丙型肝炎檢測(cè)

關(guān)于丙型肝炎檢測(cè)目前丙型肝炎檢測(cè);

一、HCV抗體檢測(cè)二、HCV抗原檢測(cè)三、HCV核酸檢測(cè)四、HCV基因型檢測(cè)五、HCV細(xì)胞培養(yǎng)第2頁,共54頁，2024年2月25日，星期天丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)第3頁,共54頁，2024年2月25日，星期天一、抗-HCV檢測(cè)的目的意義1、抗-HCV檢測(cè)可用于診斷、血液篩查、流行病監(jiān)測(cè)等。2、以診斷為目的的檢測(cè)是為了確定個(gè)體HCV感染狀況。3、以血液篩查為目的的檢測(cè)是為了防止輸血傳播HCV，包括獻(xiàn)血員篩查和原料血漿篩查。4、以流行病監(jiān)測(cè)為目的的檢測(cè)是為了解不同人群HCV感染率及其變化趨勢(shì)，包括各類高危人群、重點(diǎn)人群和一般人群。第4頁,共54頁，2024年2月25日，星期天二、抗-HCV檢測(cè)的方法抗-HCV檢測(cè)分為篩查試驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、膠體金法快速試驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)）和補(bǔ)充試驗(yàn)（免疫印跡試驗(yàn)）。第5頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（一）篩查試驗(yàn)1、抗-HCV酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是抗-HCV檢測(cè)常用的篩查方法。其基本原理是以HCV抗原包被固相載體，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG與被檢樣品中的抗-HCV反應(yīng)，以鄰苯二胺（OPD）或3，3‘，5，5’—四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等底物顯色后，利用酶標(biāo)儀等儀器進(jìn)行陰陽性結(jié)果判斷。其主要反應(yīng)過程如下：加入經(jīng)樣本稀釋液稀釋的被檢樣品，樣品中的抗-HCV與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物；固相載體上只留下抗-HCV，其他免疫球蛋白及樣品中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去；加酶標(biāo)抗抗體與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶；洗滌后，固相載體上的酶量就顯示特異性抗體的量；加底物顯色及終止液，利用酶標(biāo)儀等儀器分析結(jié)果。第6頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2、化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)

化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）是將具有高度敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法以標(biāo)記方法的不同而分為兩種：（1）化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析法：化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA)，是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析法。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物，是有效的發(fā)光標(biāo)記物，通過起動(dòng)發(fā)光試劑作用而發(fā)光，強(qiáng)烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成，為快速的閃爍發(fā)光。吖啶酯作為標(biāo)記物用于免疫分析，其化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、無須催化劑；檢測(cè)小分子抗原采用競(jìng)爭(zhēng)法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結(jié)合少，本底低；與大分子的結(jié)合不會(huì)減少所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。第7頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（2）化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法：從標(biāo)記免疫分析角度，化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA)應(yīng)屬酶免疫分析，只是反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，操作步驟與ELISA分析完全相同。以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)（如酶標(biāo)記的抗原或抗體）進(jìn)行免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。該方法又分為如下幾類：①HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的CLEIA：常用的底物為魯米諾或其衍生物如異魯米諾。是一類重要的發(fā)光試劑。魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行，在過氧化物酶及活性氧（過氧化陰離子O2-，單線態(tài)氧O2，羥自由基OH-，過氧化氫H2O2)存在下生成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，其波長(zhǎng)為425nm。早期用魯米諾直接標(biāo)記抗原或抗體，但標(biāo)記后發(fā)光強(qiáng)度降低而使靈敏度收到影響。近來用過氧化物酶標(biāo)記抗體，進(jìn)行免疫反應(yīng)后利用魯米諾作為發(fā)光底物，在過氧化物酶和起動(dòng)發(fā)光試劑（NaOH2H2O2）作用下，魯米諾發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度依賴于酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度。第8頁,共54頁，2024年2月25日，星期天②增強(qiáng)發(fā)光酶免疫分析（enhancedluminescenceenzymeimmunoassayELEIA）在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強(qiáng)發(fā)光劑以增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，便于重復(fù)測(cè)量，從而提高分析靈敏度和準(zhǔn)確性。③ALP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的CLEIA

