微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

關(guān)于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)普通光學(xué)顯微鏡的使用培養(yǎng)基的制備消毒與滅菌細(xì)菌三型的觀察第2頁,共88頁，2024年2月25日，星期天普通光學(xué)顯微鏡的使用目的要求1.學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理及使用方法2.復(fù)習(xí)普通臺式顯微鏡的結(jié)構(gòu)、各部分的結(jié)構(gòu)、使用方法第3頁,共88頁，2024年2月25日，星期天基本原理（油鏡的原理）1.增加照明亮度在油鏡與載玻片間加折射率與玻璃相近的介質(zhì)（如：香柏油）減少光線的折射與反射損失2.增加顯微鏡的分辨率第4頁,共88頁，2024年2月25日，星期天油鏡的使用方法1.準(zhǔn)備工作（復(fù)習(xí)）顯微鏡的放置光源的調(diào)節(jié)目鏡的調(diào)節(jié)聚光器的調(diào)節(jié)第5頁,共88頁，2024年2月25日，星期天油鏡的使用方法2.顯微觀察低倍鏡觀察高倍鏡觀察油鏡觀察在觀察目標(biāo)區(qū)域滴加香柏油，仔細(xì)微調(diào)，認(rèn)真觀察尋找觀察目標(biāo)第6頁,共88頁，2024年2月25日，星期天油鏡的使用方法3.顯微鏡使用完畢的處理上升鏡筒，取下載玻片用擦鏡紙檫去油用擦鏡紙蘸無水乙醚乙醇用干凈擦鏡紙擦拭物鏡與目鏡還原各部分注意：切勿用手、其他紙擦拭鏡頭第7頁,共88頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)觀察內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容：觀察金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的染色標(biāo)本試驗(yàn)報(bào)告：繪出金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在油鏡下的形態(tài)。第8頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共88頁，2024年2月25日，星期天鏈球菌第12頁,共88頁，2024年2月25日，星期天桿菌第13頁,共88頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備目的要求1.明確培養(yǎng)基的制備原理2.掌握配置培養(yǎng)基的一般方法與步驟第14頁,共88頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的制備原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是應(yīng)用最廣泛的、最普通的細(xì)菌培養(yǎng)基,也稱普通培養(yǎng)基第15頁,共88頁，2024年2月25日，星期天組成牛肉膏：碳源、能源、磷酸鹽、維生素蛋白胨：氮源、維生素NaCl:無機(jī)鹽水瓊脂：塑型第16頁,共88頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的制備方法1.稱量(牛肉膏,蛋白胨,NaCl)2.溶化3.調(diào)pH4.過濾5.分裝6.加塞7.包扎8.滅菌9.擱置斜面第17頁,共88頁，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)1.蛋白胨易吸水，稱取要迅速2.瓊脂溶化過程中注意溫度，勿使過熱溢出第18頁,共88頁，2024年2月25日，星期天消毒與滅菌消毒與滅菌的概念消毒：一般是指消滅病原菌與有害微生物的營養(yǎng)體滅菌：指殺滅一切微生物的營養(yǎng)體、芽孢、孢子消毒與滅菌的主要方法加熱法過濾法照射法化學(xué)藥品第19頁,共88頁，2024年2月25日，星期天加熱法干熱滅菌火焰灼燒滅菌：接種環(huán)、接種針、金屬用具、無菌操作時在火焰上短暫灼燒瓶口等熱空氣滅菌：玻璃器皿第20頁,共88頁，2024年2月25日，星期天加熱法－－濕熱滅菌高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌鍋15-30min培養(yǎng)基、工作服、橡皮物品、玻璃器皿等第21頁,共88頁，2024年2月25日，星期天常壓蒸汽滅菌某些不適宜高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基不具備高壓蒸汽滅菌條件的僅能殺死大多數(shù)微生物、可用常壓間歇滅菌法第22頁,共88頁，2024年2月25日，星期天加熱法－－濕熱滅菌煮沸消毒法注射器、解剖器械等10-15min可殺死細(xì)菌所有營養(yǎng)體、部分芽孢超高溫殺菌135-150℃、2-8s牛奶及其他液態(tài)食品殺死微生物、保存營養(yǎng)第23頁,共88頁，2024年2月25日，星期天其他方法過濾除菌血清、抗生素、糖溶液等不適宜加熱消毒滅菌輻射滅菌紫外線照射化學(xué)藥品滅菌重金屬離子、抗生素、來蘇爾、７５％的乙醇。