植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座

第一篇分子與細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)

第三章植物蛋白質(zhì)組學(xué)植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第1頁(yè)

目錄

1.蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學(xué)

2.蛋白質(zhì)組和基因組

3.植物蛋白質(zhì)組研究方法

3.1蛋白質(zhì)雙向電泳

3.2氨基酸序列測(cè)定

3.3質(zhì)譜

3.4生物信息學(xué)

4.植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

4.1植物發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué)研究

4.2植物環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)研究

4.3磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究

5.植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究前景和挑戰(zhàn)

5.1表示整體分析以及蛋白質(zhì)組編目

5.2大規(guī)模蛋白質(zhì)功效研究

5.3建立完整蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第2頁(yè)

1.蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組：由一個(gè)基因組所表示全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)：研究在特定時(shí)間或環(huán)境下某個(gè)細(xì)胞或某種組織基因組所表示全部蛋白質(zhì)。它不是按照傳統(tǒng)方式孤立地研究某種蛋白質(zhì)分子功效,而是應(yīng)用各種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究某種蛋白質(zhì)在復(fù)雜細(xì)胞環(huán)境中功效。

蛋白質(zhì)組學(xué)分為表示蛋白質(zhì)組學(xué)和細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)。前者利用各種先進(jìn)技術(shù)研究蛋白質(zhì)表示整體改變,即研究在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、疾病和死亡不一樣階段中,細(xì)胞與組織蛋白質(zhì)組分改變;后者主要經(jīng)過(guò)分離蛋白質(zhì)復(fù)合物系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)間相互作用植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第3頁(yè)2.蛋白質(zhì)組和基因組

蛋白質(zhì)組和基因組關(guān)系：它們?cè)诟拍钌嫌邢嚓P(guān)性，代表某一蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)是由基因組編碼，而基因功效是經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出來(lái)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究遠(yuǎn)比基因組研究復(fù)雜：（1）蛋白質(zhì)組復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基因組一個(gè)基因≠一個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物≠一個(gè)蛋白質(zhì)基因→不一樣轉(zhuǎn)錄起始和mRNA剪切→不一樣mRNA→不一樣翻譯起始→不一樣蛋白質(zhì)→翻譯后修飾→蛋白質(zhì)功效、穩(wěn)定性、細(xì)胞定位發(fā)生改變植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第4頁(yè)

（2）基因組組成是固定，蛋白質(zhì)組組成是動(dòng)態(tài)?；蚪M在全部細(xì)胞中幾乎都是相同，與之不一樣，蛋白質(zhì)組含有很高細(xì)胞和組織特異性?；蚪M是相對(duì)穩(wěn)定，蛋白質(zhì)組處于高度動(dòng)態(tài)改變之中。（3）細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)拷貝數(shù)（108）遠(yuǎn)比基因拷貝數(shù)大（105）。（4）基因可采取PCR擴(kuò)增和自動(dòng)測(cè)序，而蛋白質(zhì)還沒(méi)有這些技術(shù)。

植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第5頁(yè)

3.1蛋白質(zhì)雙向電泳

3.2氨基酸序列測(cè)定

3.3質(zhì)譜技術(shù)

3.4生物信息學(xué)3.植物蛋白質(zhì)組研究方法植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第6頁(yè)蛋白質(zhì)組研究技術(shù)路線(xiàn)流程圖植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第7頁(yè)3.1蛋白質(zhì)雙向電泳

蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE)：依據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量不一樣，分別經(jīng)過(guò)第一維等電聚焦和第二維SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離。

電泳后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，慣用染色方法有考馬斯亮藍(lán)染色、銀染以及蛋白質(zhì)熒光檢測(cè)方法。

蛋白質(zhì)雙向電泳圖植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第8頁(yè)3.1.1利用雙向電泳研究植物蛋白質(zhì)組基本流程

