凝膠過(guò)濾與高效液相色譜

1關(guān)于凝膠過(guò)濾與高效液相色譜2凝膠第2頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天3第3頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天4優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、重復(fù)性好和樣品回收率高等特點(diǎn)。

適用于：

a.分離純化蛋白質(zhì)(包括酶類)、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物質(zhì)

b.測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量

c.樣品的濃縮和脫鹽等方面。第4頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天5一、凝膠的分類及性質(zhì)性質(zhì)：凝膠不溶于水，但在水中有較大的膨脹度和較好的分子篩功能。分類：葡聚糖凝膠、天然瓊脂糖和交聯(lián)瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠(生物膠)和交聯(lián)葡聚糖與雙丙烯酰胺共聚的凝膠等。第5頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天6第6頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天7（一）葡聚糖凝膠商品名：Sephadex，它是由葡聚糖[右旋糖酐(G型)；和3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷（交聯(lián)劑)以醚鏈相互交聯(lián)而成的。在交聯(lián)葡聚糖G-25和G-50中分別加入羥丙基基團(tuán)反應(yīng)，即可構(gòu)成LH型烷基化葡聚糖凝膠。第7頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天8第8頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天9第9頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天101．理化性質(zhì)葡聚糖凝膠：白色珠狀顆粒，在顯微鏡下可見(jiàn)其表面的網(wǎng)狀皺紋。它帶有大量的羥基，親水性好，在水溶液或電解質(zhì)溶液中極易膨脹。不同型號(hào)的葡聚糖凝膠的交聯(lián)度(交聯(lián)劑在葡聚糖凝膠中占的百分?jǐn)?shù))不同，使其在水中的膨脹度(床體積)、吸水量(每克干凝膠在水中充分膨脹時(shí)所需的水量。但不包括顆粒間所帶的水量)、篩孔的大小和分組范圍有明顯的差異。第10頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天11第11頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天12例如，SephadexG-25比G-100交聯(lián)度大。而膨脹度、吸水量和篩孔直徑前者小于后者。另外，前者對(duì)球形蛋白質(zhì)的分級(jí)范圍較窄，即在1000(下限)-5000(上限)之間，而后者的分級(jí)范圍較寬，即在4000-150000之間。第12頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天13

本質(zhì)：葡聚糖凝膠置鹽溶液或清潔劑中引起的膨脹程度并不影響樣品的分級(jí)效果。但鹽溶液或清潔劑能改變分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)時(shí)，則會(huì)影響分級(jí)效果。葡聚糖凝膠的型號(hào)不同，其性質(zhì)亦不同。第13頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天141）以G型葡聚糖凝膠(經(jīng)水溶液膨脹)作為固定相，以水溶液作為流動(dòng)相，對(duì)水溶性物質(zhì)進(jìn)行分離的層析方法稱為葡聚糖凝膠過(guò)濾層析。

2）以LH型葡聚糖凝膠(經(jīng)乙醇或二甲亞砜甲酰胺或N,N-二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑膨脹)作為固定相，以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，對(duì)脂溶性物質(zhì)進(jìn)行分離的層析方法稱為葡聚糖凝膠滲透層析。第14頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天152．穩(wěn)定性葡聚糖凝膠在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機(jī)溶劑中穩(wěn)定，不溶解，很少產(chǎn)生化學(xué)降解。

在中性條件下，葡聚糖凝膠懸浮液可置高溫(120℃)消毒30分鐘，其性質(zhì)并不改變。在0.1mol/LHCl溶液中浸泡1-2小時(shí)，甚至在0.02mol/LHCl溶液中浸泡6個(gè)月以上，對(duì)分離效果無(wú)明顯的影響。耐酸、耐堿、耐高溫第15頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天16但當(dāng)暴露于強(qiáng)酸或氧化劑溶液時(shí)，易使糖苷鍵水解斷裂，要避免與其接觸。葡聚糖凝膠欲在室溫下長(zhǎng)期保存時(shí)，應(yīng)加入適量的防腐劑如氯仿、疊氮化鈉等。否則，微生物將生長(zhǎng)。第16頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天17

