生態(tài)背景決定土壤細(xì)菌多樣性對施肥的響應(yīng)

一、引言土壤微生物多樣性能夠調(diào)節(jié)自然和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的養(yǎng)分循環(huán)、作物產(chǎn)量和生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性，進而維持生態(tài)功能。施肥是人類改造自然的大規(guī)?；顒?，影響陸地生態(tài)系統(tǒng)并引發(fā)全球變化，同樣會對土壤微生物多樣性產(chǎn)生重大影響。過量施肥會造成多種負(fù)面影響，甚至引發(fā)全球效應(yīng)，如生產(chǎn)成本提高、對不可再生能源的高度依賴、水污染和土壤退化等。為此，學(xué)界圍繞施肥對農(nóng)田土壤微生物的影響已經(jīng)開展數(shù)十年的研究，但是大多聚焦于局域或者區(qū)域尺度。在更大空間范圍下，由于不同地區(qū)的土壤性質(zhì)不同，施肥對土壤微生物多樣性的影響也會不同。研究發(fā)現(xiàn)施用有機肥能夠增加酸性土壤的微生物多樣性，但卻會降低堿性土壤的微生物多樣性，而對中性土壤微生物多樣性沒有影響。此外，施肥類型（如無機vs有機）也會對土壤微生物多樣性產(chǎn)生不同影響。盡管前人也在大空間尺度下探究了養(yǎng)分添加對土壤微生物多樣性的影響，但這些工作都是基于自然生態(tài)系統(tǒng)，且試驗周期相對較短（小于4年）。目前對于較長時間尺度和較大空間范圍下農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)施肥影響的認(rèn)知仍然有待提升，不同生態(tài)背景下土壤微生物多樣性對長期施肥響應(yīng)的方向和幅度也需要研究。本研究假設(shè)在大尺度環(huán)境梯度下，生態(tài)背景——包括當(dāng)?shù)貧夂蚝屯寥览砘再|(zhì)——決定了土壤微生物多樣性（豐富度、群落組成和物種水平）對施肥的響應(yīng)。簡而言之，本研究認(rèn)為在不同的生態(tài)背景下，施肥對土壤微生物多樣性的影響不一致。此外，還認(rèn)為可能存在一些“機會主義型”或者“敏感型”的微生物，它們受到肥料中養(yǎng)分和碳的刺激或者抑制，而不受生態(tài)背景的控制，進而對施肥表現(xiàn)出一致的響應(yīng)。這些物種可以作為施肥影響土壤肥力的指示生物。揭示大尺度（如洲際）生態(tài)背景如何影響土壤微生物多樣性對施肥的響應(yīng)，以及識別響應(yīng)一致的微生物類群，有助于準(zhǔn)確預(yù)測全球變化下土壤微生物多樣性變化以及功能分布。為此，本研究收集了中國10個20年以上的長期定位田間施肥試驗基地（農(nóng)作物主要是小麥和玉米）的表面非根際土（見附錄A中的圖S1和表S1）。試驗站點的選擇基于以下兩個理由：①過量施肥是中國農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)主要關(guān)注的問題之一。比如，小麥和玉米的氮肥施用量可分別高達283kg?hm2?a-1和402kg?hm2?a-1

。②小麥和玉米是中國主要的糧食作物，其種植面積覆蓋了中國大部分農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)[小麥面積共2.45×107

hm2（占19.6%）和玉米面積共4.24×107

hm2（占34.0%），2017]。每個試驗站點的運行時間都在20年以上（見附錄A中的圖S1和表S2）：control（不施肥）、氮鉀無機肥（NK）和氮磷鉀（NPK）以及有機無機配施[有機糞肥（OM）]和NPKM（OM+NPK）。這些試驗站點覆蓋了中國大部分氣候類型、土壤特征和農(nóng)業(yè)制度（見附錄A中的圖S1），為評估生態(tài)背景影響土壤微生物多樣性對施肥的響應(yīng)提供了理想的供試材料。本研究利用擴增子測序探究細(xì)菌豐富度、群落組成和優(yōu)勢物種類群（相對豐度在前10%的物種）對施肥的響應(yīng)（包括方向和幅度）。選擇細(xì)菌群落作為研究對象基于兩個理由：①細(xì)菌是地球上最多樣和最豐富的生物；②在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，細(xì)菌是土壤肥力、土壤健康和植物生產(chǎn)力的重要引擎。二、材料和方法（一）長期施肥試驗資料

