎng)芽。

高：有利于根的形成和愈傷組織的形成；適中：有利于根芽的分化；低：有利于芽的形成生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素=如：為了促進(jìn)芽器官的分化，應(yīng)除去或降低生長(zhǎng)素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例。第22頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素對(duì)器官或愈傷組織的影響第23頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天NoBAPBAP0.1mg.l-1

NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAA0.1mg.l-1

Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.UndifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantNAA5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.Somecallus第24頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.3赤霉素（GAs）

（1）種類(lèi)：GA3（2）作用：促莖伸長(zhǎng)，促胚發(fā)育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。注意：不耐熱；生理活性5－15d，時(shí)間太長(zhǎng)有抑制作用。較生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素少用，可溶于水。ABA→因物種不同，能促進(jìn)或抑制愈傷組織生長(zhǎng)；第25頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天5瓊脂/培養(yǎng)體支持材料5.1.瓊脂(1)用量6－10g/L(2)種類(lèi)瓊脂粉瓊脂條(3)作用固化作用注意：瓊脂使用有優(yōu)缺點(diǎn)；新買(mǎi)應(yīng)試凝固力。不凝原因：①pH<5不凝；②長(zhǎng)時(shí)間高壓滅菌；③長(zhǎng)期存放，易變質(zhì)；④廠家不同，雜質(zhì)含量不同⑤配制時(shí)融解不充分，分裝不均勻；5.2.其它

玻璃纖維濾紙橋海綿、卡拉膠等第26頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天6輔助性物質(zhì)6.3抗生素6.2抗氧化物6.1活性炭第27頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天

6.1活性炭1)作用：具吸附作用；莖尖初代培養(yǎng)可防褐化；促進(jìn)新梢增殖（濃度0.1-0.2%）；促進(jìn)生根,根避光生長(zhǎng)；防止組培苗玻璃化（濃度0.3%）；有利于胚胎培養(yǎng)。2)常用濃度：0.5－10g/L3)注意：活性炭具副作用。選擇吸附性差，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)損耗和pH↓，應(yīng)適當(dāng)調(diào)高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與激素水平，并加大Agar用量。第28頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.2抗生素用量：用量5~20mg/L注意：抗生素對(duì)組織生長(zhǎng)有抑制作用，使用要慎重。

多數(shù)需過(guò)濾滅菌。作用：抑制內(nèi)生菌；種類(lèi)：青霉素、鏈霉素、慶大霉素、利福平、卡那霉素等，第29頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.3抗氧化物2)用量：50－200mg/L，3)作用：防止氧化4)注意：可用抗氧化劑洗滌外植體傷口表面。1)常用抗氧化劑：半胱氨酸、VC第30頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.4其它成分：AgNO3：作用：吸附乙烯，促進(jìn)莖芽分化，防玻璃化苗、早衰、落葉；只能短期培養(yǎng)，用量

1~10mg/L，需過(guò)濾滅菌第31頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天pH值在滅菌之前培養(yǎng)基的pH值一般都是調(diào)節(jié)到5.0-6.0。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)pH值高于6.0時(shí)培養(yǎng)基將會(huì)變硬；低于5.0時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。pH值對(duì)不同植物的影響會(huì)有差異，如玉米胚乳愈傷組織在pH值7.0時(shí)鮮重增加最快，在pH值6.1時(shí)干重增長(zhǎng)最快。第32頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天種類(lèi)最適pH值種類(lèi)最適pH值杜鵑4.0月季5.8越桔4.5胡蘿卜、石刁柏6.0蠶豆5.5桃7.0番茄5.7

不同植物對(duì)培養(yǎng)基最適pH值的要求不同(見(jiàn)表)第33頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)基的制備第34頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天1水和藥品水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動(dòng)過(guò)程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水或重蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過(guò)程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來(lái)水。但研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。第35頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天藥品：應(yīng)選取等級(jí)較高的化學(xué)純（CP）或分析純(AR)；藥品的稱(chēng)量一定要準(zhǔn)確、正確，防止藥勺之間的交叉污染。第36頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.1母液（貯備液，stocksolution)配制的目的1）方便配置其他培養(yǎng)基；2）保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時(shí)的快速移取3）便于低溫保藏。

2.2母液配制方法（1）單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。（2）混配法：將幾類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱(chēng)量，分別溶解后每一類(lèi)混合在一起定容到一定體積配成混合母液.2培養(yǎng)基母液的配制和保存第37頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）一般原則：一般母液配成比所需濃度高10-1000倍。母液配制時(shí)可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類(lèi)等。其中維生素、氨基酸類(lèi)可以分別配制，也可以混在一起配制時(shí)注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca2+和SO42-，Ca2+、Mg2+和PO43-

一起溶解后，會(huì)產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。母液配好后放冰箱內(nèi)低溫保存，用時(shí)再按比例稀釋。第38頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）母液配制的藥品與器材1）藥品：配制MS培養(yǎng)基所需的藥品、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、蒸餾水、1mol/L的NaOH，1mol/L的HCl2）器材：各類(lèi)天平、燒杯、容量瓶、量筒、母液瓶、標(biāo)簽、冰箱等。第39頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天（5）母液配制（以MS培養(yǎng)基為例）有機(jī)物母液鐵鹽母液無(wú)機(jī)大量母液無(wú)機(jī)微量母液激素母液第40頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天配制MS培養(yǎng)基時(shí)母液的計(jì)算第41頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天A無(wú)機(jī)大量母液(擴(kuò)大10倍配1L)成分硝酸鉀

