慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座

慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第1頁(yè)2慢病毒載體概況HIV-1基因結(jié)構(gòu)慢病毒載體歷史與構(gòu)建重組慢病毒產(chǎn)生慢病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中應(yīng)用慢病毒在造血干細(xì)胞系統(tǒng)中應(yīng)用慢病毒在眼科疾病治療中應(yīng)用慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第2頁(yè)31.慢病毒載體概況慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒科亞科之一，分為靈長(zhǎng)類和非靈長(zhǎng)類慢病毒。靈長(zhǎng)類慢病毒包含HIV-1，HIV-2，猴免疫缺點(diǎn)病毒（SIV），非靈長(zhǎng)類慢病毒包含貓免疫缺點(diǎn)病毒（FIV），牛免疫缺點(diǎn)病毒（BIV），馬免疫缺點(diǎn)病毒（EIAV）等，其中HIV研究最為透徹。研究表明慢病毒核蛋白質(zhì)前整合復(fù)合物含有噬核特征，病毒基因組運(yùn)輸至細(xì)胞核，從而使慢病毒能夠感染和在非有絲分裂細(xì)胞中復(fù)制。這一特征是慢病毒成為基因治療轉(zhuǎn)移載體。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第3頁(yè)42.HIV-1基因結(jié)構(gòu)HIV-1為雙鏈RNA病毒，共有9個(gè)基因。

gag基因編碼病毒關(guān)鍵蛋白，包含基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白、核衣殼蛋白。pol基因編碼病毒復(fù)制所需酶，如反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶。env基因編碼病毒包膜糖蛋白，決定病毒感染宿主靶向性。rev編碼蛋白調(diào)整gag、pol、env表示水平。tat編碼蛋白參加RNA轉(zhuǎn)錄控制。4個(gè)輔助基因vif、vpr、vpu、nef編碼蛋白則作為毒力因子參加宿主細(xì)胞識(shí)別和感染。兩端為長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)，內(nèi)含復(fù)制所需順式作用元件。編碼病毒基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)調(diào)整基因慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第4頁(yè)53.慢病毒載體歷史與構(gòu)建3.1第一代HIV-1起源慢病毒載體以Naldini及Kafri構(gòu)建三質(zhì)粒系統(tǒng)為代表，該系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及載體質(zhì)粒3種質(zhì)粒組成。包裝質(zhì)粒是HIV-1前病毒基因組5’端LTR由巨細(xì)胞病毒早期開(kāi)啟子取代，3’LTR由SV40polyA序列取代。包裝成份分別構(gòu)建在兩個(gè)質(zhì)粒上，一個(gè)表示gag和pol，另一個(gè)表示env。載體質(zhì)粒攜帶了5’端LTR，和全部5’端非翻譯區(qū)域，另外還帶有rev應(yīng)答元件（RRE）。包膜表示質(zhì)粒使用水皰性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用來(lái)代替了原病毒env基因。

慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第5頁(yè)63.2第二代HIV-1起源慢病毒載體

1997年,Zufferey等將包裝質(zhì)粒上vif、vpr、vpu和nef基因(即輔助基因)敲除,從而得到,其它方面與第一代載體系統(tǒng)一致。

慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第6頁(yè)73.3第三代HIV-1起源慢病毒載體為降低復(fù)制型病毒產(chǎn)生，可經(jīng)過(guò)降低輔助質(zhì)粒與載體質(zhì)粒同源性，或者將gag/pol和rev編碼序列隔離,分散在不一樣質(zhì)粒上。這么包裝系統(tǒng)由四質(zhì)粒代替原有三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)。質(zhì)粒一攜帶了gag/pol編碼序列及RRE;

質(zhì)粒二包含了編碼rev序列;

質(zhì)粒三是載體質(zhì)粒;

質(zhì)粒四表示env。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第7頁(yè)83.4本身失活型（SIN）慢病毒載體

SIN載體構(gòu)建是在原病毒載體基礎(chǔ)上刪除了病毒3’端LTRU3區(qū)增強(qiáng)子和開(kāi)啟子序列片段。該區(qū)域出現(xiàn)突變則在HIV-1載體轉(zhuǎn)錄后，其5’LTR會(huì)因?yàn)槿笔IV-1所需要開(kāi)啟子和增強(qiáng)子序列而無(wú)法復(fù)制出完整長(zhǎng)度病毒基因組。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第8頁(yè)94.重組慢病毒產(chǎn)生

常見(jiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，即將包膜質(zhì)粒，包裝質(zhì)粒和載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞直接產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞。最終慢病毒分泌到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)而得到大量載體慢病毒。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第9頁(yè)10慢病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中應(yīng)用慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第10頁(yè)111.IntroductionRecombinantviralvectorshavebeenusedtostudyavarietyoffundamentalissuesindevelopmentalneurobiology,aswellaspathogenesisandtreatmentsforvariousneurodegenerativediseases.Lentiviralvectorsarevaluabletoolsforneurobiologyresearchowingtotheirabilitytotransducenondividingcells,suchasneurons,andtointroducetherapeuticorreportergenesintocentralnervoussystem(CNS)cellsinvivoandinvitro.