所用底物為環(huán)1，22二氧乙烷衍生物，用于化學(xué)發(fā)光酶免分析底物而設(shè)計(jì)的分子結(jié)構(gòu)中包含起穩(wěn)定作用的基團(tuán)—金剛烷基，其分子中發(fā)光基團(tuán)為芳香基團(tuán)和酶作用的基團(tuán)，在酶及起動(dòng)發(fā)光試劑作用下引起化學(xué)發(fā)光。

第9頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3膠體金法快速試驗(yàn)（1）免疫滲濾試驗(yàn)：斑點(diǎn)免疫膠體金快速試驗(yàn)以硝酸纖維膜為載體，HCV抗原點(diǎn)狀固定在膜上，加待檢樣品。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間在10分鐘以內(nèi)。有效試驗(yàn)的質(zhì)控點(diǎn)必須顯色。（2）免疫層析試驗(yàn)：以硝酸纖維膜為載體，HCV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品沿著固相載體遷移，陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗(yàn)的質(zhì)控線必須顯色。第10頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（二）抗體補(bǔ)充試驗(yàn)抗體補(bǔ)充試驗(yàn)?zāi)壳俺Ｓ玫臑槊庖哂≯E試驗(yàn)。免疫印跡法試劑一般將HCV不同編碼區(qū)抗原多種成分噴涂在硝酸纖維薄膜條上，并設(shè)置了兩種不同濃度的人IgG對(duì)照帶和一條hSOD對(duì)照帶，用于內(nèi)部對(duì)照和結(jié)果判斷。其診斷HCV感染的敏感性高、特異性強(qiáng)，可檢測(cè)針對(duì)HCV不同編碼區(qū)抗原的抗體，且不需要特殊的儀器設(shè)備。第11頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（三）抗-HCV檢測(cè)策略及結(jié)果報(bào)告1、疫情監(jiān)測(cè)相關(guān)的檢測(cè)策略及結(jié)果報(bào)告先用篩查試劑-1進(jìn)行初篩試驗(yàn)，結(jié)果呈陰性反應(yīng)，報(bào)告“抗-HCV陰性”，不再進(jìn)行復(fù)檢試驗(yàn)；結(jié)果呈陽性反應(yīng)，進(jìn)入復(fù)檢試驗(yàn)。所有初篩陽性反應(yīng)的樣品使用篩查試劑-2進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果呈陰性反應(yīng)，報(bào)告“抗-HCV陰性”；結(jié)果呈陽性反應(yīng)，報(bào)告“抗-HCV陽性”。第12頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2、臨床診斷相關(guān)的檢測(cè)策略及結(jié)果報(bào)告⑴篩查試驗(yàn)用篩查試劑進(jìn)行初篩，結(jié)果成陰性反應(yīng)，報(bào)告“抗-HCV陰性”；結(jié)果成陽性反應(yīng)，不能出具陽性報(bào)告，必須進(jìn)入復(fù)檢試驗(yàn)。對(duì)初篩呈陽性反應(yīng)的樣品用原有試劑雙孔或原有試劑加另一種不同原理（或廠家）試劑進(jìn)行復(fù)檢試驗(yàn)，如均呈陰性反應(yīng)，報(bào)告“抗-HCV陰性”；如均呈陽性反應(yīng)或一陰一陽反應(yīng)，進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)。臨床診斷篩查檢測(cè)流程見圖4第14頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共54頁，2024年2月25日，星期天(2)補(bǔ)充試驗(yàn)⑴臨床診斷補(bǔ)充試驗(yàn)方法-1

復(fù)檢試驗(yàn)陽性反應(yīng)樣品，進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。結(jié)果陰性者，報(bào)告“抗-HCV陰性”；結(jié)果陽性者，報(bào)告“抗-HCV陽性”；結(jié)果不確定者，報(bào)告“抗-HCV不確定”，并進(jìn)行隨訪。臨床診斷補(bǔ)充試驗(yàn)檢測(cè)方法一流程見圖5。第16頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共54頁，2024年2月25日，星期天⑵臨床診斷補(bǔ)充試驗(yàn)方法-2此方法僅限于檢測(cè)方法/試劑給出了特定閾值（與抗體補(bǔ)充試驗(yàn)比較，其陽性的預(yù)測(cè)值≥95%）時(shí)使用。高S/CO比值：當(dāng)S/CO比值≥特定的閾值時(shí)；低S/CO比值：其S/CO比值<特定的閾值。初篩和復(fù)檢第18頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

