分子診斷技術(shù)

關(guān)于分子診斷技術(shù)常見的核酸分子診斷技術(shù)核酸分子雜交

(NucleicacidmolecularHybridization)基因芯片（GeneChip）聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreactionreaction；PCR)第2頁,共22頁，2024年2月25日，星期天核酸分子雜交的原理雙鏈核酸加熱或經(jīng)鹼處理變性后，可解鏈成兩條互補(bǔ)的單鏈核酸。在適當(dāng)溫度、鹽濃度下，雙鏈能按鹼基互補(bǔ)配對原則(A-T,C-G)復(fù)性而重新成為雙鏈核酸。用已知序列的單鏈核酸，經(jīng)標(biāo)記制成核酸探針，與變性后的待測標(biāo)本核酸進(jìn)行雜交，通過檢測標(biāo)記探針的信號，可判斷標(biāo)本是否存在與探針互補(bǔ)雜交的同源核酸。第3頁,共22頁，2024年2月25日，星期天核酸分子雜交探針的制備制備探針的靶核酸可通過:分離、切割病毒的特定核酸片段獲得;用重組技術(shù)，將該片段克隆到細(xì)菌質(zhì)粒，經(jīng)擴(kuò)增和純化大量獲得;選擇已知病毒的一段基因序列，用人工方法合成寡核苷酸，其長度以20個左右最為常用，過短易出現(xiàn)非特異性雜交。第4頁,共22頁，2024年2月25日，星期天核酸分子雜交探針的制備常見的用于標(biāo)記探針的示蹤物質(zhì)放射性核素如：32P，35S，3H，125I等，雜交后可通過放射自顯影技術(shù)進(jìn)行檢測非放射性物質(zhì)如：生物素、地高辛和酶等，雜交后可通過底物顯色、化學(xué)發(fā)光等技術(shù)進(jìn)行檢測第5頁,共22頁，2024年2月25日，星期天

核酸分子雜交示意圖核酸分子雜交的程序

第6頁,共22頁，2024年2月25日，星期天常用的核酸分子雜交技術(shù)斑點(diǎn)雜交（spotblothybridization）凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交（Southern

blothybridization)原位雜交（in-situhybridization）第7頁,共22頁，2024年2月25日，星期天斑點(diǎn)雜交DotBoltHybridizationforHBVDNAQuantitationin5μlofPatientSera第8頁,共22頁，2024年2月25日，星期天

凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交原位雜交

(Southernblothybridization)(in-situhybridization）第9頁,共22頁，2024年2月25日，星期天核酸分子雜交技術(shù)的應(yīng)用核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性，因而該技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性等在醫(yī)學(xué)上，目前已用于多種遺傳性疾病的基因診斷，惡性腫瘤的基因分析，傳染病病原體的檢測等領(lǐng)域中。第10頁,共22頁，2024年2月25日，星期天基因芯片基因芯片（或DNAChip,或Microarray）又稱DNA微陣列，是指固定在固相載體上的高密度DNA微點(diǎn)陣。即將大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（點(diǎn)與點(diǎn)間距一般小于500μm）排列在玻璃、硅等載體上，稱之為基因芯片。上圖顯示大量的DNA探針，按照一定的規(guī)律有序地排列在支撐物上，每個探針與相對應(yīng)的特異互補(bǔ)序列結(jié)合后，即可發(fā)出熒光。利用該芯片可同時獲取大量信息。DNAMicroarray第11頁,共22頁，2024年2月25日，星期天基因芯片技術(shù)原理大規(guī)模集成的固相雜交

基本原理是核酸分子雜交，即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)配對、變性和復(fù)性的原理

以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，然后通過定性、定量分析得出待測樣品的基因序列及表達(dá)的信息第12頁,共22頁，2024年2月25日，星期天基因芯片的作用原理第13頁,共22頁，2024年2月25日，星期天基因芯片的制作方式原位合成直接點(diǎn)樣原位光蝕刻合成原位噴印合成

分子印章法針式點(diǎn)樣噴墨點(diǎn)樣光導(dǎo)原位合成法第14頁,共22頁，2024年2月25日，星期天基因芯片技術(shù)流程第15頁,共22頁，2024年2月25日，星期天基因芯片的應(yīng)用基因表達(dá)分析

分析基因表達(dá)時空特征基因差異表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)新基因大規(guī)模DNA測序基因型、基因突變和多態(tài)性分析疾病的診斷與治療

遺傳病相關(guān)基因的定位腫瘤診斷感染性疾病的診斷耐藥菌株和藥敏檢測第16頁,共22頁，2024年2月25日，星期天聚合酶鏈反應(yīng)

(polymerasechainreactionreaction；PCR)PCR是八十年代中期問世的一種體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程的技術(shù)，可在短時間內(nèi)將待測特異性DNA擴(kuò)增百萬倍以上，并具有簡單、快速、特異的特點(diǎn)，成為分子生物學(xué)發(fā)展史的又一個里程碑。PCR不僅可檢測各種DNA病毒的核酸，還可經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄，檢測各種RNA病毒的核酸，因而在各型肝炎病毒的檢測中，敏感性遠(yuǎn)超過分子雜交，有著不可替代的作用。第17頁,共22頁，2024年2月25日，星期天

PCR的常見類型常規(guī)PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR）巢式PCR〔nested-PCR〕原位PCR（in-situPCR）多重PCR

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非對稱PCR免疫PCR定量PCR隨機(jī)引物PCR簡并引物PCR錨定PCR第18頁,共22頁，2024年2月25日，星期天實(shí)時熒光定量PCR熒光檢測技術(shù)SYBRGreenI。是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。

TaqMan水解探針。由產(chǎn)熒光基團(tuán)，熒光淬滅基團(tuán)，與擴(kuò)增子有互補(bǔ)的特異核苷酸序列組成。第19頁,共22頁，2024年2月25日，星期天實(shí)時熒光定量PCR：水解探針法退火延伸切割聚合完成該法也稱TaqMan技術(shù)，在PCR系統(tǒng)中，加入能和靶核酸模板雜交的探針，其5’端帶有熒光報告基團(tuán)，發(fā)射的熒光被3’端帶有的熒光淬滅基團(tuán)所吸收。引物延伸時，由于聚合酶具有的5’→3’‘核酸外切酶作用，可把熒光報告基團(tuán)從探針上切下，因與淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，發(fā)出的熒光不被淬滅，隨模板擴(kuò)增和游離熒光報告基團(tuán)的增加而增強(qiáng)，并和初始靶核酸的量呈正相關(guān)。第20頁,共22頁，2024年