椰子致死黃化植原體檢測方法

椰子致死黃化植原體檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了植物檢疫中椰子致死黃化植原體的檢疫檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于植物檢疫中棕桐科植物(包括種果、苗木等繁殖材料)椰子致死黃化植原體的檢疫檢測。2.1椰子致死黃化植原體分類地位：原核生物界(Prokaryiotes);軟壁菌門(Tenericute);軟球菌綱(Mollicutes);植原體屬2.2寄主范圍椰子(Cocosmcifera)、輪羽椰(Alagopteraarenaria),香桃榔(Arengaengleri)、糖棕(Burassus(Chrysalidocarpusl(Dypsisdecaryi),油棕(Elaeisgui椰(Hyophorbeverschaffelti),彩葉棕屬(Lafania attenwata、卷葉豪威椰(Howeadactylifera),非洲棗椰(P,reclinata)、mis,太平洋棕(P.pacifica)、P,remota、carpusfortuaei),圣誕椰(國王椰(P.thurstoaii)、Raveneahimerrillii)、瓦努阿圖圣誕棉(V.momtgomerwma)。2.3寄主癥狀椰子幼樹癥狀：主要表現(xiàn)為黃葉以及矛葉和心部的壞死。結(jié)果樹癥狀：戚熟前椰果脫落；開放或末開放的佛焰苞花序壞死；旗葉先變成黃褐色，然后由下往上褪綠變黃；矛葉和心部腐爛；樹冠倒塌；根系腐爛。2.4地理分布北美洲：美國(佛羅里達(dá)州和得克薩斯州),墨西哥。中美洲和加勤比海地區(qū)：開曼群島、巴哈馬、古巴、牙買加、海地、蘇里南、多米尼加、伯利茲、洪都拉斯。2.5植原體形態(tài)特征椰子致死黃化植原體形態(tài)為近球形、橢圓形、圓簡形、念球狀、絲狀等多種形態(tài)，它們常處于二均分裂狀態(tài)，其大小為0.42μm～2μm,最長的為念球狀可達(dá)16pm以上。2.6傳播途徑田間主要通過昆蟲介體傳播，昆蟲介體主要是蠟蟬(MynduscrudusVanDuzet)。染病種苗的轉(zhuǎn)運(yùn)等人為途徑使得植原體遠(yuǎn)距離傳播。2.7組織病理學(xué)特性受植原體感染的植物材料組織經(jīng)DAPI染色后，能在顯微鏡下直接觀察到韌皮部篩管細(xì)胞中植原(規(guī)范性附錄)A.1.1DNA抽提緩沖液100mmol/LTr加無菌水至1L。A.1.2TE緩沖液10mmol/L.Tris加無菌水至1L。加無菌水至1L。A.1.46×加樣緩沖液0.25%溴酚藍(lán)40%蔗糖水溶液。A.2實(shí)驗(yàn)步驟A.2.1植物材料總核酸提取A.2.1.1選取呈現(xiàn)早期癥狀的椰子矛葉或未開放的佛焰苞花序，并取健康椰子矛葉作對(duì)照。將植物材料3g于研體中加液態(tài)氮冷凍后充分研磨。A.2.1.2加入15mLDNA提取緩沖液(預(yù)熱65℃),在65℃水浴中保溫15min。加入等體積三氯甲烷：異戊醇(24:1),抽提80min。6000r/min離心10min,取上清液。加入等體積三氯甲燒!異戊醇(2411),抽提30min。離心10min后，上清液加人三分之二體積冰凍異丙醇，25℃下靜置30min。離心10min,沉淀經(jīng)兩次70%乙醇洗滌，真空干燥后溶解于200pL.TE緩沖液A.2.1.8按10pg/mL,加入RNA水解脂，于37℃靜置60min～120min后12000r/min離心10min,沉淀經(jīng)兩次70%乙醇洗滌。A.2,1.9真空干燥后溶解于200μLTE緩沖液或200μL無菌水中。A.2.2PCR反應(yīng)A.2.2.1植原體通用引物PCR反應(yīng)(可按下述方法配制或所購試劑盒的使用說明);反應(yīng)液為50pL,含有50ng從植物材料提取的DNA作為模板，1×PCR緩沖液，植原體通用引物P1(5’AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3')/P7(5'-CGTCCTTCATCGGCTCTT-8')各50ng,dNTPs各125pmol/L,1UTagDNA聚合酶，1.5mmol/L氧化鎂，50pL礦物油覆蓋。以長春花叢枝植原體DNA作陽性對(duì)照，椰子健康植株總核酸和無菌水為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件為預(yù)處理95℃/5min,后30個(gè)循環(huán)為95℃/30s,58℃/1min,72℃/1min,最后于72℃保持10min。A.2.2.2植原體椰子致死黃化組特異性引物PCR產(chǎn)物用無菌水配成1140或11100,取4pL作為模板，進(jìn)行果式PCR,以植原體椰子致死黃化組特異性引物L(fēng)Y16Sf(5'-CATGCAAGTCGAACGGAAATC-3’)和LY16Sr(5'-GCTTACGCAGTTAGGCTGTC-3'),PCR反應(yīng)液同A.2.2.1。