實驗五細(xì)菌的革蘭氏染色與細(xì)菌

關(guān)于實驗五細(xì)菌的革蘭氏染色與細(xì)菌一、實驗?zāi)康募皟?nèi)容目的：1、復(fù)習(xí)革蘭氏染色法的原理

2、初步掌握細(xì)菌的涂片方法及革蘭氏染色法的步驟

3、了解細(xì)菌的芽孢染色的原理，掌握芽孢染色方法內(nèi)容：1、制作細(xì)菌的染色裝片（復(fù)習(xí)簡單染色的方法）

2、通過革蘭氏染色，確定蘇云金芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌、大腸桿菌為革蘭氏陰性還是陽性細(xì)菌

3、細(xì)菌的芽孢染色第2頁,共7頁，2024年2月25日，星期天二、實驗原理1、革蘭氏染色原理：革蘭氏染色法是將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性（G＋）和革蘭氏陰性（G－）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。細(xì)菌的不同顯色反應(yīng)是由于細(xì)胞壁對乙醇的通透性和抗脫色能力的差異，主要是肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)決定的。經(jīng)結(jié)晶紫染色的細(xì)胞用碘液處理后形成不溶性復(fù)合物；乙醇能使它溶解，所以，染色的前二步結(jié)果是一樣的，但在G+細(xì)胞中，由于細(xì)胞壁厚、肽聚糖網(wǎng)層次多和交聯(lián)致密，故遇脫色劑乙醇時，因失水而網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇的處理不會溶出縫隙，因此能把結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物(分子太大)牢牢留在壁內(nèi)，使其保持紫色。反之，在G-細(xì)菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖網(wǎng)層薄和交聯(lián)度差，遇脫色劑乙醇后，以類脂為主的外膜迅速溶解，乙醇處理不但破壞了胞壁外膜，還可能損傷肽聚糖層和細(xì)胞質(zhì)膜，這時薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物的溶出，因此細(xì)胞退成無色。當(dāng)再用襯托的染色液復(fù)染時，顯現(xiàn)紅色。紅色染料雖然也能進(jìn)入已染成紫色的G+細(xì)胞，但被紫色蓋沒，紅色顯示不出來。第3頁,共7頁，2024年2月25日，星期天2、芽孢染色原理芽孢染色法是根據(jù)細(xì)菌的芽孢和菌體對染料的親和力不同的原理，用不同的染料進(jìn)行染色，使芽孢和菌體呈不同顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，當(dāng)用弱堿性染料孔雀綠在加熱的情況下進(jìn)行染色時，此染料可以進(jìn)入菌體及芽孢使其著色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出。若再復(fù)染（蕃紅液），則菌體呈紅色而芽孢呈綠色。第4頁,共7頁，2024年2月25日，星期天四、操作步驟【一】革蘭氏染色的步驟操作（一）制片1、涂片：在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水，用無菌操作的方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜，涂片的面積大約1～1.5cm22、干燥：將涂片于室溫中自然干燥3、固定：菌面朝上，通過火焰2—3次固定（溫度以不燙手為宜）（二）染色1、初染：在制片上滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘2、水洗：傾去染色液，用水小心的沖洗3、媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1分鐘4、脫色：將玻片傾斜，連續(xù)點滴95％乙醇通過涂面，脫色20—30秒，至流出的液體無色，立即水洗5、復(fù)染：滴加番紅復(fù)染3—5分鐘6、水洗：用水洗去涂片上的番紅染色液7、晾干：將染好的涂片放在空氣中晾干或者用吸水紙吸干（三）鏡檢先用低倍，再用高倍，最后用油鏡進(jìn)行觀察第5頁,共7頁，2024年2月25日，星期天【二】芽孢染色的操作步驟（改良的Schaeffer和Fulton氏染色法）1、制備菌液：加1—2滴無菌水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2—3環(huán)菌體于試管中，并充分混勻，制成粘稠的菌液2、加染色液：加5%的孔雀綠飽和水溶液2—3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使燃料與菌液充分混勻3、加熱：將此試管浸入沸水浴中加熱15—20分鐘4、涂片：用接種環(huán)從試管底部挑取數(shù)環(huán)菌液于潔凈的載玻片上，做成涂面，晾干5、固定：將涂片通過酒精燈火焰3次6、脫色：用水洗，直至流出的水中無孔雀綠的顏色為止7、復(fù)染：加番紅水溶液染色5分鐘，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干8、鏡檢：先用低倍鏡，再