3．吸附性葡聚糖凝膠系弱酸性物質(zhì),由于其每克干膠中含10-20微克當(dāng)量的羧基基團(tuán)所致。該基團(tuán)能與分離物中電荷基團(tuán)(尤其是堿性蛋白質(zhì))發(fā)生吸附作用。但這種吸附作用可用提高洗脫液的離子強(qiáng)度解決。當(dāng)離子強(qiáng)度大于0.05時(shí)，一般對(duì)弱堿性蛋白質(zhì)就無(wú)吸附力了。因此葡聚糖凝膠層析時(shí),常用含有NaCl的緩沖液作洗脫液。第17頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天18新葡聚糖凝膠對(duì)蛋白質(zhì)往往有不可逆的吸附力了。雖然吸附的數(shù)量較少，但是在制作測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，或者分離純化極難得到的物質(zhì)時(shí)，需先用易得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)層析，以便消除其影響。第18頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天19此外，葡聚糖凝膠對(duì)芳香族化合物或雜環(huán)化合物以及某些凝集素具有較強(qiáng)的吸附作用，若采用凝膠過(guò)濾層析分離它們時(shí)，往往利用的是吸附原理，而不是排阻原理。第19頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天20

（二）瓊脂糖凝膠瓊脂糖的商品名稱是因生產(chǎn)廠家不同而異：瑞典稱Sepharose,美國(guó)稱Bio-gelA；英國(guó)稱Segavac；丹麥Gelarose,我國(guó)的同類產(chǎn)品與瑞典相同，這些瓊脂糖中除Segavac外，都是以珠狀瓊脂糖凝膠形式出售。第20頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天21瓊脂糖凝膠按其濃度分：Sepharose2B(2％濃度)、4B(4％)和6B(6％)。Sepharose6B的機(jī)械強(qiáng)度大于2B，但是篩孔小于2B。瓊脂糖凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好，用瓊脂糖凝膠進(jìn)行柱層析時(shí)，流速可以快些。第21頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天22（三）聚丙烯酰胺凝膠商品名Bio-gel。是以甲撐雙丙烯酰胺（雙體）作為交聯(lián)劑，以過(guò)硫酸胺為催化劑，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑，將丙烯酰胺（單體）聚合而成的。當(dāng)改變單體濃度時(shí)，就可得吸水率不同的產(chǎn)物，商品型號(hào)有Bio-gelP-2到P-300。第22頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天23一般聚丙烯酰胺凝膠均制成珠狀顆粒，以干凝膠形式出售，使用前必須溶脹。

特點(diǎn)：不溶于水和普通有機(jī)溶劑，能在濃鹽、尿素和胍鹽等溶液中浸泡：在pHl-10或短時(shí)問(wèn)超過(guò)此pH值的溶液中較穩(wěn)定；要避免長(zhǎng)期與強(qiáng)酸和強(qiáng)堿接觸，否則，酰胺基將迅速發(fā)生分解（高溫條件）。

缺點(diǎn)：對(duì)芳香族的、酸性和堿性的化合物稍有吸附現(xiàn)象，使用離子強(qiáng)度略高的洗脫液操作可以克服第23頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天24第24頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天25第25頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天26