初篩和復(fù)檢均為陽性，且有樣品OD值與臨界值（Cutoff）的比值（S/CO）≥試劑說明書中給出的特定閾值，可報(bào)告“抗-HCV陽性”，無需再做免疫印跡試驗(yàn)；否則，還應(yīng)進(jìn)一步作免疫印跡試驗(yàn)。免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果陽性者，報(bào)告“抗-HCV陽性”；結(jié)果不確定者，報(bào)告“抗-HCV不確定”并進(jìn)行隨訪。第20頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3、血液篩查相關(guān)的檢測(cè)策略及結(jié)果報(bào)告

獻(xiàn)血/漿員體檢合格后抽血檢驗(yàn)。用抗體篩查試劑進(jìn)行初篩，結(jié)果呈陽性反應(yīng)，報(bào)告“抗-HCV陽性待查”，獻(xiàn)血/漿員暫停獻(xiàn)血，如果需要進(jìn)一步診斷獻(xiàn)血/漿員感染狀況，執(zhí)行臨床診斷策略；結(jié)果呈陰性反應(yīng)，報(bào)告“抗-HCV初篩陰性”，獻(xiàn)血/漿員獻(xiàn)血，進(jìn)入復(fù)檢試驗(yàn)。對(duì)初篩呈陰性反應(yīng)的樣品用另一種抗體篩查試劑進(jìn)行復(fù)檢試驗(yàn)。如呈陰性反應(yīng)，報(bào)告“抗-HCV陰性”，血液供應(yīng)臨床；如呈陽性反應(yīng)，則報(bào)告“抗-HCV陽性待查”，血液報(bào)廢，如果需要進(jìn)一步診斷獻(xiàn)血/漿員感染狀況，執(zhí)行臨床診斷策略。

第21頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共54頁，2024年2月25日，星期天4.檢測(cè)結(jié)果的解釋第23頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

丙型肝炎病毒抗原檢測(cè)㈠HCV抗原檢測(cè)的目的意義1、HCV血清陽轉(zhuǎn)前的早期急性丙型肝炎輔助診斷，尤其有助于HCV感染窗口期患者、抗-HCV檢測(cè)結(jié)果不確定患者或HCV陽性母親所生嬰兒是否罹患丙型肝炎的輔助診斷。2、免疫受損或先天性免疫缺陷群體如HIV感染者、長(zhǎng)期透析的腎病患者、器官移植患者或先天性免疫功能缺陷患者等HCV感染的篩查。3、抗-HCV陽性感染者的病毒血癥分析。4、HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析。第24頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（二）HCV抗原檢測(cè)的方法

目前抗原檢測(cè)ELISA試劑采用雙抗體夾心法定性或定量檢測(cè)樣品中游離的HCV核心抗原（包括抗原抗體復(fù)合物和游離核心抗原）。基本原理：以基因工程核心抗原免疫小鼠后所獲得的純化抗-HCV核心抗原單克隆抗體作為固相包被物，用與固相包被物有不同抗原決定簇的抗-HCV核心抗原單克隆抗體作為辣根過氧化物酶標(biāo)記物，與樣品中總的或游離的HCV核心抗原反應(yīng)，OPD顯色后進(jìn)行定性或定量測(cè)定。第25頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

大部分HCV抗原檢測(cè)試劑檢測(cè)的是樣品中游離核心抗原以及和抗-HCV結(jié)合的核心抗原，因此在進(jìn)行檢測(cè)之前需要加入尿素、鹽酸及去垢劑等，以解離樣品中的核心抗原-核心抗體免疫復(fù)合物。其它操作程序與一般的ELISA或發(fā)光技術(shù)操作基本相同，即：第一步加入待測(cè)樣品，孵育后，洗去未結(jié)合的成分，加入酶標(biāo)記或發(fā)光物質(zhì)的抗核心抗原的二抗，孵育后顯色，再加入終止液終止顯色，用酶標(biāo)儀比色計(jì)算s/co值，來進(jìn)行陰性和陽性反應(yīng)的判斷。第26頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