10個長期施肥試驗站點的詳細(xì)信息見附錄A中的圖S1和表S1。站點以及施肥起始時間如下：新疆阜康荒漠生態(tài)系統(tǒng)試驗站（FK），始于1987年；河南封丘潮土農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)試驗站（FQ），始于1989年；陜西長武黃土高原農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)試驗站（CW），始于1984：江西鷹潭紅壤農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)試驗站（YT），始于1980年；安徽楊柳砂姜黑土農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)試驗站（YL），始于1981年；安徽蒙城砂姜黑土農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)試驗站（MC），始于1982年；黑龍江海倫黑土農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)試驗站（HL），始于1987年；遼寧沈陽農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)試驗站（SY），始于1979年；江西進賢紅壤油料作物試驗站（JX），始于1986年；湖南祁陽紅壤農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)試驗站（QY），始于1990年。主要的施肥處理如下：①control，不施肥；②NK，施用尿素和硫酸鉀，不施用過磷酸鈣；③NPK，施用尿素、硫酸鉀和過磷酸鈣；④NPKM（50%氮來自堆肥，無機肥包括50%氮和磷鉀）；⑤OM（總氮量全部來自堆肥，加上與NPK處理相同的無機磷、鉀肥）。（二）土壤取樣和化學(xué)測量2015年收獲季后采集中國10個長期施肥試驗站點的表層非根際土。YT、YL、CW、SY、MC、QY、JX每個施肥處理各有3個重復(fù)小區(qū)，而FQ、FK、HL每個施肥處理各有4個重復(fù)小區(qū)，分別在每個小區(qū)內(nèi)采取兩個復(fù)合樣品?；旌?0個10cm深度的隨機土芯，得到一個復(fù)合樣品。所有工具都用75%的乙醇消毒。共采集284個土壤樣品，用于后續(xù)土壤理化性質(zhì)和分子實驗分析。樣品放入無菌自封袋中，一周內(nèi)送往實驗室保存于4℃冰箱。用于生物測定的土壤樣品過篩（2mm目）后保存于-40℃冰箱中以進行DNA提取。用于土壤理化性質(zhì)分析的土壤樣品風(fēng)干后過篩（100目），根據(jù)《土壤理化分析》（魯如坤編）提供的方法測定土壤pH值，有機質(zhì)（SOM）、可溶性有機碳（DOC）、總氮（TN）、總磷（TP）、總鉀（TK）、有效氮（AN）、有效磷（AP）、有效鉀（AK）、硝酸鹽（N以—NO3-的形式存在）和銨鹽（N以—NH4+的形式存在）的含量。土壤理化性質(zhì)的詳細(xì)信息見附錄A中的表S2。（三）土壤DNA提取對每個樣品，使用試劑盒FastDNASPINKit（MPBiomedicals，美國）提取土壤總DNA。DNA樣溶于50μLTris-EDTA緩沖液，用微量分光光度計（Nanodrop1000）定量，并保存于-40℃冰箱中待后續(xù)使用。（四）擴增子文庫的制備及高通量測序利用16S擴增子測序表征細(xì)菌群落。對每個DNA樣本，使用通用引物519F/907R對細(xì)菌16SrRNA基因的V4~V5片段（約400bp）進行擴增。正向引物加入5bp已知堿基序列的分類標(biāo)簽以區(qū)分不同樣本。隨后進行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），50μL反應(yīng)體系包括：脫氧核苷三磷酸4μL（2.5mmol?L-1）；2μL正向和反向引物（10mmol?L-1）；2UTaqDNA聚合酶（TaKaRa，日本）和1μLDNA模板（50ng）。