中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座

內(nèi)容一、中藥指紋圖譜技術(shù)概述二、中藥指紋圖譜研究指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)三、指紋圖譜研究相同度計(jì)算四、中藥指紋圖譜研究方法與思緒五、中藥指紋圖譜研究示例演示（試驗(yàn)）中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第1頁一、中藥指紋圖譜技術(shù)概述中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第2頁（一）中藥指紋圖譜與中藥質(zhì)量（二）中藥指紋圖譜研究方法學(xué)（三）中藥指紋圖譜技術(shù)發(fā)展中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第3頁指紋圖譜穩(wěn)定性可控性安全性有效性1.中藥指紋圖譜與中藥安全、有效、穩(wěn)定關(guān)系（一）中藥指紋圖譜與中藥質(zhì)量中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第4頁2.國內(nèi)中藥質(zhì)量評價(jià)現(xiàn)實(shí)狀況植物學(xué)方法： 原植物判定，顯微判定等植物化學(xué)方法： 理化判定分析化學(xué)方法： 儀器分析，色譜分析等藥理學(xué)方法： 生物判定法，生物等效等分子生物學(xué)方法: DNA指紋判定中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第5頁3.國外植物藥質(zhì)量評價(jià)概況標(biāo)準(zhǔn)制劑： 銀杏人參西洋參五味子 甘草黃芪貫葉連翹 定量測定結(jié)合主成份百分比固定產(chǎn)地以生產(chǎn)質(zhì)量恒定制劑各種分析伎倆和方法包含藥材、中間體等指紋圖譜中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第6頁4.中藥指紋圖譜意義

是全方面反應(yīng)中藥所含內(nèi)在化學(xué)成份種類與數(shù)量，進(jìn)而反應(yīng)中藥質(zhì)量，尤其在現(xiàn)階段中藥有效成份絕大多數(shù)沒有明確，采取中藥指紋圖譜方式，將有效地表征中藥質(zhì)量和穩(wěn)定性有利于中藥及其產(chǎn)品進(jìn)入國際市場中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第7頁5.中藥指紋圖譜建立標(biāo)準(zhǔn)

系統(tǒng)性：指紋圖譜所反應(yīng)化學(xué)成份，應(yīng)包含中藥有效部位所含大部成份種類，或指標(biāo)成份全部特征性：指紋圖譜中反應(yīng)化學(xué)成份信息（詳細(xì)表現(xiàn)為保留時(shí)間或位移值）是含有高度選擇性，是這些信息綜合結(jié)果穩(wěn)定性：指紋圖譜在要求方法與條件下應(yīng)能作出相對一致指紋圖譜

色譜特征穩(wěn)定性：特征峰 特征區(qū) 特征參數(shù)色譜條件穩(wěn)定性：不一樣儀器驗(yàn)證 不一樣試驗(yàn)室驗(yàn)證不一樣操作者驗(yàn)證中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第8頁☆品種判別--真?zhèn)巍罨磁袆e--產(chǎn)地☆藥用部位判別--根、莖、葉、花、果☆提取工藝☆藥材炮制☆限量成份控制☆一致性--不一樣批次產(chǎn)品.6.指紋圖譜研究目標(biāo)中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第9頁

品種多、產(chǎn)地多;采收、加工不一致

－化學(xué)組分與含量不一樣 （產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)劣不一樣）有效組分種類繁多、含量相對少；非有效組分成分復(fù)雜、含量高 －分析檢測困難 （質(zhì)量控制指標(biāo)不統(tǒng)一）基礎(chǔ)研究微弱藥材GAP建設(shè)滯后7.建立中藥指紋譜所面臨問題中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第10頁8.對策加強(qiáng)GAP藥材種植基地建設(shè)加強(qiáng)中藥種植與加工、炮制規(guī)范化加強(qiáng)中藥化學(xué)成份基礎(chǔ)研究應(yīng)用當(dāng)代分析技術(shù)伎倆進(jìn)行中藥指紋圖譜研究中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第11頁儀器設(shè)備技術(shù)人員研究經(jīng)驗(yàn)系統(tǒng)性問題穩(wěn)定性問題特征性問題9.中藥指紋譜研究過程中面臨問題中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第12頁色譜法