將HCV抗原的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)，還可進(jìn)行HCV抗原的定量檢測(cè)。以橫坐標(biāo)為HCV抗原的濃度（pg/ml），縱坐標(biāo)為OD值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)出待測(cè)樣品的OD值以后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出抗原的濃度。如果待測(cè)樣品的OD值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線上最高抗原濃度的OD值，則需用陰性血清將樣品稀釋以后再行檢測(cè)。第27頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（三)檢測(cè)策略及結(jié)果報(bào)告

初次檢測(cè)抗原陰性樣品，報(bào)告為“HCV抗原陰性”；初次檢測(cè)抗原陽性反應(yīng)樣品，需要雙孔復(fù)檢。如果雙孔復(fù)檢結(jié)果均為陰性，報(bào)告為“HCV抗原陰性”；如果雙孔檢測(cè)結(jié)果至少有一孔結(jié)果為陽性反應(yīng)，則報(bào)告為“HCV抗原陽性”。第28頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

丙型肝炎病毒核酸檢測(cè)

（一）HCV核酸檢測(cè)的目的意義1、HCVRNA定性檢測(cè)可用于血液篩查領(lǐng)域，可使用單份樣品或多樣品集合的方法，對(duì)獻(xiàn)血員血液及單采血漿站的原料血漿進(jìn)行核酸檢測(cè)，降低輸血?dú)堄嚯U(xiǎn)度。2、HCVRNA定性檢測(cè)可用于對(duì)HCV抗體陰性的高危人群樣品進(jìn)行集合核酸檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)窗口期感染。3、HCVRNA定量檢測(cè)的意義主要體現(xiàn)在作為抗病毒治療療效的判斷指標(biāo)，指導(dǎo)抗病毒治療及療效判定。第29頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（四）檢測(cè)結(jié)果的解釋1、陰性結(jié)果的解釋由于目前抗原檢測(cè)試劑的靈敏度較低，最靈敏的檢測(cè)試劑只能達(dá)到相當(dāng)于500IU/ml水平的HCVRNA，因此陰性的結(jié)果并不能排除HCV現(xiàn)癥感染的可能。2、陽性結(jié)果的解釋現(xiàn)階段，HCV抗原陽性僅作為HCV感染的輔助診斷依據(jù)，不能據(jù)此確診。特別是對(duì)處于“灰區(qū)”的陽性結(jié)果，需要結(jié)合臨床表現(xiàn)及HCVRNA、抗-HCV等檢測(cè)結(jié)果來解釋。監(jiān)測(cè)病程進(jìn)展或抗病毒治療效果應(yīng)進(jìn)行HCV抗原的定量檢測(cè)。第30頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（二）HCV核酸檢測(cè)的方法1、RT-PCR檢測(cè)技術(shù)傳統(tǒng)PCR定性檢測(cè)HCVRNA需要三個(gè)步驟：①對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行處理：通過裂解、純化，提取樣品中的HCVRNA作為PCR擴(kuò)增的模板；②采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)對(duì)提取到的HCVRNA進(jìn)行擴(kuò)增；③檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)方法包括凝膠電泳和PCR-酶聯(lián)免反應(yīng)（PCR-ELISA）等。第31頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2、TMA檢測(cè)技術(shù)TMA是一種利用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶2種酶的共同作用，在等溫條件下來擴(kuò)增RNA的反應(yīng)系統(tǒng)。TMA使用的引物含有T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，使得反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA可以作為T7RNA聚合酶的模板，在T7RNA聚合酶的作用下合成大量的RNA拷貝。擴(kuò)增出來的RNA重新進(jìn)入TMA循環(huán)，成為下一輪復(fù)制的模板。TMA優(yōu)點(diǎn)在于特異性強(qiáng)、靈敏度高，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、擴(kuò)增只需一個(gè)溫度，無需專門的熱循環(huán)儀器，且因整個(gè)反應(yīng)在一個(gè)試管中進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物RNA易于降解，從而大大減少了污染的可能?；赥MA技術(shù)的VERSANTHCVRNA定性檢測(cè)可檢測(cè)到極低水平的HCVRNA，甚至可低至5IU/ml。第32頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET）的原理，當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一熒光基團(tuán)的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長(zhǎng)（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長(zhǎng)波長(zhǎng)（低能量）的熒光基團(tuán)，這個(gè)過程稱為FRET?；贔RET原理，出現(xiàn)了不同種類的熒光PCR，主要體現(xiàn)在探針設(shè)計(jì)的不同，如TaqMan探針、分子信標(biāo)和熒光雜交探針。以目前我國(guó)應(yīng)用最廣泛的TaqMan熒光標(biāo)記探針的定量PCR為例，是在探針（probe）的兩端偶聯(lián)一個(gè)短波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)（報(bào)告基團(tuán)）和一個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光淬滅基團(tuán)，這兩個(gè)基團(tuán)位置靠近，熒光基團(tuán)不發(fā)熒光；Taq酶在發(fā)揮5'→3'方向聚合酶活性的同時(shí)，還具有5'→3'方向的外切酶活性，可使探針降解，熒光淬滅基團(tuán)從而解離、遠(yuǎn)離熒光基團(tuán)，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光，熒光的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的量相關(guān)，通過計(jì)算可得出具體的量值。第33頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