硝酸銨硫酸鎂

磷酸二氫鉀氯化鈣稱(chēng)量工具托盤(pán)天平百分電子天平注意：無(wú)機(jī)大量母液中的各種物質(zhì)在混合過(guò)程中有些離子易產(chǎn)生沉淀，應(yīng)使每種物質(zhì)先充分溶解，再進(jìn)行混合，而且鈣鹽最后緩慢加入進(jìn)去。第42頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天硼酸，硫酸銅，硫酸錳，硫酸鋅，氯化鈷，鉬酸鈉，碘化鉀萬(wàn)分電子天平B無(wú)機(jī)微量母液（擴(kuò)大100倍配1000ml）稱(chēng)量工具成分第43頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天C鐵鹽（擴(kuò)大100倍1000ml）鐵鹽硫酸亞鐵，Na2-EDTA注意：鐵鹽選用硫酸亞鐵而不用硫酸鐵，是因?yàn)樗芙夂笠桩a(chǎn)生紅色的氫氧化鐵沉淀。在裝有800ml蒸餾水的燒杯中加入2粒氫氧化鈉。溶解后加入3.73gEDTA-Na2，加熱使其全部溶解，然后邊攪拌邊慢慢加入2.78gFeSO4.7H2O直至全部溶解，冷卻后定容至1000ml，置于冰箱中備用。第44頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天D有機(jī)物（擴(kuò)大50倍500ml）有機(jī)物甘氨酸VB1VB6煙酸肌醇注意：有機(jī)物中的物質(zhì)均采用電子天平稱(chēng)取。第45頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天E激素母液（常用的）生長(zhǎng)素NAA，IBA，2,4-D，IAA細(xì)胞分裂素6-BA，KT，GA，ZT注意：這些激素配制時(shí)，一般配成0.2-1mg/ml，NAA、IBA、IAA一般可先用少量無(wú)水乙醇助溶。2,4-D也可用0.1mol／L的NaOH或KOH助溶，細(xì)胞分裂素類(lèi)一般先用少量0.1mol／L鹽酸溶解后，再加入溫水冷卻后定容。第46頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天(6)母液的保存1)裝瓶:將配制好的母液分別倒入瓶中，貼好標(biāo)簽，在標(biāo)簽上注明母液名稱(chēng)，配制倍數(shù)，與配制日期。2）儲(chǔ)藏：母液配好后放人冰箱內(nèi)4℃低溫保存，用時(shí)再按比例稀釋。第47頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天3培養(yǎng)基的配制1)用具器材：粗天平、塑料量杯、燒杯、量筒、移液管、三角瓶、玻璃棒、藥勺、pH試紙（5.4-9.0）/酸度計(jì)、橡皮吸球、吸水紙、羊皮紙等。2)藥品試劑：蒸餾水、蔗糖、瓊脂、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、各種培養(yǎng)基母液3.1實(shí)驗(yàn)用品第48頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.2培養(yǎng)基配制（以1L百合繼代培養(yǎng)基為例）

1)培養(yǎng)基配方：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+3%蔗糖+0.8%瓊脂2)配方成分計(jì)算：大量元素（擴(kuò)大10倍配1L）微量元素（擴(kuò)大100倍配1000ml）有機(jī)物（擴(kuò)大50倍配500ml）鐵鹽（擴(kuò)大100倍配1000ml）6-BA(0.5mg/ml)NAA(0.1mg/ml)蔗糖瓊脂100ml10ml10ml10ml3ml2ml30g8g第49頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天母液的稀釋計(jì)算吸取量=需要配制培養(yǎng)基的體積X需要配制濃度母液濃度第50頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天3)配制步驟其他準(zhǔn)備加瓊脂第51頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)常用培養(yǎng)基的配方及其特點(diǎn)1培養(yǎng)基的種類(lèi)1.1根據(jù)其態(tài)相不同分為固體培養(yǎng)基：是指加凝固劑（如瓊脂）的培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基：是指不加凝固劑的培養(yǎng)基。

1.2根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過(guò)程分為初代培養(yǎng)基：是指用來(lái)第一次接種從植物體上分離下來(lái)的外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基：是指用來(lái)接種繼初代培養(yǎng)之后的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。第52頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.3根據(jù)其作用不同分為誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基1.4根據(jù)其營(yíng)養(yǎng)水平不同分為基本培養(yǎng)基：主要有MS、White、B5、N6、改良MS、Heller、Nitsh、Miller、SH等完全培養(yǎng)基：就是在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)的不同需要，附加一些物質(zhì)，如植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和其它復(fù)雜有機(jī)附加物等。下面介紹幾種基本培養(yǎng)基:第53頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天基本培養(yǎng)基◆無(wú)機(jī)鹽、離子濃度高，含高K、N，硝酸鹽含量較高，含銨鹽?！魻I(yíng)養(yǎng)豐富◆加速合作愈傷組織和培養(yǎng)物生長(zhǎng)1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來(lái)的。MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基White培養(yǎng)基第54頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天基本培養(yǎng)基◆無(wú)機(jī)元素用量是MS的1/3－1/2◆微量種類(lèi)少◆無(wú)肌醇MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基White培養(yǎng)基第55頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天基本培養(yǎng)基◆無(wú)機(jī)鹽量較低◆使用廣泛◆適合生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)等提高了MgSO4的濃度和增加了硼素。其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基White培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基第56頁(yè),共62頁(yè)，2024年2月25日，星期天基本培養(yǎng)基◆含較低的銨，硝酸鹽和鹽酸硫胺素用量較高?！暨m合雙子葉植物，尤其木本植物組培。1968年由Galmbo