第24頁,共88頁，2024年2月25日，星期天干熱滅菌目的要求：１.了解干熱滅菌的原理和應(yīng)用范圍２.學(xué)習(xí)干熱滅菌的操作技術(shù)基本原理：干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固與其本身的含水量有關(guān)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之，含水量越小，凝固緩慢。因此與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（１６０～１７０℃），時間長。第25頁,共88頁，2024年2月25日，星期天干熱滅菌器材：培養(yǎng)皿，試管，吸管，電烘箱等操作步驟：裝入待滅菌的物品：避免物品太擠妨礙空氣流通升溫恒溫降溫開箱取物：溫度未降至70℃前勿開箱，防爆第26頁,共88頁，2024年2月25日，星期天高壓蒸汽滅菌一、目的要求：１.了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍。２.學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌的基本方法。二、基本原理高壓使水的沸點(diǎn)增高，產(chǎn)生超過100℃的高溫蒸汽，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性水蒸氣的穿透性強(qiáng)濕熱的蒸汽有潛熱第27頁,共88頁，2024年2月25日，星期天高壓蒸汽滅菌器材：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、高壓蒸汽滅菌鍋操作步驟取出內(nèi)層鍋，向外層鍋內(nèi)加適量的水放置內(nèi)層鍋及待滅菌物加蓋，并將蓋上排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽加熱同時打開排氣閥滅菌所需時間到后關(guān)閉電源，降溫取出滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫箱培養(yǎng)24小時，檢查無菌生長則可用試驗(yàn)報(bào)告檢查滅菌是否徹底第28頁,共88頁，2024年2月25日，星期天紫外線滅菌一、目的要求：了解紫外線滅菌的基本原理及方法二、基本原理紫外線可誘導(dǎo)胸腺嘧啶二聚體的形成、DNA鏈的交聯(lián)，抑制DNA的復(fù)制幅射使空氣中的氧電離產(chǎn)生[o],使o2生成臭氧（O3）或使H2O生成H2O2,利用O3H2O2的氧化殺菌作用第29頁,共88頁，2024年2月25日，星期天紫外線滅菌器材：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、溶液或試劑、紫外線燈操作步驟紫外線燈直接照射30min、檢查培養(yǎng)基37℃溫箱培養(yǎng)24小時，無菌生長則可用化學(xué)消毒劑與紫外線照射結(jié)合使用試驗(yàn)報(bào)告檢查滅菌是否徹底第30頁,共88頁，2024年2月25日，星期天微孔濾膜過濾除菌一、目的要求：１.了解過濾除菌的基本原理。２.掌握過濾除菌方法。二、基本原理通過機(jī)械作用濾去液體或空氣中的細(xì)菌第31頁,共88頁，2024年2月25日，星期天微孔濾膜過濾除菌器材培養(yǎng)基、2%葡萄糖溶液、肉湯蛋白胨平板注射器、微孔濾膜過濾器、0.22um濾膜、無菌試管、鑷子、玻璃刮棒操作步驟組裝濾膜、滅菌連接壓濾無菌檢查清洗試驗(yàn)報(bào)告記錄無菌檢查結(jié)果第32頁,共88頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)二微生物的染色與形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察主要內(nèi)容細(xì)菌的簡單染色法革蘭氏染色法細(xì)菌的芽孢染色法莢膜染色法第33頁,共88頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌的簡單染色法一、目的要求：１.學(xué)習(xí)微生物的涂片、染色的基本技術(shù)，掌握細(xì)菌的簡單染色法。２.初步認(rèn)識細(xì)菌的形態(tài)特征。