熒光定量PCR檢測(cè)HCVRNA的操作程序包括：RNA提取、PCR擴(kuò)增、熒光檢測(cè)及結(jié)果分析。目前一般的熒光定量PCR儀都帶有相應(yīng)的分析軟件，輔助設(shè)定閾值及Ct值，也允許操作者在合理的范圍內(nèi)自行調(diào)整。一個(gè)良好的PCR反應(yīng)反映到標(biāo)準(zhǔn)曲線上，就是標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性良好，（r2通常＞0.99），斜率（反映擴(kuò)增的效率）在指定的范圍內(nèi)。但采用外標(biāo)法定量的試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增良好也不一定意味著樣品一定擴(kuò)增良好，因?yàn)檫€涉及RNA提取質(zhì)量的問題，因此特別要注意考察陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控的結(jié)果，陰性結(jié)果必須沒有擴(kuò)增曲線，而陽性質(zhì)控必須擴(kuò)增曲線良好，結(jié)果落入指定的區(qū)間內(nèi)。第34頁,共54頁，2024年2月25日，星期天4、b-DNA技術(shù)

分支DNA（bDNA）技術(shù)基于其獨(dú)特的信號(hào)放大系統(tǒng)，即bDNA信號(hào)放大系統(tǒng)，這是一個(gè)人工合成的bDNA，bDNA的分枝可結(jié)合多個(gè)酶標(biāo)記物，從而將病毒的信號(hào)放大，以便進(jìn)行檢測(cè)。利用序列特異的寡聚核苷酸探針雜交捕捉HCVRNA，HCVRNA隨后與支鏈DNA(bDNA）二級(jí)探針雜交，bDNA再與酶聯(lián)三級(jí)探針結(jié)合，隨后加入酶底物，產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與靶DNA的量成正比。第35頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

操作程序包括：首先激昂血漿樣品離心，濃縮其中的病毒顆粒，HCVRNA釋放后加入微孔板中，板孔中包被有可與病毒載體特異結(jié)合的一系列靶探針，另一系列靶探針的一端可標(biāo)記在游離的病毒核酸鏈上，另一端可與bDNA結(jié)合，加入酶標(biāo)記物對(duì)結(jié)合的bDNA進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)過清洗后加入底物進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)強(qiáng)度。本方法定量系統(tǒng)中沒有內(nèi)標(biāo)記物，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)定實(shí)驗(yàn)樣品的病毒拷貝數(shù)。第36頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（三）檢測(cè)策略及結(jié)果報(bào)告1、HCV核酸定性檢測(cè)用于血液篩查策略及結(jié)果報(bào)告對(duì)血液抗-HCV初篩呈陰性反應(yīng)的樣品可用集合NAT（PoolingNAT）進(jìn)行復(fù)檢試驗(yàn)。如呈陽性反應(yīng)，做單人份NAT檢測(cè)，陽性結(jié)果報(bào)告“陽性待查”，血液報(bào)廢，如果需要進(jìn)一步診斷獻(xiàn)血/漿員感染狀況，執(zhí)行臨床診斷策略；如呈陰性反應(yīng)，報(bào)告“HCV復(fù)檢陰性”，血液供應(yīng)臨床。第37頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2HCV核酸定性檢測(cè)用于臨床診斷策略及結(jié)果報(bào)告