（四）SephacrylSephacryl由烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺被共價(jià)交聯(lián)制成的。屬硬性凝膠，具有一定大小的篩孔和少量的羧基基團(tuán)。Sephacryl吸水時(shí)，其珠狀顆粒直徑平均值為70μm。通常是用于水相系統(tǒng)中。若在有機(jī)相系統(tǒng)使用時(shí)，其孔徑大小略有變化。第26頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天27第27頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天28特點(diǎn)：在所有的溶劑中不溶解，化學(xué)降解也很少；它可在pH2-11范圍內(nèi)使用，當(dāng)pH低時(shí)，葡聚糖鏈將發(fā)生少許水解作用；在0.2mol/LNaOH溶液中(室溫下)處理100小時(shí),對(duì)其低流速和多孔性沒(méi)有明顯影響。用清潔劑(如SDS)、6mol/L鹽酸胍和8mol/L尿素活液可作為洗脫劑,高溫（120℃）消毒(pH7時(shí))處理后,層析性質(zhì)沒(méi)各明顯變化。第28頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天29Sephacryl能用于分離蛋白質(zhì)、核酸，多糖和蛋白聚糖(Proteoglycans)。也可用碩大的病毒顆粒(直徑?300-400)的分離。層析時(shí)，用細(xì)顆粒凝膠分辨率高。第29頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天30二、基本原理凝膠過(guò)濾層析的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以完全，或者部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外。而對(duì)某些小分子化合物則不能排阻。但可讓其在篩孔中自由地?cái)U(kuò)散、滲透。任何一種被分離的化合物在凝膠層析柱被排阻的范圍均在0-100％之間。第30頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天31其被排阻的程度可以用分配系數(shù)Kav(分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系)表示。Kav值的大小依賴于凝膠床的總體積(Vt)、外水體積(V。)以及分離物本身的洗脫體積(Ve)。即Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）在限定的層析條件下，Vt和Vo都為恒定值，而Ve則是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值小，反之則大。第31頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天32第32頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天33因此，在同一凝膠過(guò)濾柱上分離分子量不同的物質(zhì)時(shí)，由于流動(dòng)相的作用，這些分離物質(zhì)將發(fā)生排阻和擴(kuò)散效應(yīng)。若緩沖液連續(xù)的傾入柱中，柱中物質(zhì)的排阻和擴(kuò)散效應(yīng)也將連續(xù)的發(fā)生，其級(jí)終結(jié)果是分子量大的物質(zhì)先從柱中流出，分子量小的物質(zhì)則后從柱中流出，流出物用部分收集器分管等量或等時(shí)的收集起來(lái)，檢測(cè)后分段合并相同組分的各管流出物，即等于把分于量不同的物質(zhì)相互篩分開(kāi)了。第33頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天34影響篩分效果的因素：1）操作條件：如基質(zhì)的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等；

2）Kav值的差異性。Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小，乃至等于1或等于零(即使樣品個(gè)各組分的分子量相差很大)，則分離效果相差，或根本不能分開(kāi)。第34頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天35分配系數(shù)(Kav)既是判斷分離效果的一個(gè)參數(shù)，又是測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的一個(gè)依據(jù)。從公式Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）看出，只要測(cè)出床體積Vt和外水體積Vo以及洗脫體積Ve。即可計(jì)算出Kav，而凝膠床總體積Vt可用二種方法得到。第35頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天361）計(jì)算法，即根據(jù)層析柱體積計(jì)算其總體積。公式表示：Vt=∏r2h式中r為層析柱半徑，h為凝膠床高度；∏為圓周率。在用此公式計(jì)算凝膠床總體積時(shí)，須精確的分段測(cè)量，以防內(nèi)徑不均勻造成誤差，另外還須注意到，在層析過(guò)程中，尤其是軟膠操作壓力要小，以防凝膠床的高度降低。第36頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天372）測(cè)量法：由凝膠床的組成可知，床體積Vt等于外水體體積Vo、內(nèi)水體積Vi,與凝膠顆粒實(shí)際占有體積Vg之和。即Vt=Vo+Vi+Vg因Vg與Vt相比是很小的。可忽略不計(jì)，故Vt＝Vo十Vi第37頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天38Vo和Vi可通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得：分子量不同的混合液在凝膠中的內(nèi)水體積和外水體積中的分布不同。溶液中的分子大于凝膠孔徑上限者，不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，而被排阻在外水體積的溶液中。凝膠床的洗脫體積Ve剛好等于外水體積。即Ve=Vo(Kav=0)。溶液中的分子小于凝膠孔徑下限者，能自由進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，凝膠床的洗脫體積Ve應(yīng)等于凝膠床總體積、即Ve=Vt=Vo十Vi(Kav=1)。而溶液中的分子大小介于凝膠孔徑上限和下限之間者，則有一部分能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔、故其洗脫體積Ve是在Vo和Vt之間(Kav在0-1之間)。第38頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天39常選用：藍(lán)色葡聚糖2000作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。