重組病毒載體已被用于研究各種發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)中基礎(chǔ)問(wèn)題，以及各種神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)理和治療。慢病毒載體能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，如神經(jīng)元，并介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）細(xì)胞在體內(nèi)和體外基因治療或報(bào)道基因而作為神經(jīng)生物學(xué)研究有價(jià)值工具。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第11頁(yè)121.1.LentiviralGeneDeliverytoCNSCellsLentiviruspreintegrationcomplexesinteractwiththenuclearporeandundergoactivetransportintothenucleusofnondividingcells,wheretheproviralDNAisintegratedintothegenomicDNAofthehostcell.Thisfeatureistheprimaryreasonwhylentivirusesarebeingdevel-opedasgene-transfervectorsforpostmitoticcellsintheCNS.

慢病毒整合前復(fù)合物與核孔相互作用進(jìn)入細(xì)胞核分裂細(xì)胞，其中前病毒DNA整合到宿主細(xì)胞基因組DNA并進(jìn)行主動(dòng)運(yùn)輸。此功效是為何慢病毒在有絲分裂后細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)移載體主要原因。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第12頁(yè)13Self-inactivating(SIN)vectorsreducetheprobabilityofoncogenesisbypro-moterinsertion.InSINvectors,viralpromoteractivityisdeletedfromtheinte-gratedprovirusbydeletionsintheU3regionofthe3’longterminalrepeat(LTR)thatarecopiedduringreversetranscriptiontothe5’LTR.

本身失活型（SIN）慢病毒載體3’端LTRU3區(qū)開(kāi)啟子發(fā)生失活突變后，在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中轉(zhuǎn)移至5’LTR。這么載體整合入靶細(xì)胞，將不會(huì)產(chǎn)生完整長(zhǎng)度載體RNA，所以命名為“本身失活型載體”。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第13頁(yè)14Toincreasegenedeliveryinbrain,newergenerationsoflentiviralvectorsincorporatethecentralpoly-purinetract(cPPT),anapprox180bpregionderivedfromthegagregion,whichincreasesnuclearimportoftheproviralDNAandtransductionefficiencyinthebrain.

為了增加基因在腦中傳遞，新一代慢病毒載體包含cPPT，一個(gè)來(lái)自gag區(qū)約180

bp區(qū)域，從而增加了原病毒DNA進(jìn)入核，也提升了在大腦中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第14頁(yè)151.2.TargetedGeneDeliveryintheCNSUsingPseudotyped

LentiviralVectorsAnotherfeatureofthelentiviralvectorsystemisthatthevirionscancarryasurfaceproteinthatbypassestheusualHIVreceptorsandco-receptors,thuschangingorexpandingtherangeofcelltypesthatthevectorcanbindtoandenter.Thisisdonebypseudotyping,whichinvolvesreplacingtheHIV-1envelopeglycoproteinwithanenvelopeglycoproteinfromanothervirus,suchasthe

vesicularstomatitisvirusglycoprotein(VSV-G).

慢病毒載體系統(tǒng)另一個(gè)特征是攜帶病毒微粒表面蛋白，包含HIV受體和共受體，從而改變或擴(kuò)充細(xì)胞類型范圍，使得該載體能夠結(jié)合而且進(jìn)入。這個(gè)模型包括取代HIV-1包膜糖蛋白與另一個(gè)病毒包膜糖蛋白，如皰疹性口腔炎病毒糖蛋白（VSV-G）。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第15頁(yè)161.3.LentiviralVectorProductionThedevelopmentofstablepackagingcelllinesthatproducehightitersoflentiviralvectorshasbeenhinderedbythetoxicityofconstitutiveVSV-Gexpression.Forthisreason,manygroupscontinuetousetransienttripletransfectiontogeneratetheirvectorstocks.