抗-HCV復(fù)檢試驗(yàn)陽性反應(yīng)樣品，進(jìn)行定性NAT試驗(yàn)。結(jié)果陽性者，報(bào)告“HCV陽性”；定性NAT結(jié)果陰性的樣品，須做免疫印跡試驗(yàn)確證。檢測(cè)流程見圖8。第39頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3HCV核酸定量檢測(cè)用于臨床治療策略及結(jié)果報(bào)告

現(xiàn)階段對(duì)HCVRNA定量檢測(cè)的單位尚未完全統(tǒng)一，有的報(bào)告拷貝/ml，有的報(bào)告國(guó)際單位IU/ml，不同的試劑所用的標(biāo)準(zhǔn)不一樣，造成IU和拷貝之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)不同。國(guó)產(chǎn)HCVRNA定量檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)范圍一般在103~108拷貝/ml。

HCVRNA定量檢測(cè)報(bào)告單應(yīng)該具備如下內(nèi)容：檢測(cè)方法（如熒光定量PCR）、檢測(cè)試劑名稱、單位及檢測(cè)范圍。第41頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

臨床樣品的結(jié)果報(bào)告可能有幾種情況：①結(jié)果在檢測(cè)范圍內(nèi)，則按檢測(cè)的結(jié)果直接發(fā)報(bào)告，如每毫升3.2×105拷貝/ml（有的臨床實(shí)驗(yàn)室表示為3.20E+05拷貝/ml）；②結(jié)果高于檢測(cè)上限，則應(yīng)用HCV陰性的混合血漿（清）將樣本進(jìn)行10~1000稀釋后再重新檢測(cè)，直到結(jié)果落入檢測(cè)范圍內(nèi)；③樣本未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，則應(yīng)重新進(jìn)行檢測(cè)，若在檢測(cè)限內(nèi)，按照實(shí)際數(shù)發(fā)報(bào)告，若仍低于檢測(cè)下限，則報(bào)告為“低于檢測(cè)下限”。目前很多實(shí)驗(yàn)室對(duì)這部分樣品不進(jìn)行復(fù)檢就直接發(fā)出報(bào)告，會(huì)造成相當(dāng)部分陽性樣品的漏檢。第42頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

丙型肝炎病毒基因型檢測(cè)一、HCV基因型

1993年Simmonds等提出的分型方法得到了大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)同。Simmonds等分析不同毒株編碼非結(jié)構(gòu)蛋白5（NS5）區(qū)域核苷酸序列的同源性，按照發(fā)現(xiàn)的先后將HCV主要分為1～6個(gè)型，每個(gè)型有若干亞型，以a，b，c等表示。這樣，HCV被分為6個(gè)型和70多個(gè)亞型。Simmonds分型方法對(duì)臨床慢性丙型肝炎的抗病毒治療具有重要指導(dǎo)意義，美國(guó)肝病學(xué)會(huì)、歐洲肝病學(xué)會(huì)、亞太肝病學(xué)會(huì)和中國(guó)制定的系列丙型肝炎防治指南都采用了該法進(jìn)行分型。在我國(guó)，最主要的基因型為1b（66%），其次為2a（14%），還有其他較少見的型別，如西南地區(qū)的3型和廣東等地區(qū)的6型等。第44頁,共54頁，2024年2月25日，星期天二、HCV基因型檢測(cè)方法與試劑