其理由：

1）分子量大(為200萬(wàn))，呈藍(lán)色，在各種型號(hào)的葡聚糖凝膠中都被完全排阻；

2）借助本身的顏色，采用肉眼或分光光度儀檢測(cè)（在210nm或260nm及620nm)洗脫體積(即Vo)。第39頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天40缺點(diǎn)：在測(cè)定激酶等蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，不宜用藍(lán)色葡聚糖2000測(cè)定外水體積。因?yàn)樗鼘?duì)激酶有吸附作用。所以有時(shí)用巨球蛋白代替。測(cè)定內(nèi)水體積(Vi)的物質(zhì)：可選用硫酸銨、N-乙酰酪氨酸乙酯,或其它與凝膠無(wú)吸附力的小分子物質(zhì)。第40頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天41以床體積Vt（公式算）和測(cè)得值Vo來(lái)計(jì)算分配系數(shù)的值為Kav（計(jì)算法）。

若以床體積Vt(等于Vo十Vi)和測(cè)得值Vo來(lái)計(jì)算分配系數(shù)的值為Kd（測(cè)量法）。

同一層析條件下、對(duì)同一物質(zhì)計(jì)算出的Kav和Kd僅盡管有一定的差異性，但那是有效的。只因Kav計(jì)算方便，所以目前使用Kav較多。分離物在凝膠過(guò)濾層析時(shí)的行為，還可用Ve／Vo或Vo／Ve(R值)表示。第41頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天42

三、操作（一）凝膠的選擇和處理

1．凝膠的選樣

(1)型號(hào)

凝膠型號(hào)很多。型號(hào)不同，篩分范圍也不同。市售的Sephadex的分離范圍，常用高聚糖或球蛋白測(cè)定。SephadexG型一般適宜于分離蛋白質(zhì)。如果用于分離核酸時(shí)、則限于其空間結(jié)構(gòu)和所帶基團(tuán)的影響，選用高于它們分子量范圍的型號(hào)，或者選用適當(dāng)型號(hào)的生物膠和Sephacryl。第42頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天43在去除蛋白質(zhì)溶液中的鹽類時(shí)，可選用凝膠SephadexG-25。當(dāng)溶液通過(guò)G-25柱時(shí)、蛋白質(zhì)被排阻在凝膠外面先流出來(lái)，而鹽類擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)孔里后流出來(lái)。這樣蛋白質(zhì)就得到純化。一般來(lái)說(shuō)，在規(guī)定的篩分范圍內(nèi)，混合物之間分子量差別越大，分離的效果越好。第43頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天44

(2)粒度凝膠的粒度有粗有細(xì)(與交聯(lián)度無(wú)關(guān))。細(xì)顆粒凝膠之間空間小、裝柱易均一，因此分離效果好(與粗顆粒凝膠相比、但是由于細(xì)顆粒凝膠流速慢，故宜用大直徑的層析柱。這類凝膠用于小型試驗(yàn)，能得到滿意結(jié)果；而粗顆粒凝膠流速快宜用小直徑的層析柱，如操作得當(dāng)可得到較滿意的結(jié)果。第44頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天45第45頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天462．凝膠用量的計(jì)算根據(jù)層析柱的體積和干凝膠的膨脹度，公式可計(jì)算出所需干凝膠的用量：

干凝膠用量（g）=∏r2h/膨漲度（床體積/克干膠）

用此法計(jì)算出的干凝膠用量還需增加10%-20％，因?yàn)槟z在處理過(guò)程會(huì)有一部分損失。第46頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天47

3．凝膠的處理將所用的干凝膠緩慢的傾入5-10倍的蒸餾水中，根據(jù)凝膠溶漲所需的時(shí)間進(jìn)行充分浸泡，用傾斜法除去表面懸浮的小顆粒，

再用0.5mol/LNaOH-0.5molNaCl溶液在室溫下浸泡半個(gè)小時(shí)，以抽濾法除去堿液，用蒸餾水洗至中性，為了除去凝膠顆粒中空隙中的氣泡，可把處理過(guò)的凝膠浸泡于蒸餾水和平衡液中用抽氣方法實(shí)現(xiàn)。有時(shí)采用加熱煮沸方法，不僅能達(dá)到此目的，而且還能加快凝膠的溶脹速度。但是，必須避免置于酸或堿溶液中加熱。第47頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天48

