膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎治療的再生工程

一、引言骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性病變和關(guān)節(jié)疼痛為特征的慢性疾病，是世界范圍內(nèi)最常見的關(guān)節(jié)炎。OA是一種復(fù)雜的疾病，其病變累及包括關(guān)節(jié)軟骨、滑膜和軟骨下骨在內(nèi)的整個滑膜關(guān)節(jié)。該病發(fā)病后，促炎因子的釋放導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂(圖1)。重要的是，OA是關(guān)節(jié)炎患者由于疼痛致殘的首要原因，約70%住院的關(guān)節(jié)炎患者和23%門診就診的關(guān)節(jié)炎患者患有膝關(guān)節(jié)OA。膝關(guān)節(jié)的解剖位置決定了它承受著身體大部分的重量，使得膝關(guān)節(jié)OA成為OA的最常見類型。50歲以上的老年人患膝關(guān)節(jié)OA的風(fēng)險增高，其可能的原因是激素水平的改變或軟骨細(xì)胞的老化。約1/3的美國成人存在肥胖問題，由于其膝關(guān)節(jié)負(fù)重增加或脂肪組織釋放脂肪因子，因而這些人中的2/3在其一生中有患膝關(guān)節(jié)OA的可能。2008年，約有2700萬的美國成人患有OA。2005年美國患有關(guān)節(jié)炎的成人數(shù)量為4780萬，到2030年，預(yù)計這一數(shù)字將增長到6700萬以上。由于《平價醫(yī)療法案》的實施，預(yù)計尋求醫(yī)療幫助的患者會進(jìn)一步增多。每個膝關(guān)節(jié)OA患者每年的總治療費用超過6000美元，終生治療費用超過10萬美元。這一數(shù)字只是官方統(tǒng)計結(jié)果，OA患者還有些額外的開銷沒有計算在內(nèi)，如誤工費和疼痛致殘對生活質(zhì)量的影響。因而OA是一個十分嚴(yán)重的健康問題，它不僅給患者帶來了身體負(fù)擔(dān)，也給患者和醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。圖1.健康關(guān)節(jié)與骨性關(guān)節(jié)炎(OA)關(guān)節(jié)間的結(jié)構(gòu)差異?；|(zhì)蛋白酶的表達(dá)在誘導(dǎo)OA中起重要作用。膝關(guān)節(jié)OA的末期手術(shù)方案是全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)(TKA)。TKA涉及由金屬合金和聚合物制成的膝關(guān)節(jié)假體。對多數(shù)患者來說，該手術(shù)可以減輕疼痛，改善肢體功能和生活質(zhì)量。然而，對于TKA失敗的患者來說，翻修手術(shù)也十分常見。到2030年，預(yù)計TKA的需求量可達(dá)300萬，這也使翻修手術(shù)的需求增加，這一數(shù)字在2005年時是45萬。隨著膝關(guān)節(jié)OA的患病率和治療費用的增長，有必要探尋新的、侵襲性小的、性價比更高的治療方法，從而減少或消除患者對TKA的需求。在研究者的努力下，已經(jīng)開發(fā)出具有不同成功率的手術(shù)干預(yù)方法。一個值得注意的創(chuàng)新方法是手術(shù)侵襲性較小的軟骨下關(guān)節(jié)修復(fù)術(shù)，這一技術(shù)應(yīng)用磷酸鈣類骨替代材料治療與末期膝關(guān)節(jié)OA進(jìn)展相關(guān)的骨髓病變，從而預(yù)防嚴(yán)重的OA和代替TKA的應(yīng)用。雖然該技術(shù)有這些益處，但仍有一些患者不愿接受這種治療。此外，軟骨下關(guān)節(jié)修復(fù)術(shù)僅能應(yīng)用于治療骨髓病變。因此，結(jié)合了生物材料學(xué)、干細(xì)胞科學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和物理力學(xué)的創(chuàng)新性再生工程干預(yù)方法將有望用于治療膝關(guān)節(jié)OA?！霸偕こ虒W(xué)”囊括了先進(jìn)的材料科學(xué)、干細(xì)胞科學(xué)、物理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)以及復(fù)雜組織和器官再生的臨床轉(zhuǎn)化。在本綜述中，我們旨在討論膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)病機(jī)制，以及當(dāng)前治療該病的基于生物材料和細(xì)胞的療法。二、骨性關(guān)節(jié)炎疼痛與治療方法疼痛是膝關(guān)節(jié)OA患者就診的首要原因。這種疼痛在發(fā)生時可能并不伴有膝關(guān)節(jié)OA的影像學(xué)改變，是種鈍痛，呈間歇性，以后逐漸加重。OA疼痛的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括一些可變和不可變因素?？勺円蛩匕w重、結(jié)構(gòu)破壞、生物因素(如炎癥)和社會文化因素。不可變因素為患者遺傳因素。