3.鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法和無菌操作技術(shù)。二、基本原理常用堿性染料：美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等在中性、堿性、弱酸性環(huán)境中細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料電離時其分子的染色部分帶正電荷，染料易使細(xì)菌著色。第34頁,共88頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌的簡單染色法器材菌種：枯草芽孢桿菌12-18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物染色劑：呂氏堿性美藍(lán)染液、齊氏石炭酸復(fù)紅染液操作步驟涂片：載玻片中央滴加一滴生理鹽水，接種環(huán)無菌操作挑少許菌苔涂成薄膜干燥：室溫自然干燥固定：熱固定載玻片涂面朝上通過火焰2-3次染色：載玻片平放，滴加染液覆蓋薄膜，染約1min水洗：用自來水輕輕的從玻片一端直接沖去染液干燥鏡檢試驗(yàn)報(bào)告根據(jù)觀察結(jié)果繪出細(xì)菌形態(tài)圖第35頁,共88頁，2024年2月25日，星期天革蘭氏染色法一、目的要求：１.學(xué)習(xí)并初步掌握革蘭氏染色法。２.了解革蘭氏染色的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。二、基本原理1884年丹麥病理學(xué)家ChristainGram創(chuàng)立。基本組成為結(jié)晶紫、碘液、酒精、復(fù)紅。細(xì)胞保持藍(lán)紫色為革蘭氏陽性菌，成紅色為革蘭氏陰性菌。染色性與細(xì)菌細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。第36頁,共88頁，2024年2月25日，星期天革蘭氏染色法器材菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、蠟樣芽孢桿菌12-20h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。染色劑：革蘭氏染液操作步驟制片：常規(guī)涂片、干燥、固定初染：滴加結(jié)晶紫染色1-2min，水洗媒染：用碘液沖去殘水，加碘液覆蓋染1min，水洗脫色：濾紙吸去殘水，95%乙醇脫色，水洗復(fù)染：用復(fù)紅液染2min干燥鏡檢試驗(yàn)報(bào)告根據(jù)觀察結(jié)果說明細(xì)菌的形狀、顏色、及革蘭氏染色反應(yīng)第37頁,共88頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌的芽孢染色法一、目的要求：１.學(xué)習(xí)并掌握芽孢染色法。２.初步了解芽孢桿菌的形態(tài)。二、基本原理芽孢是某些細(xì)菌生長到一定階段在菌體內(nèi)形成的休眠體，其特征是鑒定細(xì)菌的依據(jù)之一。用著色能力強(qiáng)的染液（如：孔雀綠、石炭酸復(fù)紅）在加熱情況下透過菌體進(jìn)入芽孢使其著色，通過水洗菌體的顏色被洗掉，芽孢的染色則被保留，從而區(qū)分菌體與芽孢。第38頁,共88頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌的芽孢染色法器材菌種：蠟樣芽孢桿菌2d營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、球形芽孢桿菌1-2d營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。染色劑：5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液操作步驟（Schaeffer-Fulton氏染色法）制片：常規(guī)涂片、干燥、固定染色：滴加數(shù)滴孔雀綠染液，火焰上加熱至染料冒蒸汽時開始記時染5min，水洗復(fù)染：用番紅液復(fù)染2min，水洗干燥鏡檢試驗(yàn)報(bào)告根據(jù)觀察結(jié)果繪出芽孢桿菌的形態(tài)特征第39頁,共88頁，2024年2月25日，星期天莢膜染色法一、目的要求：學(xué)習(xí)并掌握莢膜染色法。