1.液相色譜法（LC） 2.氣相色譜法（GC） 3.薄層掃描法（TLC） 4.毛細(xì)管電泳法（CE）其它

1.質(zhì)譜法（MS）及色譜與質(zhì)譜聯(lián)用 2.X-衍射法 3.近紅外法（NIR）等（二）中藥指紋圖譜研究方法學(xué)中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第13頁（三）中藥指紋圖譜技術(shù)發(fā)展應(yīng)用范圍儀器設(shè)備與軟件指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第14頁二、中藥指紋圖譜研究指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第15頁（一）目標(biāo)和要求（二）中藥指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)起草說明（三）中藥指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)建立中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第16頁中藥質(zhì)量研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一個(gè)主要內(nèi)容加強(qiáng)中藥質(zhì)量管理、提升中藥質(zhì)量、確保藥品安全、有效、穩(wěn)定、可控固定原料藥（中藥材）品種、產(chǎn)地和采收季節(jié)前提下，需制訂原料藥(中藥材)和注射劑指紋圖譜（一）目標(biāo)和要求中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第17頁（二）中藥指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)起草說明1.名稱、漢語拼音2.起源（產(chǎn)地、采收期、炮制）按中藥命名標(biāo)準(zhǔn)制訂藥材：產(chǎn)地、采收期、炮制中間體：提取工藝或提取物起源中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第18頁3.供試品溶液制備

有效成份(專屬性成份、指標(biāo)性成份)理化性投質(zhì)并結(jié)合檢測方法要求提取工藝參考物溶液制備 對照品內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)提取物

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第19頁中藥指紋圖譜檢測方法驗(yàn)證（1）檢測方法測定方法、儀器、試劑、測定條件（2）驗(yàn)證專屬性（空白試驗(yàn)）精密度試驗(yàn)（RSD<3%） 重復(fù)性與重現(xiàn)性試驗(yàn)（S<0.95）穩(wěn)定性試驗(yàn)（S<0.95）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)6.指紋圖譜相關(guān)性中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第20頁（三）中藥指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)建立中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第21頁注意事項(xiàng)

（1）全部成份應(yīng)在2小時(shí)左右洗脫，并提供2小時(shí)指紋圖譜（2）可建立各個(gè)組分指紋圖譜（3）可建立各種方法指紋圖譜（4）可選擇經(jīng)典樣品指紋圖譜，或標(biāo)準(zhǔn)提取物指紋圖譜，或含有代表性勾兌樣品指紋圖譜作為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第22頁2.指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)建立

（1）藥材、中間體指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)為企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，列入起草說明（2）10批供試品（3）標(biāo)準(zhǔn)要求：供試品指紋圖譜與對照提取物（標(biāo)準(zhǔn)提取物指紋圖譜一致；或供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜（標(biāo)準(zhǔn)圖譜）一致；或經(jīng)過對各特征峰位置（相對保留時(shí)間、比移值等）、豐度（積分面積或峰高）及相對豐度、光譜特征（顏色）等綜合參數(shù)描述給予確定。中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第23頁指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)書寫格式液相色譜法【指紋圖譜】照高效液色譜法（中國藥典一部附錄VID），結(jié)合指紋圖譜要求測定。色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)如以對照品做系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，則參考中國藥典書寫格式。如以隨行對照提取物做系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，則只書寫所用儀器、色譜柱型號及相關(guān)參數(shù)和各項(xiàng)詳細(xì)試驗(yàn)條件。對照品溶液制備如有對照品則照中國藥典書寫格式。供試品溶液制備精密吸收供試品溶液、對照品溶液（或?qū)φ沼锰崛∥锶芤海└鱔Xml，分別流入液相色譜儀，測定。本品指紋圖譜主要特征供試品指紋圖譜與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附對照指紋圖譜（或隨行對照提取物指紋圖譜）經(jīng)計(jì)算軟件計(jì)算，相同度大于XX，符合要求（或相同度小于XX，不符合要求）。中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第24頁三、指紋圖譜研究相同度計(jì)算中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第25頁（一）、指紋圖譜相同度評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)與方法（二）、指紋圖譜相同度計(jì)算原理（三）、指紋圖譜相同度評價(jià)軟件中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第26頁（一）、指紋圖譜相同度評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)與方法標(biāo)準(zhǔn)：整體性、含糊性、特征性方法：直接觀察、計(jì)算機(jī)輔助相同性計(jì)算中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第27頁1.引用參數(shù)2.數(shù)據(jù)獲取路徑3.相同度算法（二）、指紋圖譜相同度計(jì)算原理中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第28頁1.引用參數(shù)①保留時(shí)間(RT)②峰高(Height)③峰面積(Area)④峰面積百分比（Area%）⑤相對保留時(shí)間（RatioofRetentionTime,RRt）⑥積分相對比值（RatioofArea,RA）中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第29頁2.數(shù)據(jù)獲取途徑（1）圖形/圖像轉(zhuǎn)化成ASCII數(shù)據(jù)（2）截片數(shù)據(jù)（3）色譜數(shù)據(jù)