我們在接下來的章節(jié)中討論炎癥、結(jié)構(gòu)病理學(xué)(如軟骨結(jié)構(gòu)破壞)和其他因素對疼痛的影響。（一）骨性關(guān)節(jié)炎疼痛膝關(guān)節(jié)OA發(fā)病的生物機(jī)制尚不完全明了，且有個體差異。膝關(guān)節(jié)中的軟骨細(xì)胞和其他類型細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)和降解酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。如促炎性白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子α等細(xì)胞因子誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，這些細(xì)胞因子可被滑膜關(guān)節(jié)中的神經(jīng)末梢受體識別，這一傷害性刺激可以激活高閾值(低敏感性)離子通道，導(dǎo)致疼痛信號從周圍組織向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳播。骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中產(chǎn)生的細(xì)胞因子可作用于關(guān)節(jié)神經(jīng)支配的傷害性感受器(有髓鞘或無髓鞘的感覺神經(jīng)元，可將疼痛信號從周圍組織傳播至中樞神經(jīng)系統(tǒng))，產(chǎn)生疼痛。雖然OA與疼痛頻發(fā)有關(guān)，但其真正的作用機(jī)制尚未完全闡明。對疼痛機(jī)制的進(jìn)一步研究有助于找到解決OA疼痛的新型治療方法。（二）骨性關(guān)節(jié)炎疼痛的治療方法膝關(guān)節(jié)疼痛是膝關(guān)節(jié)OA的主要癥狀，其治療方法包括非藥物和藥物治療。非藥物治療對于老年患者來說尤為重要，因其可以避免藥物使用導(dǎo)致的并發(fā)癥和較高的藥物毒性反應(yīng)的風(fēng)險。非藥物治療包括物理治療、休息、拐杖助行、冰支具和減重。美國風(fēng)濕病學(xué)會和國際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會發(fā)布的膝關(guān)節(jié)OA管理指南強(qiáng)烈建議規(guī)律的運動鍛煉減重是減輕OA疼痛的最佳方法。陸上和水中的運動訓(xùn)練是最主要的非藥物治療方法。陸上運動訓(xùn)練可暫時減輕疼痛、改善關(guān)節(jié)功能。一項納入3537名參與者的44項隨機(jī)對照試驗的Meta分析顯示，訓(xùn)練可立即減輕疼痛，且效果可持續(xù)2~6個月；另外針對這些隨機(jī)對照試驗的中等質(zhì)量證據(jù)表明，患者的關(guān)節(jié)功能在訓(xùn)練后可即刻得到改善。水中運動訓(xùn)練對于有嚴(yán)重運動和功能受限的患者也大有裨益。一項涉及64名參與者的18周隨訪臨床試驗顯示，在50英尺步行測試前后，水中運動訓(xùn)練較陸上運動訓(xùn)練減輕疼痛的效果更好。然而，最近一項隨機(jī)對照試驗的Meta分析認(rèn)為，水中運動訓(xùn)練只對肌肉骨骼系統(tǒng)疾病患者的疼痛、關(guān)節(jié)功能和生活質(zhì)量有中度改善作用，且效果與陸上運動訓(xùn)練相當(dāng)。低強(qiáng)度的運動訓(xùn)練，如太極拳和瑜珈，逐漸受到OA患者的歡迎。一項基于6項隨機(jī)對照試驗的Meta分析結(jié)果表明，太極拳可控制膝關(guān)節(jié)OA患者的疼痛，改善其關(guān)節(jié)功能。賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的一項初步研究顯示，8周的瑜珈運動可減輕50歲以上肥胖患者的關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙。雖然目前關(guān)于太極拳和瑜珈運動在膝關(guān)節(jié)OA治療中應(yīng)用的相關(guān)報道仍較少，但其結(jié)果對于膝關(guān)節(jié)OA患者來說是令人振奮的。膝關(guān)節(jié)OA治療的常用藥物包括非甾體抗炎藥、阿片類藥、非甾體抗炎藥與阿片類藥物聯(lián)合應(yīng)用、激素類藥物、軟骨保護(hù)劑、鈣和維生素以及關(guān)節(jié)內(nèi)類固醇注射劑。一項III期臨床試驗評估了OA患者每日1次口服低劑量美洛昔康治療疼痛，連續(xù)服用3個月的有效性和安全性。與使用安慰劑的患者相比，使用美洛昔康的患者在治療12周時疼痛明顯改善，但同時也出現(xiàn)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如頭痛、腹瀉、尿路感染和惡心。某些阿片類藥物，如他噴他多和曲馬多，在治療中重度急性O(shè)A疼痛效果顯著。III期臨床試驗結(jié)果顯示，他噴他多的不良反應(yīng)主要是胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；曲馬多最常見的不良反應(yīng)是頭暈、惡心和便秘。最近，有臨床研究證實了局部非甾體抗炎藥治療OA的有效性和安全性。局部與口服非甾體抗炎藥在對膝關(guān)節(jié)疼痛超過1年的治療中效果等同，且局部非甾體抗炎藥治療的不良反應(yīng)更少；另外，相對于口服非甾體抗炎藥，由于局部非甾體抗炎藥的不良反應(yīng)少，因此較少患者更換治療藥物。