（二）

凝膠柱的制備1.柱的選擇

層析柱重要組成部分。對(duì)層析柱（包括體積和長(zhǎng)度等）的選擇，將直接影響分離效果。

當(dāng)用同樣直徑的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時(shí)。長(zhǎng)層析柱比短的分辨率高；當(dāng)用同樣長(zhǎng)度的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時(shí)，層析柱直徑大的比小的分辨率高；當(dāng)用同樣體積的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時(shí)，仍是層析柱長(zhǎng)的比短的分辨率高。一般理想的層析柱之直徑與長(zhǎng)度之比是1:25-1:100。層析柱最好有夾套，可以控制溫度，重復(fù)性好。第48頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天49第49頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天50第50頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天512．裝柱裝柱前要先將層析柱垂直固定在支架上。

分類：干裝法和濕裝法兩種。

干裝法——直接加凝膠到柱中，然后倒入溶劑，此法不易將氣泡排盡。第51頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天52濕裝法——先加適量溶劑到柱內(nèi)，排走其中的空氣，然后把預(yù)先用溶劑浸泡好的凝膠攪勻，隨即將此懸浮液連續(xù)傾入到柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3時(shí)打開(kāi)柱下端出口，讓溶劑慢慢流出，使柱上端懸浮液徐徐下降至需要的高度。凝膠表面要平整,應(yīng)使其一直浸沒(méi)在溶劑中，嚴(yán)防氣泡產(chǎn)生。這一種裝柱法對(duì)各種基質(zhì)都適用。第52頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天533．凝膠柱的鑒定新裝的凝膠柱用適當(dāng)緩沖液平衡后，將藍(lán)色葡聚糖-2000，或紅色葡聚糖或細(xì)胞色素C或血紅蛋白等配成2毫克/毫升的溶液過(guò)柱，觀察色帶是否均勻下降。如均勻下降，則表明柱中凝膠是均勻的、柱中沒(méi)有裂縫和氣泡，否則須重新裝柱。如果凝膠柱鑒定時(shí)采用的是蛋白質(zhì)類物質(zhì)進(jìn)行，除能起到鑒定柱子的作用外，還可起到克服對(duì)某些分離物有不可逆吸附的作用。第53頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天54

（三）加樣與洗脫1．加樣加樣量與測(cè)定方法和層析柱大小有關(guān)。測(cè)定樣品含量的方法靈敏或床體積小時(shí)，加樣量可少。否則反之。

例如，—般測(cè)定蛋白質(zhì)的含量多用紫外分光光度法。當(dāng)采用280nm觀察消光讀數(shù)時(shí)，加樣量需5毫克左右(柱體積2×60cm)；當(dāng)采用220nm觀察消光讀數(shù)時(shí)，加樣量只需1.2毫克左右，加樣量掌握得當(dāng)，可提高分離效果。第54頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天55一般來(lái)說(shuō)，加樣量越少，或加樣體積越小(樣品濃度高時(shí))，分辨率越高。但是，當(dāng)用于樣品的制備和脫鹽時(shí)，加樣量應(yīng)在不影響分辨率的前提下增大。究竟加樣體積多少為宜？這要視被分離物在層析柱的分配系數(shù)(Kav)或洗脫體積(Ve)來(lái)決定。第55頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天56假設(shè)，A、B兩個(gè)被分離物在層析柱中的洗脫體積分別為VeA

