實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)及氨基酸的顯色反應(yīng)

關(guān)于實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)及氨基酸的顯色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)及氨基酸的顯色反應(yīng)目的和要求

1.學(xué)習(xí)和了解常用的幾種鑒定蛋白質(zhì)與氨基酸的方法。

2.進(jìn)一步認(rèn)識(shí)氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。第2頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅰ、雙縮脲反應(yīng)(Biureareaction)原理:

雙縮脲反應(yīng):在堿性條件下，雙縮脲與二價(jià)銅離子作用，生成紫紅色配合物的反應(yīng)。當(dāng)加熱至180℃左右時(shí)，兩分子尿素縮合脫去一分子氨，生成雙縮脲。在肽和蛋白質(zhì)分子中具有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲類似，也能發(fā)生此反應(yīng)，生成藍(lán)紫色或紫紅色的配合物。該反應(yīng)常用于蛋白質(zhì)的定性或定量測定。此反應(yīng)所產(chǎn)生顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)。第3頁,共27頁，2024年2月25日，星期天紫紅色銅雙縮脲復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)為：第4頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作步驟一、取少量尿素結(jié)晶，放入干燥試管中，用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時(shí)，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷卻后，加10%NaOH溶液約1mL，振蕩混勻，再加入1%CuSO４溶液1滴，振蕩之。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。（避免添加過量硫酸銅，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色）。

二、取另一支試管，加1mL蛋白質(zhì)溶液和10%氫氧化鈉溶液2mL，搖勻，再加1%硫酸銅溶液兩滴，隨加隨搖，觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。

第5頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅱ、茚三酮反應(yīng)(Ninhydrinreaction)原理:

除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì)外，所有的α-氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。該反應(yīng)分兩步進(jìn)行，首先是氨基酸被氧化，產(chǎn)生CO２、NH3

和醛，而水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所生成之還原型茚三酮與另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。

第6頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅱ、茚三酮反應(yīng)(Ninhydrinreaction)

此反應(yīng)的適宜pH為5-7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時(shí)甚至不顯色。該反應(yīng)十分靈敏，1：1500000濃度的氨基酸水溶液即能顯示反應(yīng)，因此是一種常用的氨基酸定量方法。第7頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作步驟

一、取2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和0.5%甘氨酸溶液1mL，再加0.5mL0.1%茚三酮水溶液混勻，在沸水浴中加熱1~2min，觀察顏色由粉色變成紫紅色再變藍(lán)。二、在一小片濾紙上滴上一滴0.5%的甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴0.1%的茚三酮乙醇溶液一滴，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。第8頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅲ、黃色反應(yīng)(Xanthoproteicreaction)原理凡是含有苯環(huán)的化合物都能與濃硝酸作用產(chǎn)生黃色的硝基苯衍生物。該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成深橙色的硝醌酸鈉。在蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基易發(fā)生上述反應(yīng)，而苯丙氨酸不易硝化，需加少量濃硫酸催化才能呈明顯的正反應(yīng)。皮膚、指甲、頭發(fā)等遇濃硝酸變黃即為這一反應(yīng)的結(jié)果。第9頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作步驟:

一、取一支試管加4滴0.5%苯酚溶液，再加濃硝酸2滴，觀察黃色出現(xiàn)，冷卻后逐滴加入10%氫氧化鈉溶液，觀察顏色轉(zhuǎn)變?yōu)槌?。二、取一支試管加蛋白質(zhì)溶液4滴及濃硝酸2滴，由于強(qiáng)酸的作用，開始蛋白質(zhì)形成白色沉淀，小火加熱，則沉淀變?yōu)辄S色，冷卻之，逐滴加入10%氫氧化鈉溶液，顏色由黃色轉(zhuǎn)變成深橙黃色。三、剪少許指甲或頭發(fā)放入試管中，加入數(shù)滴濃硝酸，觀察顏色變化。

第10頁,共27頁，2024年2月25日，星期天管號(hào)1234材料0.5％苯酚雞蛋清液指甲頭發(fā)量（滴)44少許少許濃硝酸（滴）422020現(xiàn)象加入NaOH后現(xiàn)象變化黃色反應(yīng)第11頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅳ、坂口反應(yīng)(Sakaguchireaction)原理

在次溴酸鈉或次氯酸鈉存在的條件下，許多含有胍基的化合物(如胍乙酸、甲胍、胍基丁胺等)能與α-萘酚發(fā)生反應(yīng)生成紅色物質(zhì)。在20種氨基酸中唯有精氨酸含有胍基，所以只有它呈正反應(yīng)。第12頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅳ、坂口反應(yīng)(Sakaguchireaction)

生成的氨被次溴酸鈉或次氯酸鈉氧化生成氮。該反應(yīng)中過量的次溴酸鈉或次氯酸鈉是不利的，因其能進(jìn)一步緩慢氧化，使產(chǎn)物破裂分解，引起顏色消失。但加入適量尿素可破壞過量的次溴酸鈉。酪氨酸、色氨酸和組氨酸也能降低產(chǎn)生顏色的強(qiáng)度。甚至?xí)柚诡伾纳?。該反?yīng)靈敏度達(dá)1：250000。因此常用于定量測定精氨酸的含量和定性鑒定含有精氨酸的蛋白質(zhì)。第13頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作步驟