每一批次實驗均設(shè)置以無菌水（ddH2O）為模板的陰性對照以排除環(huán)境污染。反應(yīng)進行35個循環(huán)（95℃45s、56℃45s和72℃60s），最終在72℃下復(fù)性延伸7min。使用QIAquickPCRPurificationKit（Qiagen，德國）純化試劑盒純化PCR擴增產(chǎn)物，然后以等摩爾量進行混合。隨后用TruSeqDNA樣品制備試劑盒和MiSeq試劑盒（600個循環(huán)）進行測序。本研究所用的細(xì)菌16SrRNA基因序列已上傳至日本DNADatabank數(shù)據(jù)庫（DDBJ）中（索引號PRJDB9137）。（五）處理高通量測序數(shù)據(jù)原始雙端序列數(shù)據(jù)用FLASH組裝并用UPARSE算法處理。用Cutadapt（v1.9.2）去除引物。去除平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于25且長度低于300bp的序列，并使用UPARSE過濾嵌合體。基于97%的相似性閾值聚類得到分類操作單元（operationaltaxonomicunit,OTU），然后利用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomaldatabaseproject,RDP）classifier（v2.12）進行物種注釋以確定細(xì)菌分類（置信度大于80%）。基于PyNAST算法以GreenGene數(shù)據(jù)庫（v138）為模板對OTU代表序列進行排序?qū)R，使用FastTree構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。最終，共獲得20294908條優(yōu)質(zhì)的細(xì)菌16SrRNA基因序列，每個樣本的序列數(shù)在40691到158122之間，中值為68470。由于不同樣本間alpha（α）和beta（β）多樣性的比較需要基于同樣的采樣深度，故將所有樣本的序列統(tǒng)一抽平到40000條用于下游分析。（六）細(xì)菌豐富度、群落組成和響應(yīng)施肥的指示生物使用響應(yīng)率算法（logresponseratio,lnRR）來表征，與不施肥對照相比施肥處理對細(xì)菌豐富度（OTU數(shù)量）的影響，包括變化的幅度和方向。該項分析使用R軟件（v3.3.1）的工具包“Metafor”進行。以Bray-Curtis距離來量化群落物種組成差異，使用非度量多維標(biāo)度（NMDS）進行可視化，并通過置換多元方差分析（PERMANOVA）檢驗不同處理間微生物群落組成的差異。PERMANOVA得出的F值代表細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異程度。針對常見豐富類群（相對豐度前10%的OTU，合計占總序列數(shù)的87.5%），基于lnRR量化施肥處理下其相對豐度的變化情況，并將其劃分為4種響應(yīng)策略：在9個位點以上相對豐度均增加的微生物（即95%置信區(qū)間lnRR>0）被歸為“機會主義型”；而在9個位點以上其相對豐度均減少的微生物（即95%置信區(qū)間lnRR<0）被歸為“敏感型”；在每個位點中相對豐度均沒有顯著變化的微生物（即95%置信區(qū)間lnRR跨越零）被歸為“耐受型”；在不同站點間其相對豐度變化趨勢不一致的微生物被歸為“背景依賴型”。使用iTOL（InteractiveTreeofLife）工具（https://itol.embl.de）繪制細(xì)菌分類群的系統(tǒng)發(fā)育樹和每個分類單元在施肥后的響應(yīng)策略。（七）數(shù)據(jù)分析單因素方差分析（ANOVA）用以評估施肥的影響，使用誠實性顯著差異（honestlysignificantdifference,HSD）進行事后比較（posthoc）。分別進行Pearson和Mantel分析，評估細(xì)菌群落（即豐富度和組成）與環(huán)境變量的相關(guān)性。P