二、基本原理莢膜是包圍在細(xì)菌細(xì)胞外的一層黏液狀或膠質(zhì)狀物質(zhì)，主要成分為多糖、糖蛋白或多肽。莢膜與染液親和力低、不易著色，且可溶于水，通過水洗可在菌體的周圍形成一透明圈。第40頁,共88頁，2024年2月25日，星期天莢膜染色法器材菌種：褐球固氮菌約2d無氮瓊脂斜面培養(yǎng)物。染色劑：繪圖墨水、1%甲基紫水溶液、1%結(jié)晶紫水溶液、6%葡萄糖水溶液、20%硫酸銅水溶液操作步驟濕墨水法制備菌和墨水混合液加蓋玻片鏡檢（低、高倍鏡）結(jié)果：灰色背景下在菌體周圍呈現(xiàn)明亮的透明圈既為莢膜第41頁,共88頁，2024年2月25日，星期天莢膜染色法操作步驟干墨水法制備混合液：6%葡萄糖液、菌體、墨水制片：涂片—干燥—熱固定染色：1%甲基紫染1-2min,水洗鏡檢（低、高倍鏡）結(jié)果：灰色背景，菌體紫色，菌體周圍的清晰透明圈既為莢膜第42頁,共88頁，2024年2月25日，星期天莢膜染色法操作步驟Anthony氏法制片：涂片—自然干燥染色：1%結(jié)晶紫染2min脫色：用20%硫酸銅水溶液沖洗鏡檢（油鏡）結(jié)果：菌體深紫色，菌體周圍的莢膜呈淡紫色第43頁,共88頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌形態(tài)觀察放線菌形態(tài)的觀察霉菌形態(tài)的觀察第44頁,共88頁，2024年2月25日，星期天放線菌形態(tài)的觀察一、目的要求：１.學(xué)習(xí)并掌握觀察放線菌形態(tài)的基本方法。２.初步了解放線菌的形態(tài)特征。二、基本原理放線菌是能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性菌，在培養(yǎng)基中生長的稱基內(nèi)菌絲；向空氣中生長的稱氣生菌絲能否產(chǎn)生菌絲體及由菌絲體分化產(chǎn)生的各種形態(tài)特征是鑒定放線菌的重要依據(jù)。第45頁,共88頁，2024年2月25日，星期天放線菌形態(tài)的觀察器材菌種：細(xì)黃鏈霉菌培養(yǎng)基：滅菌的高氏Ｉ號瓊脂染色劑：石炭酸復(fù)紅染液操作步驟扦片法倒平板滅菌的高氏Ｉ號瓊脂接種扦片培養(yǎng)蓋玻片鏡檢（低、高倍鏡）結(jié)果：第46頁,共88頁，2024年2月25日，星期天放線菌形態(tài)的觀察操作步驟玻璃紙法倒平板滅菌的高氏Ｉ號瓊脂接種扦片培養(yǎng)蓋玻片鏡檢（低、高倍鏡）結(jié)果：第47頁,共88頁，2024年2月25日，星期天放線菌形態(tài)的觀察操作步驟印片法倒平板滅菌的高氏Ｉ號瓊脂接種培養(yǎng)印片染色石炭酸復(fù)紅染液1min，水洗鏡檢（油鏡）結(jié)果：第48頁,共88頁，2024年2月25日，星期天霉菌形態(tài)的觀察一、目的要求：１.學(xué)習(xí)并掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法。２.了解四類常見霉菌的基本形態(tài)特征。二、基本原理霉菌能形成復(fù)什分枝的菌，有基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，后者生長到一定程度分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子菌絲體或孢子的形態(tài)特征是鑒定霉菌的重要依據(jù)。第49頁,共88頁，2024年2月25日，星期天霉菌形態(tài)的觀察器材菌種：曲霉、青霉培養(yǎng)2-5d的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)物培養(yǎng)基：土豆瓊脂染色劑：乳酸石炭酸棉藍(lán)染液儀器和其他用具：無菌吸管、平皿、載玻片、蓋玻片、U形玻棒、解剖針、解剖刀、鑷子、50％乙醇、20％甘油等第50頁,共88頁，2024年2月25日，星期天霉菌形態(tài)的觀察操作步驟（直接制片觀察法）在載玻片上加一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染液，用解剖針從霉菌菌落邊緣挑取少量已產(chǎn)生孢子的霉菌菌絲，先置于50％乙醇中浸一下洗去脫落的孢子，再放在載玻片上的染液中，用解剖針小心地將菌絲分散開。加蓋玻片，用低倍鏡觀察，必要時換高倍鏡。試驗(yàn)報(bào)告：繪圖說明霉菌的形態(tài)特征第51頁,共88頁，2024年2月25日，星期天微生物的分離與純化一、目的要求：掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)。