局部非甾體抗炎藥治療相對于口服非甾體抗炎藥治療不良反應(yīng)少的原因可能是其峰值血藥濃度更低。目前臨床治療中度OA的主要手段是關(guān)節(jié)內(nèi)注射抗炎藥物，如關(guān)節(jié)內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇和醋氨酚常用于減輕疼痛?？傮w來講，一些有效的治療方法已被用于控制炎癥和減輕疼痛，但也存在明顯的不良反應(yīng)。因而，有必要探尋一些替代治療方法減輕膝關(guān)節(jié)OA患者的疼痛，如基于生物材料的黏彈性產(chǎn)品補(bǔ)充療法。黏彈性產(chǎn)品補(bǔ)充療法基于關(guān)節(jié)內(nèi)透明質(zhì)酸(HA)的注射，從而恢復(fù)關(guān)節(jié)腔滑液的黏彈性。HA是由滑膜成纖維細(xì)胞和B型滑膜細(xì)胞分泌的一種天然潤滑劑，因而被廣泛用于OA的治療。HA也是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和大部分結(jié)締組織、上皮細(xì)胞和神經(jīng)組織的主要成分，是一種由D-葡糖醛酸和N-乙?；?D-葡糖酰胺構(gòu)成的非硫酸化二糖重復(fù)單元經(jīng)β-1,4和β-1,3配糖鍵交互連接而成的帶負(fù)電的線性多聚糖。天然HA的分子量約為1×106

Da，在滑液中的濃度約為4mg·mL–1，這一濃度在患OA后明顯下降?，F(xiàn)今，由一些國家食品和藥物管理局批準(zhǔn)的可注射的多種HA黏彈性產(chǎn)品已經(jīng)面市(表1)，如Hyalgan、Synvisc和Supartz，同時還有其他生物性狀、分子量、生產(chǎn)程序和注射方案不同的相關(guān)產(chǎn)品誕生。近期的隨機(jī)對照試驗對比了關(guān)節(jié)內(nèi)注射HA、安慰劑和皮質(zhì)類固醇在OA治療中的有效性，治療8周后，關(guān)節(jié)內(nèi)注射HA的患者，其膝關(guān)節(jié)OA疼痛和關(guān)節(jié)功能改善方面較關(guān)節(jié)內(nèi)注射安慰劑或皮質(zhì)類固醇者更為有效。表1

食品和藥物管理局批準(zhǔn)的可注射透明質(zhì)酸黏彈性產(chǎn)品

三、軟骨損害與治療方法（一）軟骨損害的發(fā)生機(jī)制膝關(guān)節(jié)OA表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性病變，這一過程涉及關(guān)節(jié)軟骨損害、軟骨下骨增厚、骨贅形成與繼發(fā)性滑膜炎。關(guān)節(jié)軟骨是一種富含II型膠原蛋白、糖胺聚糖(如HA)和蛋白聚糖(如聚集蛋白聚糖)的無血管組織，分為3個區(qū)域。這3個區(qū)域在細(xì)胞形態(tài)和II型膠原蛋白纖維排列方面有所不同，且在控制關(guān)節(jié)機(jī)械性能方面有重要作用。關(guān)節(jié)軟骨的退變始于關(guān)節(jié)表面的纖維化和基質(zhì)大分子框架的破裂。關(guān)節(jié)軟骨淺層和中層表面下的膠原蛋白纖維開始排列紊亂、蛋白多糖含量下降。隨著疾病的進(jìn)展，纖維化蔓延至關(guān)節(jié)軟骨下層(深層)，達(dá)到軟骨下骨；纖維化的軟骨逐漸在其表面尖端開始撕裂，形成較多與表面垂直的裂隙。聚集蛋白聚糖隨其核心蛋白的截斷，發(fā)生快速、廣泛的退變。核心蛋白裂成碎片，一些仍與HA結(jié)合，保留在組織中；而另一些則散落至關(guān)節(jié)滑液中，從而導(dǎo)致聚集蛋白聚糖中存在的凈陰離子電荷減少，關(guān)節(jié)軟骨的抗壓力喪失，軟骨受到侵蝕。聚集蛋白聚糖裂解存在個體差異，且在靠近軟骨侵蝕部位裂解程度最高。隨著聚集蛋白聚糖含量的下降，膠原蛋白成分由II型轉(zhuǎn)變成I型，這種變化嚴(yán)重影響了骨組織的機(jī)械穩(wěn)定性，因為II型膠原蛋白中羥賴氨酸、葡糖殘基和半乳糖殘基含量較高，有利于其與聚集蛋白聚糖相互作用?；|(zhì)退變由失衡的基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)物介導(dǎo)，包括可消溶軟骨基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和蛋白聚糖酶。主要的基質(zhì)金屬蛋白酶包括基質(zhì)溶素-1(MMP3)和膠原蛋白酶-3(MMP13)，這種酶通過其前肽的蛋白水解移除被激活，之后在其短的球間結(jié)構(gòu)域和硫酸軟骨素(CS)富集結(jié)構(gòu)域切割聚集蛋白聚糖。蛋白聚糖酶4和蛋白聚糖酶5，以及蛋白聚糖酶家族的其他成員是使聚集蛋白聚糖核心蛋白裂解的降解酶。研究已證實，膠原蛋白酶能夠消化膠原蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)，從而使聚集蛋白聚糖含量下降。這些軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分的改變使關(guān)節(jié)表面纖維化，從而使骨組織的機(jī)械性能降低。ECM的改變是多種因子作用的結(jié)果，其中之一是由機(jī)械損害或組織破壞觸發(fā)的炎癥。