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第30頁3.相似度算法

夾角余弦算法 相關(guān)系數(shù)算法優(yōu)化算法中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第31頁1.軟件開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)2.市售/慣用軟件介紹3.相同度軟件使用過程中應(yīng)注意問題（三）、指紋圖譜相同度評價(jià)軟件中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第32頁1.軟件開發(fā)原則系統(tǒng)獨(dú)立性

(2)計(jì)算方法科學(xué)性

(3)數(shù)據(jù)接口通用性

(4)操作過程及應(yīng)用實(shí)用性中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第33頁2.市售/慣用軟件介紹浙江大學(xué)陳一宇教授中南大學(xué)梁逸增教授沈陽藥科大學(xué)畢開順教授西北大學(xué)李華教授二軍大Waters中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第34頁3.相同度軟件使用過程中應(yīng)注意問題數(shù)據(jù)接口與數(shù)據(jù)類型數(shù)據(jù)校正算法選擇中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第35頁四、中藥指紋圖譜研究方法與思緒中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第36頁（一）、研究方案設(shè)計(jì)（二）、樣品選擇與搜集（三）、供試品制備（四）、指紋圖譜色譜條件研究思緒（五）、相同度值研究與指紋特征中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第37頁（一）、研究方案設(shè)計(jì)資料搜集與整理

文件、工藝資料、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方案設(shè)計(jì)

（1）研究對象-有效成份（2）研究方法選擇-色譜法(HPLCGCTLC)及其它方法（3）研究內(nèi)容-依據(jù)技術(shù)要求要求：包含“名稱、起源、制備、檢測方法、標(biāo)準(zhǔn)要求及起草說明”中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第38頁（二）、樣品選擇與搜集要求： 10個(gè)批次道地藥材與GAP基地藥材經(jīng)典性與代表性離散樣品剔除中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第39頁（三）、供試品制備依據(jù)：有效組分物理化學(xué)性質(zhì)生產(chǎn)或提取工藝檢測方法需要中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第40頁（四）、指紋圖譜色譜條件研究思緒高效液相色譜法HPLC氣相色譜法GC中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第41頁（1）檢測波長選擇（簡）（2）柱溫選擇（略）（3）進(jìn)樣量（簡）（4）色譜柱選擇（重點(diǎn)）（5）檢測成份選擇（重點(diǎn)）（6）流動(dòng)相（梯度表）選擇（重點(diǎn)）1.高效液相色譜法HPLC中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第42頁示例：蜂膠(BeePropolis)（1）檢測波長選擇中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第43頁

=280nm

=360nm

=254nm

=210nm中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第44頁波長選擇：

=280nm中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第45頁（4）色譜柱選擇

選取市場上較常見填料所填充色譜柱，比如：Eka-NobelKromasiC18(5mm)，其分離效果好、性能穩(wěn)定，不論是國產(chǎn)填充Kromasi色譜柱，還是國外企業(yè)填充Kromasi色譜柱，在分離效果上基本相同。所以對于大多數(shù)中藥注射劑，可選取Kromasi色譜柱。如選取乙腈-緩沖溶液，應(yīng)依據(jù)緩沖溶液特點(diǎn)，選取對應(yīng)色譜柱：①如為酸性緩沖溶液，可選取ZorbaxSB-C18色譜柱（pH<2）；②如為堿性緩沖溶液，可選取EclipseXDB-C18色譜柱（pH>6）。示例：不一樣色譜柱對三七總皂苷分離效果中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第46頁Lichosorb中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第47頁P(yáng)olaris中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第48頁Kromasil中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第49頁Diamonsil中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第50頁Carbosorb中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第51頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第52頁（5）檢測成份選擇（重點(diǎn)）示例：何首烏中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第53頁何首烏生品液相色譜圖（全局圖）中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第54頁何首烏生品液相色譜圖（局部放大圖）中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第55頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第56頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第57頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第58頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第59頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第60頁中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第61頁圖9上海制首烏指紋圖譜