反應(yīng)條件為預(yù)處理94℃/150s,后40個(gè)循環(huán)為94℃/30s,60℃/50s,72℃/80s,最后于72℃保持10min。A.2.3瓊脂糖電泳A.2.3.1制備凝膠，將TAE和電泳級(jí)瓊脂糖按1.0%配好，在微波爐中熔化混勻，冷卻至55℃左右。A.2.3.2加入澳化乙錠(1pg/1mL),混勻，倒入已封好的凝膠平臺(tái)上，插上樣品梳。A.2.3.3待凝膠凝固后，從制膠平臺(tái)上除去封帶，撥出梳子，加入足夠量的TAE(緩沖液沒過凝膠表A.2,3.4取4pl.加樣緩沖液與6pL.PCR和NESTED-PCR的反應(yīng)產(chǎn)物混合，然后分別將其和適合的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物加入樣品孔中。A.2.3.5接通電源進(jìn)行電泳。A.2.3.6當(dāng)加樣緩沖液中的溴酚藍(lán)遷移至足夠分離DNA片段時(shí)，停止電泳。A.2.3.7將整個(gè)膠置于紫外線光透視儀上觀察，并拍照。A.3結(jié)果判定通過觀察，椰子致死黃化植原體經(jīng)通用引物P1/P7PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果在1.8kbp處有條帶出現(xiàn)，經(jīng)巢式PCR植原體椰子致死黃化組特異性引物L(fēng)Y16Sf/LY16Sr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果在1.4kbp處有條帶出現(xiàn)，上述結(jié)果的出現(xiàn)，即可判定為陽性。5(規(guī)范性附錄)B.1.1磷酸緩沖液(PBS)×10氯化鈉80g磷酸二氫鉀2g磷酸氫二鈉11.5氯化鉀2g溶于1L燕慵水中。B.1.2乙二醇甲基丙烯酸酯(GMA)混合液GMA中加入7%聚乙二醇-400和0.6%過氧化苯酰。選取呈現(xiàn)早期癥狀的椰子矛葉或未開放的佛焰苞花序，用刀片切取矛葉葉中脈或花序花柄成整齊的細(xì)條，大小為3mm2。取健康椰子矛葉作對(duì)照。將選取的樣品用4%戊二醛(用0.05mol/LPBSpH6.8配制)固定6h。PBS沖洗兩次。系列乙醇(30%,50%,70%,80%,90%,100%)脫水，每級(jí)乙醇停留2h,100%乙醇更換兩次，70%乙醇可停留過夜。脫水后的組織塊在CMA混合液中滲透12h后，更換GMA混合液一次，停留24h~48h。將材料及GMA裝入膠囊，于40℃下24h,60℃下60h。在切片機(jī)上將固化的組織塊作切片，厚為2μm,置培養(yǎng)皿內(nèi)干燥。B.2.6切片染色用DAPI(0.5pg/mL,PBSpH7.0配制)滴染2min,蒸餾水洗一次，50%甘油封片。B.2.7顯微鏡觀察將染色切片于熒光顯微鏡下，觀察韌皮部篩管細(xì)胞是否呈或熒光。6(規(guī)范性附錄)電子顯微鏡觀察C.1試劑試材C.1.1皺酸固定液巴比妥-乙酸鈉緩沖液的1%鋨酸固定液①巴比妥鈉2.89g乙酸鈉1.15g加雙蒸餾水至100mL0.1mol/L鹽酸5.0mL加雙蒸餾水至25.0mL?；旌虾笥?.1mol/L鹽酸調(diào)至pH為7.2,即為1%餓酸團(tuán)定液，在冰箱保存?zhèn)溆?。C.1.2戊二醛固定液一般為25%戊二醛水溶液?？膳渲圃诔捅韧滓酝獾娜魏尉彌_液中使用，終濃度為25%。C.1.3環(huán)氧樹脂Epon812順丁烯二酸酐(DDSA)2g鄰苯二甲酸二丁酯(D.B.P))1.75mL二乙基苯胺(D.M.P30)0.4mL將Epon812倒入燒杯中，置80℃溫箱融化備用。按上述比例，順序加入DDSA,充分?jǐn)嚢?，待熔化呈透明，至室溫，再加入鄰苯二甲酸二丁酯，仔?xì)攪拌，然后慢慢逐滴加入二乙基蘋胺，邊加邊攪拌，至包埋劑呈紅稼色。將聚乙烯醇縮甲醛溶于三氯甲烷，配成0.2%～3%溶液，存于冰箱備用。制膜時(shí)取一塊干凈玻璃片插入溶液中，取出側(cè)斜待三氯甲燒揮發(fā)，用鑷子沿玻璃邊劃痕，在將玻璃傾斜浸入蒸餾水中，薄膜即從玻璃上脫落下來漂浮于水面，取干凈的鋼網(wǎng)概上，壓緊，在用一塊濾紙覆蓋其上，撈起后置于培養(yǎng)皿干燥備用。C.2實(shí)驗(yàn)步驟選取呈現(xiàn)早期癥狀的椰子矛葉或未開放的佛焰苞花序，用刀片切取矛葉葉中脈或花序花柄成整齊的細(xì)條，大小為3mm2。取健康椰子矛葉作對(duì)照。采用戊二醛-鋨酸雙固定法。樣品在25%戊二酰進(jìn)行前固定2h后，PBS(0.2mol/LpH7.4)清洗三次。然后用1%鋨酸后固定2h,PBS清洗三次。采用乙醉和系列梯度脫水。30%乙醉/15min→50%乙醇/15min→70%乙醇/180%丙酮/15min→90%丙酮/15min→100%丙酮/15min。樣品可在70%乙醇中停留過夜。脫水后的組織塊在丙酮/樹脂(1:1)中滲透3d,再在全樹脂中滲透1d。用環(huán)氧樹脂做包理劑。將組織塊放在膠囊中央，滴入包埋劑。于37℃下24h,45℃下24h,60℃下在超薄切片機(jī)上將固化的組織塊作切片。選擇好的切片，將切片用二甲苯蒸發(fā)展