軟骨組織中的細(xì)胞通過參與分解代謝活動響應(yīng)炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致ECM降解。促發(fā)OA分解代謝過程的因子包括：腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素15和各種相關(guān)的趨化因子。這些因子使基質(zhì)降解蛋白的表達(dá)明顯升高，包括軟骨細(xì)胞中的MMP和蛋白聚糖酶?；|(zhì)破壞(由于蛋白聚糖損失)導(dǎo)致表面的孔隙度和通透率增加，引起組織間隙液的外流增多，最終導(dǎo)致組織退變和功能喪失。了解軟骨退變機(jī)制有助于開發(fā)修復(fù)受損軟骨組織的潛在治療方法。（二）軟骨損害的治療方法軟骨修復(fù)的方法包括非手術(shù)法和手術(shù)法。非手術(shù)法已在2.2節(jié)中討論，其可緩解OA患者的早期癥狀，但無法重建組織的解剖形態(tài)和使損害恢復(fù)。手術(shù)方法旨在重建組織的結(jié)構(gòu)和功能，達(dá)到修復(fù)損害軟骨組織的目的。這些方法包括關(guān)節(jié)鏡檢查、軟骨下骨鉆孔術(shù)、軟骨磨損關(guān)節(jié)成形術(shù)和微裂手術(shù)，目的在于利用來源于軟骨下骨的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)促進(jìn)軟骨再生。這些方法的主要局限性在于纖維軟骨的形成，因軟骨吸收沖擊的能力較差，原始軟骨組織的功能會被損害。其他手術(shù)治療方法包括自體軟骨鑲嵌成形術(shù)和自體軟骨移植，這種方法通過獲取自體組織或細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損。自體軟骨細(xì)胞移植(ACI)是一項十分常用的治療手段，其可在修復(fù)部位填充大量的透明組織。在第一代ACI中，軟骨細(xì)胞來源于健康軟骨的活檢組織，然后進(jìn)行體外擴(kuò)增，并于活檢后的6周~18個月注射到患者體內(nèi)。為了防止缺損部位軟骨細(xì)胞泄漏，手術(shù)時將骨膜補(bǔ)片縫在或粘在手術(shù)區(qū)域，以覆蓋并密封該區(qū)域。為了減少骨膜補(bǔ)片帶來的并發(fā)癥、降低手術(shù)難度，發(fā)展了第二代ACI，也就是基質(zhì)輔助的自體軟骨細(xì)胞移植(MACI)。MACI所用組織工程材料為種植了自體軟骨細(xì)胞的膠原蛋白或基于HA的基質(zhì)，手術(shù)時，將其插入缺損部位，并用纖維蛋白膠固定。臨床結(jié)果顯示，MACI治療軟骨缺損的穩(wěn)定性好，且手術(shù)的失敗率低。ACI存在的主要問題是供體區(qū)病變、軟骨細(xì)胞分布不均和軟骨細(xì)胞丟失。同種異體移植作為自體移植的替代方法，存在軟骨缺損邊緣與供體移植物之間的整合問題，易導(dǎo)致移植失敗。這些治療方法均存在一個主要問題，那就是移植細(xì)胞的數(shù)量以及修復(fù)的組織的數(shù)量和質(zhì)量不足，這個問題使得長期修復(fù)效果不佳。根據(jù)現(xiàn)有的臨床試驗結(jié)果，我們認(rèn)為結(jié)合生物材料的細(xì)胞治療方法可以作為關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的替代療法。修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨非常具有挑戰(zhàn)性，因其具有無血管和無神經(jīng)的性質(zhì)以及稀疏的細(xì)胞群體。因此，選擇合適的細(xì)胞來源非常關(guān)鍵。為此，研究者們已經(jīng)對多種來源的細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，如軟骨細(xì)胞和骨髓、脂肪和滑膜來源的MSC，以確定最佳的細(xì)胞來源。這些來源的細(xì)胞易分離和擴(kuò)增，并且可以表達(dá)和合成具有或不具有生物材料支架的軟骨特異性分子(如II型膠原蛋白和軟骨聚集蛋白聚糖)，成功用于軟骨修復(fù)。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)和技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)步，再生醫(yī)學(xué)的研究焦點已經(jīng)轉(zhuǎn)向使用生物材料的軟骨再生。多種生物材料(包括天然和合成生物材料)已被用于遞送細(xì)胞和其他信號分子，以有效地促進(jìn)軟骨組織再生。多種生物材料，如水凝膠、海綿/泡沫、纖維基質(zhì)和層狀結(jié)構(gòu)，已被用于制備多種支架。圖2為應(yīng)用細(xì)胞–生物材料方法修復(fù)軟骨損害。圖2.應(yīng)用細(xì)胞–生物材料方法修復(fù)軟骨損害。