、VeB，分配系數(shù)分別為Kav′，Kav″。A、B兩物洗脫體積之差稱為分離體積，以Vs表示。則Vs＝VeA-VeB。第56頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天57當(dāng)樣品體積(Vp)正好與Vs相等時(shí)，理論上的洗脫圖形是兩種物質(zhì)恰好分開(kāi)。但實(shí)際情況并非如此，由于樣品流過(guò)柱時(shí)的擴(kuò)散作用，其體積會(huì)逐漸增大，致使其洗脫體積遠(yuǎn)比原來(lái)大。因此，當(dāng)Vp等于或大于Vs時(shí)，A、B兩種物質(zhì)就不能完全分開(kāi)；而當(dāng)Vp小于Vs時(shí)，A、B兩種物質(zhì)就能分開(kāi)。根據(jù)Ve＝Vo十Kav（Vt-Vo)，則Vs＝VeA-VeB＝(Kav′-Kav″)(Vt—Vo)第57頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天58分離效果是與加樣體積、被分離樣品在層析柱中的洗脫體積或分配系數(shù)，以及凝膠床的體積有關(guān)。所以，為了提高分離效果，在一定范圍內(nèi)，加樣體積越小越好。例如在蛋白質(zhì)溶液中脫鹽時(shí)，因加樣量過(guò)大會(huì)產(chǎn)生分離不完全的現(xiàn)象。而加樣量減少時(shí)，則產(chǎn)生良好的分離效果。通常加樣體積為床體積的1-5%,最好不超過(guò)10%。第58頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天59此外，樣品的粘度也影響層析的分辨率。樣品的粘度大（η＝11.8)比小的分辨率低。因此，一般使用的樣品粘度以小于2，或者與洗脫液的粘度相當(dāng)為宜．

第59頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天60

2．洗脫所有的洗脫液均以能溶解被洗脫物質(zhì)和不使其變性或失活為原則。除個(gè)別特殊情況外。一般都以單一緩沖液(如磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液等)，或者鹽溶液作為洗脫液。有時(shí)甚至也可以用蒸餾水作洗脫液。第60頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天61洗脫時(shí)的流速要嚴(yán)格控制。否則收集的每一部分洗脫體積就不會(huì)恒定，理想的分配系數(shù)就難以測(cè)出?？刂屏魉俚淖詈醚b置是恒流泵(微量泵)，它不僅可以使流速恒定，而且還可以使其在較大范圍內(nèi)選擇。若無(wú)此裝置，可用控制操作壓的辦法進(jìn)行。事實(shí)上，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室是采用后一種方法進(jìn)行控制流速的。流速第61頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天62流速除與柱長(zhǎng)度有關(guān)外，還與柱直徑大小有關(guān)。為了防止層析柱中洗脫液流干，可按圖5-10裝置進(jìn)行操作。第62頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天63第63頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天64

一般說(shuō)來(lái)，洗脫流速慢，分離效果就好(見(jiàn)圖5-5及5-11)，但是太慢時(shí)也會(huì)因擴(kuò)散加劇而降低分離效果。加樣后，經(jīng)洗脫收集到的每管洗脫液，可選用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行定性和定量測(cè)定。

第64頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天65洗脫體積的計(jì)算

峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過(guò)凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時(shí)，(與洗脫體積比較可以忽略不計(jì))，在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從應(yīng)用樣品開(kāi)始到洗脫峰升高的彎曲點(diǎn)(或半高處)。第65頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天66分子量與洗脫體積的關(guān)系在凝膠分離范圍之內(nèi)，蛋白質(zhì)分子量與洗脫位置之間存在線性對(duì)應(yīng)關(guān)系。在一定分子量范圍內(nèi)洗脫體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)為線性關(guān)系，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

第66頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天67（四）凝膠柱的再生和保存

1．再生僅使用一次的凝膠柱，通常進(jìn)行重新平衡后即可使用。但使用過(guò)多次后，由于凝膠床體積變小，流動(dòng)速度降低或污染雜質(zhì)過(guò)多等原因，致使其正常性能受到影響。在此情況下，再生方法是：先用水反復(fù)進(jìn)行逆向沖洗。再用緩沖液進(jìn)行平衡。平衡畢，即可重復(fù)使用；另一種方法是，把凝膠倒出，用低濃度的酸或堿按其預(yù)處理方法進(jìn)行，處理后重新裝柱即可再行使用。第67頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天68