北京良方藥業(yè)制首烏

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第62頁北京金象藥店制首烏

北京壽春堂藥店制首烏指紋圖譜

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第63頁（6）流動(dòng)相（梯度表）選擇主要影響原因1.起始濃度2.梯度速率3.流速中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第64頁時(shí)間∕min水%（H+/OH-）*乙腈%*Ⅰ

01000552080600100Ⅱ

01000407030606040Ⅲ

08020406040605050Ⅳ

06040403070600100*為體積百分比（V/V）

指紋圖譜流動(dòng)相梯度優(yōu)化*

為體積百分比（V/V）

梯度表中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第65頁初始色譜條件時(shí)間（min）水%（H+/OH-）乙腈%01000600100時(shí)間（min）水%（H+/OH-）乙腈%01000552080600100中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第66頁初始色譜條件設(shè)定依據(jù)及目標(biāo)依據(jù)：化合物極性大小。如未知時(shí)，假設(shè)有效組分中包含各種極性成份。目標(biāo)：快速確定主要或大部分化合物被洗脫時(shí)流動(dòng)相組成，為優(yōu)化條件選擇提供依據(jù)。中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第67頁優(yōu)化條件選擇選擇依據(jù)：初始色譜圖、梯度洗脫表及一定經(jīng)驗(yàn)示例：（1）淫羊藿總黃酮（40%）提取物 （2）鉤藤總生物堿 （3）黃連藥材 （4）知母總皂苷

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第68頁淫羊藿提取物在初始條件下色譜圖中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第69頁淫羊藿提取物第一次優(yōu)化后色譜圖中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第70頁梯度速率： 初始：100/60min=1.7/min 優(yōu)化：0~1.7中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第71頁CH3CN%CH3CN%MinMin初始條件中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第72頁CH3CN%Min三七人參西洋參CH3CN%Min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第73頁起始濃度：依據(jù)初始色譜圖中主要色譜峰被洗脫時(shí)流動(dòng)相組成，對應(yīng)降低~20%。流速：0.5~2.0ml/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第74頁2.氣相色譜法（1）影響色譜峰分離程度原因 色譜柱類型 載氣流速 起始柱溫 升溫速率

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第75頁（2）研究示例 樣品：廣藿香油指紋圖譜研究過程

方案設(shè)計(jì)中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第76頁檢測方法 （1）色譜方法 廣藿香油為廣藿香藥材經(jīng)水蒸汽蒸餾而得到揮發(fā)油，均為易揮發(fā)組分，擬采取氣相色譜法（GC）。 （2）儀器：

Agilent6890GC （3）色譜柱選擇 可供選擇色譜柱：極性 非極性 中等極性 （4）進(jìn)樣方式確實(shí)定

手動(dòng)自動(dòng)頂空中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第77頁2.供試品溶液制備

取廣藿香油適量，加醋酸乙酯溶解，即得。 注：對于非極性毛細(xì)管色譜柱，如供試品溶液中含少許少，最好干燥后進(jìn)樣。中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第78頁2.色譜條件探索（1）對梯度速率及流速進(jìn)行微調(diào)-由粗到精

中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第79頁初始條件流速： 3.0 ml/min進(jìn)樣口溫度： 250 ℃檢測口溫度： 280 ℃初始柱溫： 50 ℃升溫速率： 30 ℃/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第80頁第一次優(yōu)化流速： 2.0 ml/min進(jìn)樣口溫度： 250 ℃檢測口溫度： 280 ℃初始柱溫： 50 ℃升溫速率： 20 ℃/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第81頁第二次優(yōu)化流速： 1.0 ml/min進(jìn)樣口溫度： 250 ℃檢測口溫度： 280 ℃初始柱溫： 50 ℃升溫速率： 10 ℃/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第82頁第三次優(yōu)化流速： 1.0 ml/min進(jìn)樣口溫度： 250 ℃檢測口溫度： 280 ℃初始柱溫： 50 ℃升溫速率： 5 ℃/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第83頁第四次優(yōu)化流速： 0.5 ml/min進(jìn)樣口溫度： 250 ℃檢測口溫度： 280 ℃初始柱溫： 50 ℃升溫速率： 5 ℃/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第84頁（2）選擇細(xì)化初始條件-由細(xì)到精中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第85頁初始條件流速： 1.0 ml/min進(jìn)樣口溫度： 250 ℃檢測口溫度： 280 ℃初始柱溫： 50 ℃升溫速率： 1.0 ℃/min中藥指紋圖譜研究技術(shù)專家講座第86頁第一次優(yōu)化流速：