傳統(tǒng)的HCV血清學(xué)分型與分子生物學(xué)分型相比，只有62.1%的符合率。現(xiàn)階段檢測(cè)HCV基因型的分子生物學(xué)方法有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、測(cè)序法及反向線性探針雜交法（reversehybridizationlineprobeassay，LiPA）等，目前商品化試劑盒所用的方法主要是后兩種。如Bayer的TrugeneHCV分型試劑盒和Inno-LiPAHCV基因分型2.0試劑盒。第45頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

分型試劑的檢測(cè)靶位點(diǎn)主要集中于保守的5’端非編碼區(qū)，TrugeneHCV分型試劑直接對(duì)HCVRNA序列測(cè)定來分型，LiPA則是基于反向雜交原理——PCR擴(kuò)增目的基因（擴(kuò)增的DNA被生物素標(biāo)記），與硝酸纖維膜上線形區(qū)帶上的寡核苷酸探針雜交，再加入標(biāo)記有堿性磷酸酯酶的親和素，與雜交產(chǎn)物上標(biāo)記的生物素結(jié)合，加入顯色底物NBT/BCIP孵育后，顯現(xiàn)紫色或棕色的條帶，不同的條帶組合對(duì)應(yīng)不同的基因型。第46頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

相比第一代產(chǎn)品，二代LiPAHCV增加了核心區(qū)序列，可準(zhǔn)確地區(qū)分1a和1b型，并可避免東南亞地區(qū)和我國(guó)南部地區(qū)較常見的6c-6l型被誤分為l型，但仍約有8%的2a型易被lipa誤判為1a型，而這兩種型別的HCV感染的治療和預(yù)后均存在較大差異。需要注意，不論是Trugene還是Lipa，均要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，對(duì)HCV混合感染進(jìn)行分型時(shí)，不可避免會(huì)因不同型別RNA擴(kuò)增效率不一造成的劣勢(shì)擴(kuò)增毒株的漏檢。第47頁,共54頁，2024年2月25日，星期天三、直接測(cè)序法HCV分型操作程序

隨著核酸測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，直接測(cè)序分型成為目前具有推廣潛力的HCV基因型檢測(cè)方法。該方法需要對(duì)HCVRNA進(jìn)行巢式PCR（nestedPCR）擴(kuò)增，套式PCR是PCR衍生技術(shù)中最常用的方法，它使用兩對(duì)引物，進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)，能夠極大地增加PCR擴(kuò)增反應(yīng)的敏感性和特異性。套式PCR第二次反應(yīng)的引物（內(nèi)引物）位于第一次PCR擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)。外引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增后，將第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至第二次PCR反應(yīng)管內(nèi)，使用一對(duì)內(nèi)引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后用凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物之后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化回收目的片段，然后測(cè)序。

第48頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1、引物設(shè)計(jì)原則

除遵循PCR引物設(shè)計(jì)的一般原則以外，HCV分型主要考慮的是選擇哪一段基因序列進(jìn)行分型才能獲得更高的分辨效率。臨床上用于HCV基因分型的方法有多種，最常用的是根據(jù)（5‵NCR）序列差異而進(jìn)行的基因分型方法，如INNO-LiPA、5‵NCR序列的直接測(cè)序、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）-PCR等，但一基于5‵NCR的基因分型方法對(duì)不同亞型的分型準(zhǔn)確率有較大的差異，對(duì)1b、1a、2a、2b、2c、3a亞型的分型準(zhǔn)確率分別為76%、91%、20%、50%和96%，幾乎不能對(duì)4a和4c亞型進(jìn)行區(qū)分，總準(zhǔn)確率僅有76%，這與5‵NCR序列過于保守有關(guān)。因?yàn)橥换蛐?、不同亞型HCV5‵NCR序列的差異度僅為1.0%～3.3%，而NS5B基因序列的差異度為16.5%～20.1%，NS5B基因更適用于HCV的基因分型。第49頁,共54頁，2024年2月25日，星期天列舉常用的PCR引物：外側(cè)引物：5′-TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGA-3′(上游引物）

5'-GGCGGAATTCCTGGTCATAGCCTCCGTGAA-3'（下游引物）擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為401bp內(nèi)側(cè)引物：5'-CTCAACCGTCACTGAGAGAGACAT-3'（上游引物）

5