1.水凝膠水凝膠是高含水量的3D聚合物網(wǎng)絡(luò)，可模擬天然ECM含水量。水凝膠通過物理或化學(xué)交聯(lián)的方法形成，并且是控釋細(xì)胞和生物活性分子至靶位點的有前景的遞送載體。交聯(lián)的類型和程度影響水凝膠的重要性質(zhì)，如溶脹性質(zhì)和彈性模量。水凝膠也可以以注射的形式使用，它可以很容易地填充任何尺寸和形狀的軟骨缺損，并且可以以微創(chuàng)的方式植入。多種合成和天然的生物材料已被測試并用于促進(jìn)軟骨再生的水凝膠的開發(fā)。聚乙二醇(PEG)相對具有惰性和生物相容性，因而成為制備水凝膠的最常用的合成生物材料之一。然而，PEG不支持軟骨特異性基質(zhì)產(chǎn)生，且其在促進(jìn)軟骨形成方面達(dá)不到其他天然材料(如HA)的效果。因此，將HA摻入PEG水凝膠的方法已被證實可改善PEG水凝膠的生物活性。作為一種天然多肽，聚-L-賴氨酸(PLL)可刺激MSC早期分化為軟骨細(xì)胞，因而已被用于促進(jìn)軟骨再生。PLL在體外可促進(jìn)間充質(zhì)凝集，從而模擬軟骨發(fā)育過程。將PLL整合至基于寡聚(PEG富馬酸酯)(OPF)的水凝膠中，可用于評估軟骨再生的發(fā)育–生物學(xué)干預(yù)手段的有效性。這些水凝膠使II型膠原蛋白和軟骨聚集蛋白聚糖基因以及凝集標(biāo)記物N-鈣黏蛋白基因在微囊化MSC中的表達(dá)早期上調(diào)。研究表明，陽離子聚合物PLL誘導(dǎo)早期軟骨形成標(biāo)志物的表達(dá)，從而復(fù)制軟骨發(fā)育的凝集階段。海藻酸鹽水凝膠也已被用于促進(jìn)軟骨再生、軟骨ECM的合成及軟骨形成。存在于藻酸鹽化學(xué)結(jié)構(gòu)上的負(fù)電荷誘導(dǎo)新合成的軟骨聚集蛋白聚糖分子的保留特性。然而，這些材料的局限性在于機(jī)械穩(wěn)定性差、降解速度慢和細(xì)胞黏附性差。為了克服細(xì)胞黏附性差這一問題，研究者將精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸(RGD)肽序列(細(xì)胞黏附基序)固定在海藻酸鹽支架中。RGD固定證實了局灶性細(xì)胞黏附的形成，因此改善了細(xì)胞黏附。膠原蛋白是軟骨基質(zhì)的重要組成部分；因此，有研究報道了膠原蛋白水凝膠對軟骨再生的支持作用。膠原蛋白水凝膠在體外培養(yǎng)時會收縮，這為軟骨細(xì)胞聚集和成軟骨分化的開始提供了有利條件，該過程類似于胚胎軟骨形成的過程。CS是軟骨基質(zhì)的另一個重要組分，因此已被廣泛用于促進(jìn)軟骨再生。由于CS的機(jī)械性能差，已有研究者嘗試通過結(jié)合另一種材料如PEG，來開發(fā)復(fù)合材料。使用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)修飾CS可以產(chǎn)生與形成化學(xué)交聯(lián)的水凝膠的6個PEG-胺臂反應(yīng)的CS-NHS大分子單體。改變PEG-胺前體的pH可使CS-PEG水凝膠的機(jī)械、溶脹和凝膠化性能更佳。降低pH會使凝膠時間、硬度和交聯(lián)度增加，溶脹度降低。此外，通過評估CS-PEG水凝膠的黏合強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)其與纖維蛋白膠(臨床常用的黏合劑)的黏合強(qiáng)度相當(dāng)，這是由于其具有與ECM中含有伯胺基團(tuán)的生物分子形成共價交聯(lián)的能力。因為軟骨基質(zhì)中富含HA，因而HA水凝膠常被用于促進(jìn)軟骨再生。其官能團(tuán)–OH和–COOH的豐度允許其化學(xué)修飾和共價交聯(lián)。如2.2節(jié)所述，HA被廣泛用于OA的黏彈性補(bǔ)充治療。具有高分子量的HA可產(chǎn)生高黏度溶液，但僅在短時間內(nèi)保留在受損區(qū)域中。延長HA的體內(nèi)存留時間、改善其機(jī)械性能的最常見方法是對其進(jìn)行化學(xué)修飾。水凝膠的機(jī)械和物理性能極大地取決于交聯(lián)密度。已有研究應(yīng)用不同的官能團(tuán)對HA進(jìn)行化學(xué)功能化(圖3)，從而實現(xiàn)在不用細(xì)胞毒性交聯(lián)劑的情況下形成水凝膠。HA的共價交聯(lián)可以通過應(yīng)用–COOH和–OH官能團(tuán)，經(jīng)酯鍵和醚鍵連接而實現(xiàn)(圖3)。例如，在碳二亞胺/1–羥基–苯并三唑(HOBt)存在的情況下，使用過量的己二酸二酰肼(ADH)合成二酰肼改性的HA(HA-ADH)；通過高碘酸鈉介導(dǎo)的氧化反應(yīng)制備醛基修飾的HA(HA-CHO)。HA水凝膠的物理和機(jī)械性能(凝膠化時間、黏度、彈性模量和交聯(lián)密度)可以通過改變進(jìn)料混合物中HA-ADH和HA-CHO的比例來調(diào)節(jié)。HA-ADH與HA-CHO之間的反應(yīng)導(dǎo)致腙鍵(C1=N1–N2H–(C=O)N3H)的形成，其在生理條件下不太穩(wěn)定，易被溶酶體酶迅速切除。Oommen等設(shè)計了由HA-碳二酰肼(HA-CDH)和HA-醛組成的更穩(wěn)定的HA系統(tǒng)，由此形成的腙鍵由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中正電荷的非定域而穩(wěn)定且不可逆。HA-CDH水凝膠在酸性條件下的穩(wěn)定性是HA-ADH的15倍，兩者的儲能模量(G′)分別為1196Pa和297Pa。此外，高碘酸鹽介導(dǎo)的氧化反應(yīng)影響HA的生物學(xué)功能(缺乏細(xì)胞識別)，限制了其應(yīng)用。為了保持HA的天然結(jié)構(gòu)，Wang等設(shè)計了在溫和條件下將醛基部分接枝到HA上的合成途徑?；蛘?，可以使用雙官能親電試劑如PEG二丙烯酸酯，通過硫醇–邁克爾加成反應(yīng)制備HA水凝膠，該反應(yīng)可以在生理條件下進(jìn)行；其凝膠動力強(qiáng)，且可在無催化劑的情況下進(jìn)行?