蛋白樣品提取→雙向電泳分離蛋白→蛋白質(zhì)染色→雙向電泳圖譜分析

→蛋白點(diǎn)切割→蛋白酶解和判定

該流程最關(guān)鍵步驟是蛋白質(zhì)樣品提取，它關(guān)系到下游蛋白質(zhì)分離和判定是否能夠成功。好蛋白質(zhì)樣品要求從某一個(gè)細(xì)胞、組織或器官中提取盡可能多蛋白質(zhì)，以最大程度地反應(yīng)這個(gè)蛋白質(zhì)組全貌。植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第9頁(yè)3.1.2雙向電泳缺點(diǎn)和處理方法

處理方法：

1.對(duì)樣品進(jìn)行前期分級(jí)

2.對(duì)不一樣細(xì)胞器官或組織進(jìn)行分離

3.使用寬膠條，符合重合窄IPG凝膠

4.雙向熒光差異凝膠電泳

5.多塊膠垂直二維SDS系統(tǒng)

6.雙向電泳工作站植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第10頁(yè)

經(jīng)過(guò)使用不一樣強(qiáng)度離液劑和表面去垢劑，并進(jìn)行分步溶解分離，能夠取得更多蛋白質(zhì)，同時(shí)降低蛋白質(zhì)樣品復(fù)雜性，提升2-DE分辨率。如：ReadyPrep次序抽提試劑盒。

ReadyPrep試劑盒所需樣品量較少，不需要額外設(shè)備，是一個(gè)既節(jié)約時(shí)間又節(jié)約設(shè)備好方法。

ReadyPrep

產(chǎn)品線(xiàn)包含一系列2-DE樣品制備試劑盒，不但適合用于通用樣品（總蛋白）處理，而且能夠?qū)?fù)雜樣品按特定方法分級(jí)。處理通用樣品試劑盒包含總蛋白抽提和蛋白凈化（clean-up）。樣品分級(jí)試劑盒可用來(lái)降低樣品復(fù)雜程度，同時(shí)有利于低豐度蛋白富集和判定。這類(lèi)試劑盒又分為兩種，一個(gè)是基于蛋白不一樣亞細(xì)胞定位來(lái)分離，另一個(gè)是對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行分級(jí)。下面流程圖將幫您確定哪種試劑盒對(duì)您更適合。

一.對(duì)樣品進(jìn)行前期分級(jí)植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第11頁(yè)植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第12頁(yè)

次序抽提試劑盒可將樣品分離成3個(gè)遞增溶解度組份。這3個(gè)分離份依次分離，使我們能觀(guān)察到其它方法觀(guān)察不到蛋白。經(jīng)過(guò)對(duì)每一分離份逐層使用更強(qiáng)去垢劑，可提供遞增溶解度.

試劑一試劑二試劑三植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第13頁(yè)

二、對(duì)不一樣細(xì)胞或組織進(jìn)行分離

經(jīng)過(guò)亞細(xì)胞分類(lèi)，比如單獨(dú)提取細(xì)胞壁、細(xì)胞核、細(xì)胞膜、線(xiàn)粒體和葉綠體等蛋白質(zhì)組分。優(yōu)點(diǎn)：降低蛋白質(zhì)樣品復(fù)雜性，提升分辨率，了解蛋白質(zhì)定位。

三、使用寬膠條，符合重合窄IPG凝膠

2-DE分辨率通常認(rèn)為與有效分離面積成正比，使用寬分離距離IPG膠和長(zhǎng)距離二維SDS能夠提升2-DE分辨率。選取不一樣pH范圍膠條，經(jīng)過(guò)重合幾次窄范圍IPG凝膠電泳結(jié)果，能夠提升在某一區(qū)段尤其是蛋白質(zhì)集中區(qū)段內(nèi)分辨率

植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第14頁(yè)pH范圍3—104—75.0—6.0上樣量40ug80ug120ug植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第15頁(yè)四.雙向熒光差異凝膠電泳原理：雙向熒光差異凝膠系統(tǒng)（DIGE）在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)基礎(chǔ)上，結(jié)合了多重?zé)晒夥治龇椒?，在同一塊膠上共同分離多個(gè)分別由不一樣熒光標(biāo)識(shí)樣品，分析它們之間差異性。極大地提升了結(jié)果準(zhǔn)確性，可靠性和重復(fù)性。