<0.05和P

<0.01分別表示樣本間差異顯著和差異極顯著。為了確定環(huán)境變量對細(xì)菌的lnRR、群落組成變化和常見豐富分類群變化的直接和間接影響，利用AMOS20.0（SPSSInc.）建立并測試結(jié)構(gòu)方程模型（SEM）。使用最大似然估計法比較SEM與觀察結(jié)果。模型的準(zhǔn)確性由卡方（χ2）檢驗、比較擬合指數(shù)（CFI）、擬合優(yōu)度指數(shù)（GFI）和近似均方根誤差（RSMEA）確定。不顯著的χ2、高CFI、高GFI（>0.9）和低RSMEA（<0.05）表示模型準(zhǔn)確性高。三、結(jié)果與討論（一）生態(tài)背景決定細(xì)菌多樣性對施肥的響應(yīng)首先評估了中國10個代表性試驗站點的土壤細(xì)菌豐富度對施肥的響應(yīng)[圖1（a）]。這些站點代表了不同的氣候條件[如不同的年均氣溫（MAT）和年均降雨量（MAP）]和土壤性質(zhì)（如土壤pH）（見附錄A中的表S1）），且試驗設(shè)置包括了無機和有機兩種典型施肥處理（見附錄A中的表S2）。結(jié)果表明，生態(tài)背景（站點環(huán)境）和施肥策略決定細(xì)菌豐富度對施肥響應(yīng)的方向和幅度[見圖1（a）和附錄A中的圖S2]，即土壤微生物多樣性的響應(yīng)與當(dāng)?shù)氐耐寥佬再|(zhì)、氣候條件和施肥策略有關(guān)[圖1（b）、（c）]。該結(jié)果與研究結(jié)論有所不同，其主要原因可能源自于以下差異：①施肥時間不同（施肥時間：小于4年vs20年）；②施肥類型不同（如無機vs無機有機配施）；③生態(tài)系統(tǒng)類型不同（如自然生態(tài)系統(tǒng)vs農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)）。本研究擁有更大的空間范圍以及更多的施肥類型，使得研究結(jié)果相對于前人的工作更加的全面和準(zhǔn)確。眾所周知，大尺度下氣候狀況（如MAT和MAP）和土壤性質(zhì)驅(qū)動土壤微生物群落多樣性、結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能，并決定微生物對環(huán)境變化的響應(yīng)。例如，在MAT和MAP高的酸性土壤中，施用有機肥能夠增加微生物多樣性，而與之相反，在MAT和MAP低的堿性土壤中微生物多樣性則下降。圖1.（a）中國10個長期定位施肥試驗站點（FK、FQ、CW、YT、YL、MC、HL、SY、JX和QY）有機無機配施[NPKM和（或）OM]和無機施肥[NPK和（或）NK]對細(xì)菌豐富度的影響（lnRR）。水平誤差棒表示95%置信區(qū)間。根據(jù)土壤pH梯度對所有樣點進行著色。（b）10個站點細(xì)菌群落物種豐富度變化與土壤pH值（經(jīng)lg轉(zhuǎn)換）的相關(guān)性。（c）緯度、經(jīng)度、氣候、土壤特性以及施肥類型對10個試驗站點細(xì)菌豐富度變化的直接和間接影響。箭頭線條的寬度與該路徑相關(guān)系數(shù)的大小成正比，并輔以數(shù)字表示。實線和虛線分別表示正負(fù)關(guān)系。R2：解釋的方差比例。df：自由度。條形圖展示了SEM結(jié)果中施肥和當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)背景對細(xì)菌群落物種豐富度變化的標(biāo)準(zhǔn)化總效應(yīng)（直接效應(yīng)+間接效應(yīng)）。結(jié)果表明，在全國范圍內(nèi)土壤酸度（即土壤pH，土壤微生物變化的主要驅(qū)動因子）主導(dǎo)了細(xì)菌豐富度對施肥的響應(yīng)[見圖1（b）和附錄A中的表S3]。酸性土壤中的細(xì)菌豐富度對施肥更敏感，尤其在降水量大和（或）土壤肥力高的地區(qū)。在中性（如YL和MC）和酸性（如SY和QY）土壤中（見附錄A中的表S1），施用無機肥導(dǎo)致土壤酸化或者進一步酸化（見附錄A中的表S2），從而大幅降低了細(xì)菌豐富度（見附錄A中的表S4）。前人研究也發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境抑制微生物生長，從而降低土壤細(xì)菌多樣性。同時大量研究也報道了施用無機肥降低了酸性和中性土壤中的微生物多樣性。相比之下，堿性土壤對化肥施用導(dǎo)致的酸化有一定的緩沖作用，因而其微生物多樣性變化不大[如YT、FK和CW；圖1（A）、附錄A中的圖S2、表S2和S4]。土壤pH值是表征生態(tài)背景的綜合性代用指標(biāo)，是較大空間范圍內(nèi)土壤細(xì)菌群落變化的重要相關(guān)因子或驅(qū)動因素。因此，以土壤pH值為綜合代用指標(biāo)，有助于全面揭示施肥制度和生態(tài)背景對土壤細(xì)菌多樣性的影響機制。SEM結(jié)果量化了生態(tài)背景（即氣候和土壤特性）和施肥制度對細(xì)菌豐富度[圖1（c）]和細(xì)菌群落組成變化（見附錄A中的圖S3、S4和表S5）的直接和間接影響。該模型解釋了土壤細(xì)菌對施肥響應(yīng)的大部分變異[細(xì)菌豐富度變化lnRR模型的R2

=87.3%，圖1（c）；群落組成變化模型的R2=62.8%，見附錄A中的圖S4]。在所有的環(huán)境變量中，土壤pH與年均降雨量、年均氣溫以及土壤肥力均緊密相關(guān)（見附錄A中的表S6），其對細(xì)菌豐富度對施肥響應(yīng)程度的影響也最為重要[見圖1（c）和附錄A中的表S6]。同樣，生態(tài)背景（MAT、MAP、土壤pH和TP）也影響了細(xì)菌群落組成對施肥的響應(yīng)（見附錄A中的表S7~S9）。具體而言，在全國范圍內(nèi)，細(xì)菌群落組成的變化也根據(jù)站點和施肥類型不同而有差異，且與施肥對土壤酸度的影響密切相關(guān)（見附錄A中的表S6）。研究結(jié)果進一步表明，在10個試驗站點中，有機肥對細(xì)菌豐富度的影響要小于無機肥（t檢驗P