；诹虼挤磻?yīng)的另一項研究應(yīng)用巰基化的HA與PEG乙烯基砜，在可調(diào)節(jié)降解速率和凝膠化時間的生理條件下，形成3D水凝膠網(wǎng)絡(luò)。這里，通過增加聚合物濃度[從0.02(w/v)到0.06(w/v)]和HA分子量(從45kDa到185kDa)，使凝膠化時間從14min降低到小于1min。水凝膠的生物降解和機(jī)械強(qiáng)度取決于HA和PEG的分子量、聚合物濃度和巰基化HA的功能化程度。用于調(diào)節(jié)HA的化學(xué)和機(jī)械性能的另一種合成途徑是應(yīng)用丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯基部分修飾HA的化學(xué)結(jié)構(gòu)。甲基丙烯酸酯-HA水凝膠可以通過光交聯(lián)將甲基丙烯酸酯基團(tuán)連接到HA鏈，隨后經(jīng)暴露于紫外線(UV)輻射下的自由基聚合而獲得。Leach等描述了HA和甲基丙烯酸縮水甘油酯之間的酯基轉(zhuǎn)移作用。一系列甲基丙烯酸縮水甘油酯-HA(GMHA)共軛物產(chǎn)出具有不同和可控性質(zhì)的GMHA水凝膠。高官能度的共軛物使水凝膠的交聯(lián)密度增高，降解速率降低。圖3.透明質(zhì)酸的化學(xué)改性。使用強(qiáng)化的水凝膠如填充材料或纖維的復(fù)合方法有望改善水凝膠的機(jī)械性能。因此，隨著強(qiáng)化填充材料如纖維素或其他性質(zhì)的纖維的使用，這些方法可用于改善水凝膠的機(jī)械性能。研究人員試圖應(yīng)用封裝于纖維蛋白水凝膠中且接種了人脂肪干細(xì)胞的3D編織聚己內(nèi)酯(PCL)纖維增強(qiáng)復(fù)合支架材料，復(fù)制天然軟骨組織的復(fù)雜機(jī)械性能，該支架具備的功能性組織工程結(jié)構(gòu)與天然軟骨組織具有類似的生物力學(xué)特性。上述水凝膠缺乏類似于天然軟骨組織的區(qū)帶組織。因此，新的策略正在被開發(fā)以復(fù)制區(qū)帶組織的天然關(guān)節(jié)軟骨樣組織，以此來控制天然軟骨的機(jī)械性能。一種包含CS和MMP-敏感型肽(表層，PEG∶CS∶MMP-pep)的頂層、包含CS(過度層，PEG∶CS)的中間層和包含HA的底層(深層，PEG∶HA)的三層基于PEG的水凝膠已被開發(fā)。這種分層的水凝膠可以促進(jìn)區(qū)域特異性軟骨形成和發(fā)展為具有空間變化的機(jī)械和生化特性的軟骨樣組織。雖然已經(jīng)開發(fā)了多種新技術(shù)用于增加水凝膠的機(jī)械性能，但是水凝膠仍然缺乏分層組織，使其成為與宿主組織有不同機(jī)械性能的各向同性組織。2.海綿/泡沫海綿為多孔支架，其性質(zhì)受孔徑、孔隙率和互連性影響。孔徑是組織再生的重要因素；因此，控制孔結(jié)構(gòu)非常重要。迄今為止，已經(jīng)有各種方法被用于制備海綿，包括致孔劑浸出、冷凍干燥和用于軟骨再生的氣體發(fā)泡。已有研究制備了可使免疫反應(yīng)最小化的純化藻酸鹽海綿，其可支持軟骨形成。使用微流體裝置制備多孔藻酸鹽支架，可在凝膠化時產(chǎn)生藻酸鹽液滴，并形成高度組織的多孔支架。該支架維持了軟骨細(xì)胞表型，并促進(jìn)了軟骨樣組織在小鼠背部皮下的形成。另一項研究使用以冰顆粒(150~250μm、250~355μm、355~425μm和425~500μm)作為致孔劑開發(fā)的具有梯度孔的多孔膠原蛋白支架，以研究該支架孔徑對軟骨再生的影響。該支架具有緊密填充的球形孔和良好的孔互連性，不同孔徑的支架都具有98％孔隙度。該研究將構(gòu)建體皮下植入6周齡小鼠的背部，結(jié)果表明，150~250μm孔徑的支架促進(jìn)了II型膠原蛋白和軟骨聚集蛋白聚糖的最高表達(dá)；并且與具有不同孔徑的支架相比，其促進(jìn)了機(jī)械性能更好的軟骨樣組織的形成。由于在150~250μm孔徑的膠原蛋白支架中軟骨形成基因的活性較高，該系統(tǒng)被用于遞送胰島素。裝載含胰島素的聚(乳酸–乙醇酸共聚物)(PLGA)微粒的多孔支架可持續(xù)釋放胰島素，支持軟骨細(xì)胞的存活和增殖。已經(jīng)用作軟骨再生的其他多孔支架材料包括絲纖維、明膠、殼聚糖和HA。然而，這些支架缺乏與天然軟骨組織組成和性質(zhì)相似的區(qū)帶組織。因此，最近的研究重點是開發(fā)具有不同的機(jī)械性能和功能的、類似于天然軟骨的多層3D支架。多層多孔支架通過堆疊與不同濃度的II型膠原蛋白混合的殼聚糖和PCL共聚物開發(fā)而成。為了復(fù)制軟骨組織層狀結(jié)構(gòu)中的膠原蛋白成分，支架中的II型膠原蛋白含量從頂層到底層逐層減少。研究表明，這些支架在成分、多孔結(jié)構(gòu)、含水量和壓縮機(jī)械性能方面與天然軟骨類似，從而證實了其在軟骨組織工程中應(yīng)用的可行性。另一項研究應(yīng)用殼聚糖和CS，以逐層技術(shù)結(jié)合模板浸出，開發(fā)了具有多層3D構(gòu)造的聚合電解質(zhì)復(fù)合物，該構(gòu)建體具有可控的孔徑，吸水能力高達(dá)300%，具有黏彈性，且支持MSC的軟骨分化。有研究應(yīng)用沉積在顆粒浸出泡沫上的電紡PCL纖維模擬天然軟骨的區(qū)帶組織。雙層3D支架包含上部定向纖維區(qū)域，以模擬關(guān)節(jié)軟骨的表層形態(tài)，而本體多孔顆粒模板支架允許細(xì)胞浸潤和廣泛的ECM沉積。