五.多塊膠垂直二維SDS系統(tǒng)

優(yōu)點(diǎn)：提升二維電泳效率和試驗(yàn)重復(fù)性

六.2-DE工作站優(yōu)點(diǎn)：提升以2-DE為基礎(chǔ)蛋白質(zhì)組研究自動(dòng)化程度和工作效率

植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第16頁(yè)3.2氨基酸序列測(cè)定

氨基酸測(cè)序主要使用是N端測(cè)序Edman化學(xué)降解法。降解反應(yīng)分三步進(jìn)行：第一步：偶聯(lián)反應(yīng)，降解試劑（PITC）與多肽鏈游離氨基作用，形成PCT-肽。第二步：環(huán)化斷裂反應(yīng)，PCT-肽在無(wú)水強(qiáng)酸介質(zhì)如三氟乙酸中，最靠近PTC基肽鍵將發(fā)生斷裂，同時(shí)PTC-氨基酸殘基環(huán)化成ATZ衍生物。第三步：轉(zhuǎn)化反應(yīng)，首先水解生成PTC-氨基酸，然后環(huán)化成PTH-氨基酸，其在紫外區(qū)有很強(qiáng)吸收峰。它能夠被各種技術(shù)層析出來(lái)，然后判定。每輪Edman反應(yīng)，能夠判定一個(gè)氨基酸，剩下降低一個(gè)殘基肽鏈便在它N端暴露一個(gè)新氨基，又可參加第二輪反應(yīng)。植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第17頁(yè)偶聯(lián)反應(yīng)環(huán)化斷裂反應(yīng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第18頁(yè)3.3質(zhì)譜質(zhì)譜儀離心源質(zhì)量分析器離子檢測(cè)器基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）電噴霧電離（ESI）飛行時(shí)間（TOF）四級(jí)桿（Q）離子阱（IT）慣用質(zhì)譜儀有：MALDI-TOF-MSESI-Q-MSESI-IT-MS傅里葉變換離子盤(pán)旋共振么質(zhì)樸（FTMS）植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第19頁(yè)進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測(cè)器

質(zhì)譜分析原理植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第20頁(yè)TypicalresultfromMALDI-TOF植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第21頁(yè)P(yáng)eptidefingerprinting(PMF)withMALDI-TOF

trypticdigestionGelProteinDatabase?123compare:??isidenticalto??massspectrometrystoreddataortheoretical?peptides植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第22頁(yè)各種質(zhì)譜儀適用范圍：MALDI-TOF-MS：分析判定一些相對(duì)比較簡(jiǎn)單多肽混合物和進(jìn)行高通量蛋白質(zhì)組研究。ESI-MS：分析復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品，判定組成蛋白質(zhì)氨基酸序列和蛋白質(zhì)翻譯后修飾。FTMS：判定氨基酸序列和分析蛋白質(zhì)修飾。Bottom-up蛋白質(zhì)組學(xué)：需要將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行蛋白酶水解。如：MALDI-TOF-MSESI-Q-MSESI-IF-MSTop-down蛋白質(zhì)組學(xué)：能夠直接分析完整蛋白質(zhì)樣品，不需要經(jīng)過(guò)2-DE前處理。如：FTMS植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第23頁(yè)3.4生物信息學(xué)3.4.1蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)組包含大量信息：蛋白質(zhì)序列信息、加工和修飾信息、表示結(jié)構(gòu)功效信息、與其它蛋白質(zhì)形成復(fù)合物信息。

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)PAT苜蓿數(shù)據(jù)庫(kù)DOME3.4.2蛋白質(zhì)判定分析軟件

比如：2-DE成像分析軟件：Melanie,QUEST

蛋白質(zhì)判定軟件：MASCOT,PROWL植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第24頁(yè)4.植物蛋白質(zhì)組研究進(jìn)展4.1發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué)研究