=0.038）[見圖1（a）及附錄A中的圖S2和表S6]。即使如此，生態(tài)背景依然影響著細(xì)菌豐富度對有機肥的響應(yīng)。對于大多數(shù)酸性土壤[如QY和JX（見附錄A中的表S2）]來說，有機肥降低土壤酸度（即提高土壤pH）并增加土壤細(xì)菌豐富度。該結(jié)果再次驗證土壤酸度調(diào)控細(xì)菌豐富度對施肥的響應(yīng)這一結(jié)論。此外，與施用無機肥相比，施用有機肥向土壤中投入了大量外源碳，能夠刺激更多的微生物譜系，進而降低生態(tài)背景引起的差異。SEM結(jié)果進一步強調(diào)了與生態(tài)背景相關(guān)的土壤肥力[包括總碳、磷和鉀含量（見附錄A中的表S3、S4、S9和S10]，同樣影響細(xì)菌豐富度和群落組成對施肥的響應(yīng)。細(xì)菌豐富度對施肥的響應(yīng)機制與作物品種無關(guān)。小麥（FK和CW）或者玉米（HL、SY和JX）并不影響土壤細(xì)菌豐富度對無機肥（t檢驗P

=0.43）或有機肥（t檢驗P=0.48）施用的響應(yīng)。綜上所述，本研究表明施肥對土壤微生物多樣性的影響因當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)背景的差異而有所不同。在全國范圍內(nèi)，酸性土壤微生物多樣性更易受施肥的影響，且無機肥比有機肥的影響更大[見圖1（c）和附錄A中的圖S4]。圖2.優(yōu)勢微生物（相對豐度占比前10%）對施用無機肥（外環(huán)）和有機肥（內(nèi)環(huán)）的響應(yīng)策略。表格展示了施肥后4種響應(yīng)策略微生物的百分比。門水平微生物對應(yīng)的值表示各門類下“機會主義型”、“敏感型”和“耐受型”三種分類群合計所占的百分比。各門類顏色與系統(tǒng)發(fā)育樹分支顏色相對應(yīng)。系統(tǒng)發(fā)育樹中的餅圖顯示了無機（外部餅圖）和有機（內(nèi)部餅圖）施肥下各門類微生物響應(yīng)策略的分布情況。本文中，“機會主義型”和“敏感型”類微生物群分別是指在90%的站點中對施肥具有持續(xù)積極（相對豐度增加）和消極（相對豐度減少）響應(yīng)的微生物；“耐受型”是指在90%的站點中對施肥沒有顯著響應(yīng)的微生物。系統(tǒng)發(fā)育樹中排除了“背景依賴型”微生物，即除以上三種類型之外的微生物。（二）部分細(xì)菌類群對施肥具有相同的響應(yīng)按照之前的方法，進一步挑選群落中相對豐度前10%的優(yōu)勢細(xì)菌物種（總計占群落相對豐度的87.5%）（見附錄A中的圖S5），在物種層面評估細(xì)菌對不同施肥的響應(yīng)（圖2）。根據(jù)對施肥的響應(yīng)策略，將微生物劃分為4種類群：①“機會主義型”，定義為在90%的站點中對施肥有一致積極響應(yīng)（即相對豐度增加）的微生物類群；②“敏感型”，即在90%的站點中對施肥均有一致消極響應(yīng)（即相對豐度減少）的微生物類群；③“耐受型”，在90%的站點中對施肥均無顯著響應(yīng)的微生物類群；④“背景依賴型”，除以上三種類型之外的微生物類群，即其相對豐度變化在不同位點不一致。結(jié)果表明，土壤中的確存在少量微生物類群對施肥的響應(yīng)一致，它們分別是“機會主義型”微生物（有機肥施肥中2.3%和無機肥施肥中0.2%）和“敏感型”微生物（0.3%和0.7%）（見附錄A中的圖2和表S11）。與不施肥的土壤相比，施肥后養(yǎng)分和碳輸入可能誘導(dǎo)“機會主義型”微生物的富集。SEM結(jié)果表明長期施肥對“機會主義型”微生物類群相對豐度的影響要大于生態(tài)背景所造成的區(qū)域差異[包括氣候和土壤性質(zhì)，圖3（a）和圖3（b）]。“機會主義型”微生物類群主要隸屬于變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bateroidetes）[見圖2和附錄A中的圖S6]，它們都是富營養(yǎng)型微生物，因此在施肥后的富營養(yǎng)環(huán)境中更具有競爭優(yōu)勢。例如，氮素的添加刺激了Nitrosospira和Nitrososphaera；而擬桿菌門中的Chitinophagaceae、厚壁菌門中的Bacilli和變形菌門中的光合細(xì)菌（Rhodopseudomonas、Rhodospirillaceae