2．保存

使用過(guò)的凝膠柱，若要短時(shí)間保存，則需進(jìn)行反復(fù)洗滌除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，并加入適當(dāng)?shù)姆烂箘?；若要長(zhǎng)時(shí)間保存，則需將凝膠從柱中取出，進(jìn)行洗滌、脫水和干燥。其方法：將凝膠用低濃度的酸或堿溶液短時(shí)間浸泡后，再用水反復(fù)洗滌過(guò)濾抽干，并浸泡在濃度稍高的乙醇溶液中。第68頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天69如此依次提高乙醇濃度進(jìn)行反復(fù)處理，待乙醇濃度增加至95％時(shí)，將凝膠抽干。置60℃烘箱中烘干，可裝瓶保存。在此過(guò)程中，溶脹的凝膠不能直接用高溫烘烤，否則會(huì)粘結(jié)成塊(機(jī)械搗碎會(huì)破壞珠狀結(jié)構(gòu))。交聯(lián)度越小的葡聚糖凝膠，越難以脫水。一般可采用將其較長(zhǎng)時(shí)間浸泡在的60％-70％乙醇溶液中的作法來(lái)達(dá)到這一目的。第69頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天70第70頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天71核酸蛋白檢測(cè)儀及記錄儀（正面）第71頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天72核酸蛋白檢測(cè)儀及記錄儀（背面）第72頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天73返回第73頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天74核酸蛋白檢測(cè)儀返回第74頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天75記錄儀返回第75頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天76部分收集器部分收集器返回第76頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天77返回第77頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天78第78頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天79返回第79頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天80裝柱示意圖返回第80頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天81第三節(jié)高效液相色譜高效液相色譜(HighPerformanceLiguidChromatograph簡(jiǎn)稱HPLC)又稱高速或高壓液相色譜。

特點(diǎn)：三高：高效（高分辨率和高靈敏度）、高速、高壓第81頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天82優(yōu)點(diǎn)：吸收了普通液相層析和氣相色譜的優(yōu)點(diǎn)；它既有普通液相層析的功能(可在常溫下分離制備水溶性的物質(zhì))，又有氣相色譜的特點(diǎn)(即高壓、高速、高分辨率和高靈敏度)；適用于很多不易揮發(fā)，難熱分解物質(zhì)(如金屬離子、蛋白質(zhì)、肽類、氨基酸及其衍生物、核苷、核苷酸、核酸、單糖、寡糖和激素等)的定性和定量分析，及其制備和分離。第82頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天83第83頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天84特別是近年來(lái)出現(xiàn)一種與HPLC相近的快速蛋白液相色譜(FastProteinLiquidChromatographFPLC)，能在惰性條件下，以極快的速度把復(fù)雜的混合物通過(guò)成百上千次層析分開(kāi)。如果連續(xù)進(jìn)樣，一天內(nèi)可制出大量的欲純化物質(zhì)。第84頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天85高效凝膠色譜疏水性高效液相色譜

反相高效液相色譜高效離子交換液相色譜高效親和液相色譜高效聚焦液相色譜等類型。

它們的原理基本上與相對(duì)應(yīng)的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好，且須在色譜儀中進(jìn)行。按其固定相的性質(zhì)可分：第85頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天86高效液相色譜儀

五大系統(tǒng)：進(jìn)樣系統(tǒng)輸液系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。第86頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天87第87頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天88第88頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天891．進(jìn)樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣閥（六通閥）完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。第89頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天902.輸液系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的壓強(qiáng)為1.47-4.4×107Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，高壓流動(dòng)相通過(guò)柱層析，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。第90頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天91（1）高壓泵第91頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天92流動(dòng)相貯存器和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH值、或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲得有效分離。第92頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天93(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第93頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天943.分離系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。

色譜柱長(zhǎng)度為10-50cm(需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管)。內(nèi)徑為2-5mm。由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為5-10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成)。第94頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天95(1)高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。第95頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天96固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹(shù)脂或硅膠構(gòu)成。

特點(diǎn)：

惰性(如硅膠表面的硅醇基團(tuán)基本已除去)

多孔性(孔徑可達(dá)1000A)和比表面積大

加之其表面經(jīng)過(guò)機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)或用化學(xué)法偶聯(lián)各種基團(tuán)(如磺酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化臺(tái)物。

這類固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。第96頁(yè),共105頁(yè)，2024年2月25日，星期天97另外，固定相基質(zhì)粒度小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)編小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論(即塔板理論數(shù)N與理論塔板高度H成反比，而H與顆粒度的平方成正比)分析，基質(zhì)粒度越小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。

高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60℃，通過(guò)改善