定向纖維的摻入也增強(qiáng)了拉伸性能，多孔區(qū)域促進(jìn)了接種軟骨細(xì)胞的浸潤，從而使其增殖率和糖胺聚糖的產(chǎn)出率升高。合成聚合物通常缺乏誘導(dǎo)軟骨形成的生化誘因，但其應(yīng)用使雙層支架顯示出良好的機(jī)械性能。然而，這些支架的區(qū)帶組織仍不能與天然軟骨完全相同。3.纖維網(wǎng)/支架纖維網(wǎng)是具有多種纖維直徑和空隙體積的非編織和編織的網(wǎng)絡(luò)，能夠影響細(xì)胞行為。將纖維支架用于軟骨再生研究的原因在于：它具有可以使機(jī)械強(qiáng)度增加的高孔隙率和互連孔，但這種材料不能填充不規(guī)則缺損。微米級和納米級纖維通常被用于模擬天然軟骨組織的ECM組分。許多研究已嘗試開發(fā)具有仿生機(jī)械性能、且在植入后可維持生理負(fù)荷能力的3D纖維支架。研究者開發(fā)了由均質(zhì)軟骨來源的基質(zhì)浸潤的3D編織PCL支架，并用來源于人體脂肪的干細(xì)胞培養(yǎng)42d。這些編織支架有利于ECM積聚，且維持了軟骨再生所需的機(jī)械性能。電紡支架也被用于軟骨再生的研究。靜電紡絲產(chǎn)生的納米級纖維具有作為軟骨ECM模擬基質(zhì)的巨大潛力。盡管納米級纖維具有ECM模擬基質(zhì)特性，但由于它的孔網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)格閉合，使細(xì)胞浸潤受到限制。因此，為了克服這些限制，研究者開發(fā)了具有可變孔徑的纖維(微纖維和納米纖維)的支架。具有微纖維和納米纖維兩種不同孔徑的電紡支架已被研究，它由兩種不同材料(特別是纖維蛋白和PCL)組成。納米纖維被整合至微纖維網(wǎng)，以被均勻地分布在整個支架結(jié)構(gòu)中。與僅由微纖維構(gòu)成的支架相比，該支架中的納米纖維和微纖維促進(jìn)了細(xì)胞增殖和GAG沉積，這種結(jié)果產(chǎn)生的原因在于由微纖維和納米纖維共同維持的大孔徑以及納米纖維與天然ECM的組分十分相似，從而改善了細(xì)胞反應(yīng)(分化和ECM的生產(chǎn))。最近，以復(fù)制區(qū)域特定的組織和軟骨性質(zhì)為目標(biāo)的軟骨組織工程支架研究也取得了新進(jìn)展。通過應(yīng)用連續(xù)靜電紡絲技術(shù)，開發(fā)了三層基于PCL的支架，其纖維尺寸和方向在連續(xù)構(gòu)建體中有所變化。三層復(fù)合支架顯示出的機(jī)械性能與天然軟骨組織類似，且支持體外軟骨的形成。纖維網(wǎng)用于軟骨再生的主要局限性在于：①靜電紡絲制成的2D網(wǎng)使軟骨細(xì)胞變平，從而形成纖維軟骨樣組織；②納米纖維電紡支架具有高剛度，導(dǎo)致工程化構(gòu)建體與宿主組織之間的機(jī)械性能不匹配。由于膠原蛋白纖維可控制軟骨組織的機(jī)械行為，已有研究者將其以3D對齊模式加以編織，以產(chǎn)生大孔徑；并將MSC接種于這些大孔內(nèi)，以促進(jìn)間充質(zhì)濃縮形成軟骨。纖維支架的骨架支持軟骨形成和機(jī)械穩(wěn)定性，因此具有促進(jìn)軟骨再生的重大潛力。纖維支架已顯示出了作為軟骨ECM模擬物的潛力;然而，仍需對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)，以復(fù)制天然軟骨組織的結(jié)構(gòu)–功能特性。四、骨性關(guān)節(jié)炎的微創(chuàng)細(xì)胞療法限制軟骨再生的外科治療的主要因素是嚴(yán)重的術(shù)后感染和較長的住院時間。為了克服這些局限性，研究人員已經(jīng)開始探索OA的微創(chuàng)治療方法。干細(xì)胞治療是治療OA的一種新方法，其中干細(xì)胞由不同組織(如骨髓、脂肪組織和滑膜)中分離，并在體外擴(kuò)增，然后輸回到患者體內(nèi)。MSC是一種用于軟骨損傷后修復(fù)的有應(yīng)用前景的細(xì)胞來源，原因在于其易于體外擴(kuò)增，有多向電位和免疫抑制特性，可促血管發(fā)生、抗纖維化、抗細(xì)胞凋亡和促進(jìn)傷口愈合。MSC的免疫抑制特性有利于減輕促炎反應(yīng)，從而促進(jìn)組織修復(fù)。在各種MSC來源中，來源于骨髓的MSC(BMSC)已被廣泛用于軟骨再生。關(guān)節(jié)內(nèi)注射BMSC至存在前交叉韌帶(ACL)、內(nèi)側(cè)半月板和股骨髁軟骨等多重組織損傷的大鼠關(guān)節(jié)中的結(jié)果顯示，BMSC遷移到受損部位，細(xì)胞周圍發(fā)生ECM合成的組織再生。此外，有研究報道，與注射1×106個MSC相比，注射更多的MSC(1×107個細(xì)胞)可使其更有效地遷移至受損組織。然而，注射1×107個細(xì)胞會導(dǎo)致瘢痕組織的形成，這是應(yīng)用更多MSC的不良反應(yīng)，也是引起關(guān)節(jié)功能障礙的原因。因此，有必要優(yōu)化移植細(xì)胞的數(shù)量。此外，適當(dāng)?shù)膫鬟f系統(tǒng)的應(yīng)用可能有助于制定更好的MSC微創(chuàng)治療OA的策略。