取2支試管，分別加入1mL0.3%精氨酸溶液和蛋白溶液，各加20%氫氧化鈉溶液5滴，1%α-萘酚酒精溶液2滴，次氯酸鈉溶液6滴，搖勻，放置片刻，觀察出現(xiàn)的顏色。第14頁,共27頁，2024年2月25日，星期天試劑（滴）管號(hào)H2O0.3％精氨酸蛋白質(zhì)溶液20％NaOHα－萘酚NaClO現(xiàn)象記錄１005536２050536３500536坂口反應(yīng)第15頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅴ、乙醛酸反應(yīng)(Adamkiewica-Hopkins-Colereaction)原理

在濃硫酸存在下，色氨酸與乙醛酸反應(yīng)生成紫色物質(zhì)，色氨酸在濃硫酸中與一些醛類反應(yīng)也形成有色物質(zhì)。很多人用含有少量醛雜質(zhì)的冰醋酸或芳香醛等進(jìn)行此反應(yīng)。硝酸根、亞硝酸根、氯酸根及過多的氯離子均能妨礙此反應(yīng)，有微量硫酸銅或Fe３＋離子存在時(shí)，可以加強(qiáng)色氨酸的陽性反應(yīng)。第16頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作步驟

向試管中加數(shù)滴蛋白質(zhì)溶液，再加冰醋酸(常含有少量乙醛酸或醛類)約1mL并混勻傾斜試管，謹(jǐn)慎地沿著管壁加濃硫酸(AR)約1mL，使其重迭，且勿搖勻。靜置后，觀察在兩液界面上出現(xiàn)的紅紫色環(huán)，于水浴中微熱，可加快色環(huán)形成。第17頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

試劑（滴）管號(hào)白明膠0.3％色氨酸（滴）蛋白質(zhì)溶液（滴）冰醋酸（ml）濃硫酸（ml）現(xiàn)象記錄151125113511乙醛酸反應(yīng)第18頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅵ、偶氮反應(yīng)(Azoreaction)原理

偶氮化合物(Ehrlich氏偶氮試劑)與酚核或咪唑環(huán)結(jié)合產(chǎn)生有色物質(zhì)。它與酪氨酸和組氨酸反應(yīng)的產(chǎn)物分別為紅色和櫻桃紅色.含有酪氨酸和組氨酸的蛋白質(zhì)也有此反應(yīng)。第19頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作步驟

取2支試管，分別加入0.3%組氨酸溶液和純雞蛋清各4滴，再各加入新配制的重氮試劑8滴搖勻，加入2滴20%氫氧化鈉溶液，再搖勻。過幾分鐘，觀察顏色的形成，一般出現(xiàn)櫻桃紅色。第20頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

試劑（滴）管號(hào)0.3％組氨酸（滴）雞蛋清（滴）偶氮試劑20％NaOH溶液現(xiàn)象記錄14822482偶氮反應(yīng)第21頁,共27頁，2024年2月25日，星期天反應(yīng)名稱反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)產(chǎn)物及現(xiàn)象用途1、雙縮脲反應(yīng)肽鍵Cu–Cu—雙縮脲絡(luò)合物（蘭紫色）測蛋白質(zhì)含量鑒定蛋白質(zhì)水解是否完全2、茚三酮反應(yīng)α-氨基酸蘭紫色測AA含量檢驗(yàn)AA及蛋白質(zhì)3、黃色反應(yīng)苯環(huán)、Trp、Tyr黃色硝醌酸生成鑒定Trp、Tyr4、坂口反應(yīng)胍基玫瑰紅色產(chǎn)物生成鑒定Arg測定Arg含量5、乙醛酸反應(yīng)吲哚環(huán)中間生成蘭紫色環(huán)鑒定Trp6、偶氮反應(yīng)酚核、咪唑基有橙色和鮮紅色產(chǎn)物生成鑒定His、Tyr第22頁,共27頁，2024年2月25日，星期天試劑和器材

一、試劑

1.蛋白質(zhì)溶液：取5mL蛋清，用蒸餾水稀釋至100mL，攪拌均勻后，用紗布過濾。2.0.1%茚三酮乙醇溶液：稱取0.1g茚三酮，溶于100mL95%乙醇。臨用前配制。3.尿素粉末4.1%硫酸銅溶液5.10%氫氧化鈉溶液和20%氫氧化鈉溶液6.0.5%苯酚溶液第23頁,共27頁，2024年2月25日，星期天7.濃硝酸和濃硫酸(A.R.)8.0.1%茚三酮水溶液9.0.3%精氨酸、0.3%組氨酸、0.5%甘氨酸10.純雞蛋清11.1%α-萘酚乙醇溶液，臨用時(shí)配制12.冰乙酸13.次氯酸鈉溶液14.Ehrlich氏重氮試劑：溶液A：溶解5g亞硝酸鈉于1000mL水中。溶液B：溶解5g對(duì)氨基苯磺酸于1000mL水中。溶解后，再加入5mL濃硫酸。

A、B溶液分別保存于密閉瓶內(nèi)。需用時(shí)，以1：1的比例混合。第24頁,共27頁，2024年2月25日，星期天二、器材

1.試管及試管架2.水浴鍋3.酒精燈4.濾紙片5.烘箱