發(fā)育蛋白質(zhì)組：指植物在某一特定生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，在特定生長(zhǎng)條件下，特定細(xì)胞、組織或器官中所表示全部蛋白質(zhì)。

發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué)：它揭示了在每一個(gè)特定時(shí)期所表示蛋白質(zhì)和這些蛋白質(zhì)在特殊生長(zhǎng)時(shí)期可能發(fā)揮作用，是深入了解和深入研究蛋白質(zhì)功效基礎(chǔ)。雙子葉植物：開(kāi)展了根、莖、葉、花、種子和果實(shí)蛋白質(zhì)組學(xué)組研究課題。單子葉植物：增加了葉鞘、花藥、胚、胚乳等蛋白質(zhì)組研究課題細(xì)胞器：細(xì)胞壁、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜、葉綠體、線(xiàn)粒體等植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第25頁(yè)4.2植物環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)研究

4.3磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究

環(huán)境原因非生物原因：厭氧、冷、熱、干旱、鹽、重金屬等生物逆境：植物真菌、病毒植物激素：生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸、乙烯等

研究與環(huán)境原因相關(guān)蛋白質(zhì)，觀(guān)察它們?cè)谀婢抄h(huán)境條件下表示量改變，并研究它們是怎樣抵抗外界不利生長(zhǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞生命活動(dòng)環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)：植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第26頁(yè)

蛋白磷酸化是植物細(xì)胞將外界信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)一個(gè)主要伎倆，磷酸化能夠改變蛋白質(zhì)生物活性、亞細(xì)胞定位，影響蛋白質(zhì)之間相互作用，更主要是這種改變是雙向，及蛋白質(zhì)活性、細(xì)胞定位等能夠經(jīng)過(guò)磷酸化和去磷酸化來(lái)調(diào)整。

研究現(xiàn)實(shí)狀況：植物磷酸化蛋白質(zhì)組研究還是以單個(gè)蛋白質(zhì)為主，采取技術(shù)伎倆有Westernblot,2-DE,用MS/MS分析磷酸化酯酶處理后蛋白質(zhì)樣品等。近年來(lái)伴隨各種新技術(shù)發(fā)展，植物磷酸化蛋白質(zhì)組研究也有了很大進(jìn)展。比如用2-DE和MS/MS聯(lián)用，堅(jiān)定了馬鈴薯線(xiàn)粒體內(nèi)14個(gè)磷酸化蛋白，擬南芥質(zhì)膜磷酸化蛋白質(zhì)組研究共判定了300多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第27頁(yè)5.植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究前景和挑戰(zhàn)

植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究與應(yīng)用面臨3個(gè)主要問(wèn)題：

1.表示整體分析以及蛋白質(zhì)組編目大規(guī)模整體性分析蛋白質(zhì)在某一個(gè)細(xì)胞或組織中含量以及動(dòng)態(tài)表示是蛋白質(zhì)組學(xué)研究目標(biāo)之一。

2.大規(guī)模蛋白質(zhì)功效研究蛋白質(zhì)最大挑戰(zhàn)是判定每一個(gè)蛋白質(zhì)以及它們異構(gòu)體功效，一個(gè)較有前景策略是經(jīng)過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)整體性研究植物蛋白質(zhì)之間相互作用。

3.建立完整蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)建立蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)，不但能夠提供蛋白質(zhì)之間相互關(guān)系信息，而且還能夠和基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等信息聯(lián)絡(luò)起來(lái)。

植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第28頁(yè)

謝謝植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第29頁(yè)

基因組(DNA)

轉(zhuǎn)錄組(RNA)蛋白質(zhì)組(PROTEIN)CitrateCycle代謝組(biochemicalmolecular)植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第30頁(yè)植物蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)家講座第31頁(yè)實(shí)例植物組織2-DE分析pH3

pH10100KD10KD物種：水稻組織名稱(chēng)：根部制備方法：液氮研磨+TCA-丙酮沉淀法上樣量：5