二、基本原理微生物的分離與純化指從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程常用方法：簡易單細(xì)胞挑取法平板分離法第52頁,共88頁，2024年2月25日，星期天微生物的分離與純化平板分離法基本原理選擇性培養(yǎng)：選擇適合于待分離微生物的生長條件（營養(yǎng)、酸堿度、溫度、氧等）要求或加入某種抑制劑造成只適合于該微生物的生長，抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些微生物單個菌落平板劃線法：微生物在固體培養(yǎng)基上可形成單個菌落，挑取該菌落在瓊脂平板上劃線培養(yǎng)可純化細(xì)菌第53頁,共88頁，2024年2月25日，星期天微生物的分離與純化器材菌種：米曲霉培養(yǎng)基：淀粉瓊脂、牛肉膏蛋白胨瓊脂馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基、查氏瓊脂培養(yǎng)基溶液和試劑：10％酚盛9ml無菌水的玻璃試管、盛90ml無菌水并帶玻璃珠的三角燒瓶、4％水瓊脂儀器和其他用具：無菌玻棒、無菌吸管、接種環(huán)、無菌培養(yǎng)皿、鏈霉素、土樣等第54頁,共88頁，2024年2月25日，星期天微生物的分離與純化操作步驟稀釋涂布平板法平板劃線分離法簡易單孢子分離法實(shí)驗(yàn)報(bào)告第55頁,共88頁，2024年2月25日，星期天酵母菌形態(tài)的觀察

及死活細(xì)胞的鑒別一、目的要求：１.觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式，學(xué)習(xí)區(qū)分酵母菌死活的實(shí)驗(yàn)方法。２.掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細(xì)菌的區(qū)別。二、基本原理

酵母菌是不運(yùn)動的單細(xì)胞真核微生物，比長見的細(xì)菌大十倍左右，大多數(shù)酵母以出芽方式進(jìn)行無性繁殖。美藍(lán)的氧化型為藍(lán)色，還原型為無色。用美藍(lán)對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型還原成無色的還原型，借此可鑒別酵母細(xì)胞的死活。第56頁,共88頁，2024年2月25日，星期天酵母菌形態(tài)的觀察

及死活細(xì)胞的鑒別器材菌種：釀酒酵母培養(yǎng)約2d的麥芽汁斜面培養(yǎng)物溶液和試劑：0.05％和0.1％呂氏堿性美藍(lán)染液、革蘭氏染色用碘液。儀器和其他用具：載玻片、蓋玻片等第57頁,共88頁，2024年2月25日，星期天酵母菌形態(tài)的觀察

及死活細(xì)胞的鑒別操作步驟（美藍(lán)浸片法）染色：0.1％呂氏堿性美藍(lán)染液和酵母菌菌苔在載玻片上混勻，加蓋玻片。觀察：3min后用低倍鏡、高倍鏡觀察酵母的形態(tài)和出芽情況，根據(jù)顏色區(qū)分死活細(xì)胞；30min后再次觀察，注意死活細(xì)胞數(shù)量的變化。用0.05％呂氏堿性美藍(lán)染液重復(fù)實(shí)驗(yàn)第58頁,共88頁，2024年2月25日，星期天酵母菌形態(tài)的觀察

及死活細(xì)胞的鑒別操作步驟（水－碘液浸片法）在載玻片上加一滴革蘭氏染色用碘液，再加三滴水，取少許酵母菌苔在其中混合，加蓋玻片后鏡檢。實(shí)驗(yàn)報(bào)告繪圖說明觀察到的酵母菌的形態(tài)特征。第59頁,共88頁，2024年2月25日，星期天微生物大小的測定一、目的要求：１.學(xué)習(xí)并掌握用測微尺測定微生物大小的方法。２.增強(qiáng)微生物細(xì)胞大小的感性認(rèn)識。二、基本原理

微生物細(xì)胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，是分類鑒定的依據(jù)之一。在顯微鏡下用測微尺可對微生物細(xì)胞大小進(jìn)行測定。第60頁,共88頁，2024年2月25日，星期天微生物大小的測定器材菌種：大腸桿菌染色標(biāo)本片、釀酒酵母培養(yǎng)約1d的麥芽汁斜面培養(yǎng)物儀器和其他用具：載玻片、蓋玻片、目鏡測微尺、物鏡測微尺等第61頁,共88頁，2024年2月25日，星期天微生物大小的測定操作步驟裝目鏡測微尺校正目鏡測微尺菌體大小的測定實(shí)驗(yàn)報(bào)告填寫目鏡測微尺校正表填寫各菌大小測定結(jié)果第62頁,共88頁，2024年2月25日，星期天微生物數(shù)量的測定（顯微鏡直接計(jì)數(shù)法）第63頁,共88頁，2024年2月25日，星期天第64頁,