在另一項研究中，培養(yǎng)于組分為Ham’sF12/DMEM(FD比例為1﹕1)、1%胎牛血清(FBS)和5ng·mL–1轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGF-β3)、50ng·mL–1胰島素生長因子-1(IGF-1)的軟骨形成培養(yǎng)基(CM)或培養(yǎng)于含F(xiàn)D和10%FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BM)中的自體BMSC，以2×106個細(xì)胞的數(shù)量單次注射于OA綿羊模型關(guān)節(jié)內(nèi)。通過內(nèi)側(cè)半月板全切除術(shù)和ACL切除術(shù)建立OA綿羊模型。注射后6周，與對照組相比，在CM和BM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的BMSC的關(guān)節(jié)內(nèi)注射可減輕OA膝關(guān)節(jié)中的軟骨破壞和延緩OA進(jìn)展。對照組損傷評分最高，為(3.44±0.38)分；其次為BM組，為(1.22±0.89)分；CM組損傷評分最低，為(0.8±0.35)分，且病變程度淺、邊緣平滑。研究表明，CM組在軟骨組織結(jié)構(gòu)、厚度和質(zhì)量，以及半月板修復(fù)方面均優(yōu)于BM組和對照組，從而證明了關(guān)節(jié)內(nèi)注射BMSC在微創(chuàng)治療OA中的潛力。在一些有價值的臨床前研究的基礎(chǔ)上，多個臨床試驗已于最近完成，進(jìn)一步驗證了關(guān)節(jié)內(nèi)注射BMSC的臨床應(yīng)用潛力。完成了一項將MSC直接注射至膝關(guān)節(jié)的臨床試驗。該試驗先將MSC懸浮于PBS中，然后將其注射到患有退行性O(shè)A的患者膝關(guān)節(jié)中。在第2周給患者第2次注射1mL10ng·mL–1(促進(jìn)軟骨形成的小劑量)的地塞米松。3個月和6個月的隨訪結(jié)果顯示，OA患者的軟骨體積增加(高達(dá)28.64％)，疼痛減輕。這項研究的局限性在于只有1例病例，且無長期隨訪結(jié)果。另一項開展的研究納入了更大樣本量的患者人群，并對BMSC注射治療的有效性進(jìn)行了長達(dá)(10.6±7.3)個月的隨訪。結(jié)果顯示，BMSC注射后，在膝關(guān)節(jié)中未發(fā)現(xiàn)腫瘤形成或其他并發(fā)癥。為了進(jìn)一步研究關(guān)節(jié)內(nèi)注射BMSC的安全性，在向4例中重度OA患者膝關(guān)節(jié)注射了2×107~2.4×107個BMSC后，進(jìn)行了6個月的隨訪；在向6例OA患者進(jìn)行膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射8×106~9×106個BMSC后，進(jìn)行了1年的隨訪。研究結(jié)果顯示，注射BMSC后的6個月，患者疼痛明顯減輕，行走能力明顯改善。然而，這些改善在注射后的6個月后有所下降，表明這些患者還需要進(jìn)行第2次注射。觀察到了有關(guān)關(guān)節(jié)內(nèi)注射的更有價值的結(jié)果。他們使用了比以前的研究中使用的更多數(shù)量的自體BMSC(4×107個)治療12例保守治療無效的慢性膝關(guān)節(jié)疼痛患者。隨訪1年發(fā)現(xiàn)，患者疼痛明顯減輕，軟骨體積迅速、逐步增加。在一項I/II期臨床試驗中，給予15例膝關(guān)節(jié)OA患者單劑量關(guān)節(jié)內(nèi)注射4.09×107±0.04×107個自體BMSC。在注射8天后，疼痛強(qiáng)度相對降低，且該效果保持至12個月后。在12個月后，患者身體和生理功能也有所改善，且有軟骨再生現(xiàn)象。這些研究為BMSC在治療膝關(guān)節(jié)OA中的顯著潛力提供了臨床證據(jù)。然而，這些研究中實施方案和細(xì)胞數(shù)量的差異表明，利用BMSC治療膝關(guān)節(jié)OA的最佳方案仍需進(jìn)一步明確。與BMSC不同，來源于脂肪組織的MSC(ADSC)可以微創(chuàng)的方式分離，且可獲得的細(xì)胞數(shù)量更多。在OA的動物模型中進(jìn)行的ABSC關(guān)節(jié)內(nèi)注射取得了振奮人心的結(jié)果。研究了向膠原蛋白酶誘導(dǎo)的OA小鼠模型關(guān)節(jié)內(nèi)注射ADSC的抗炎和軟骨保護(hù)作用。ADSC抑制關(guān)節(jié)滑膜襯里增厚和軟骨破壞，并保護(hù)其免受合成和分解代謝介質(zhì)的聯(lián)合破壞。有些研究者在兔OA模型中進(jìn)行了類似研究，該研究向動物模型關(guān)節(jié)內(nèi)注射1×106個ADSC。研究結(jié)果表明，動物對ADSC關(guān)節(jié)內(nèi)注射的耐受度較高，且該注射在減輕OA的臨床癥狀的同時，未引起免疫反應(yīng)，這可能是由于ADSC的抗炎特性和低免疫原性。此外，關(guān)節(jié)內(nèi)注射ADSC治療可在不到3個月的時間內(nèi)改善患有髖關(guān)節(jié)OA的狗的肢體功能。ADSC作為替代細(xì)胞來源，已被用于臨床研究。將4.04×106個ADSC注射于30例老年患者的膝關(guān)節(jié)內(nèi)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADSC注射可促進(jìn)損害軟骨的恢復(fù)、減輕疼痛、改善功能；同時ADSC注射還是一種簡單、性價比高的方法，因為