產(chǎn)生高滴度慢病毒載體穩(wěn)定包裝細(xì)胞系發(fā)展受到VSV-G表示毒性妨礙。所以，大多數(shù)人使用三質(zhì)粒系統(tǒng)。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第16頁(yè)17Threeplasmidsarerequired:encodingtheenvelopeglycoprotein(mostcommonlyVSV-G),

encodingthepackagingproteins(minimallyincludinggagandpol,oftenincludingtatandrevonthesameplasmid,andinsomecasestheaccessorygenesvif,vpr,vpu,andnef),encodingthegenome(includingtheintactorself-inactivatingLTR’s,thepackagingsignal,thepromoterandcDNAofinterestand,insomecases,posttranslationalregulatoryelementsandthecentralpoly-purinetract(cPPT),whichincreasetiterandexpression.慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第17頁(yè)182.Materials

2.1.Transfection1.Ahighlytransfectablecelllinesuchashumanembryonickidney293T.2.Growthmediafor293Tcells.3.Poly-D-lysine.4.Boratebuffer.5.Reagentsforcalciumphosphatetransfection.慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第18頁(yè)196.High-qualityplasmidDNA:transferplasmid,packagingplasmid,envelopeplasmidpurifiedthroughcesiumchloride/ethidiumbromideequilibriumcentrifugationorananion-exchangematrix.7.Polybrene,800μg/mLstocksolutioninPBS.8.LargepolyallomercentrifugetubesforconcentratingthevectorinaBeckmanSW28ul-tracentrifugerotor.慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第19頁(yè)202.2.StereotacticSurgeryAnaesthesiamice.SurgicalPreparation.Drillingandinjection.Postoperativecare.Perfusion.AmanualforstereotaxicsurgerysuchasStereotaxicSurgeryintheRat.AmousebrainatlassuchasTheMouseBraininStereotaxicCoordinates.慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第20頁(yè)213.MethodsTransfection轉(zhuǎn)染CollectionandConcentrationoftheViralSupernatant

搜集和集中病毒上清TiteringLentiviralVectors

滴定慢病毒載體慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第21頁(yè)22慢病毒在造血干細(xì)胞系統(tǒng)中應(yīng)用慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第22頁(yè)23造血干細(xì)胞（HSC）含有自我更新和分化為血液及免疫系統(tǒng)中各種成熟細(xì)胞能力，許多HSC疾病如遺傳性、代謝性和感染性疾病或惡性腫瘤等有望經(jīng)過(guò)基因治療方法得到糾正。目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移HSC后，可伴隨HSC自我更新和分化在體內(nèi)長(zhǎng)久表示，所以HSC是較理想基因轉(zhuǎn)移靶細(xì)胞。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第23頁(yè)24研究表明，VSV-G假構(gòu)型HIV-I載體可不經(jīng)過(guò)對(duì)HSC預(yù)刺激就能有效地將基因轉(zhuǎn)移到人早期干細(xì)胞并能在重度聯(lián)合免疫缺點(diǎn)(SCID)鼠骨髓中穩(wěn)定地長(zhǎng)久表示，Miyoshi等構(gòu)建VSV-G假構(gòu)型HIV-I載體，以綠色熒光蛋白（GFP）作為標(biāo)識(shí)基因，將新鮮分離人臍血CD34+細(xì)胞在無(wú)血清及細(xì)胞因子培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染5小時(shí)，然后植入經(jīng)亞致死量照射非肥胖型糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺點(diǎn)(NOD/SCID)鼠，可在受鼠脾臟、骨髓及外周血GFP長(zhǎng)久表示。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第24頁(yè)25MethodsIsolationofHumanCD34+HematopoieticProgenitorCells

人CD34+造血祖細(xì)胞分離PreparationofLentiviralVectors

慢病毒載體制備TransductionofCD34+CellsbyLentiviralVectors

慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+細(xì)胞AnalysisofTransducedHumanCD34+CellsinNOD/SCIDMice

分析轉(zhuǎn)人CD34+細(xì)胞NOD/SCID小鼠慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第25頁(yè)26慢病毒在眼科疾病治療中應(yīng)用慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第26頁(yè)271.IntroductionTheprimaryaimofgenetransferintotheretinalcellshasbeentoinvestigatethedevelopmentalmechanismsoftheretinalcellsortoreverseretinaldiseases.Currently,lentivirusandadenoassociatedvirusvectorsarebeingusedforstudyingandcorrectinggenetherapyofretinaldegenerativediseases.

視網(wǎng)膜細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)主要目標(biāo)是研究視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)病機(jī)制或逆轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜疾病。

當(dāng)前，慢病毒和腺病毒載體在被用于研究和糾正視網(wǎng)膜變性性疾病基因治療。慢病毒簡(jiǎn)介專題知識(shí)講座第27頁(yè)28UsinganHIVvectorcarryingthegreenfluorescentprotein(GFP)geneexpressedfromthecytomegalovirus(CMV)p