免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座

免疫標識技術（immunolabellingtechnique）:

是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標識抗體或抗原進行抗原抗體反應。特點：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位分類：免疫酶技術、免疫熒光技術、放射免疫技術、免疫電鏡技術、免疫膠體金技術和發(fā)光免疫測定。免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第1頁免疫酶測定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶標識抗原或抗體進行抗原抗體反應。

辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點：高度特異性：保持抗原抗體反應特異性高靈敏度：酶催化底物顯色高效性，pg水平微量檢測定性定量檢測：反應液顏色深淺或光密度值分類：酶聯(lián)免疫吸附試驗：可溶性抗原或抗體酶免疫組化法：組織中或細胞表面抗原。免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第2頁一、原理

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是一個固相酶免疫測定方法，當前廣泛應用于各種抗原和抗體檢測。其基本原理是：將抗原或抗體固定在固相載體表面，并保持其免疫活性，再與酶標識抗體或抗原聯(lián)結，并保持并保留酶活性，然后加入酶反應底物，后者被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，反應顏色深淺可與對應抗原或抗體量相關。在本試驗中，以辣根過氧化物酶標識抗人IgG抗體，與對應抗原IgG結合，標識酶可催化底物（鄰苯二胺）起顯色反應，從而指示特異性抗原抗體反應存在。免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第3頁二、材料：1、人IgG包被微量酶標反應板，（1：1萬，1：2萬，1：4萬，1：8萬，1：16萬）2、酶標抗人IgG抗體稀釋液、洗滌液（PH7.4，0.01MPBS-Tween20）、底物溶液，3、微量移液器、移液頭、吸水紙、洗瓶、濕盒、37℃恒溫箱等。免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第4頁三、方法：1.人IgG包被微量酶標反應板：取人IgG各100ul，分別加入第1至5孔，設第6孔為對照。置37℃恒溫箱2小時，取出，移入4℃冰箱過夜。取出，用洗滌液洗3次，5分鐘/次。(略）2.用含小牛血清（BSA）PH7.4PBS封閉，置37℃恒溫箱，30分鐘，取出。用洗滌液洗3次，3~5分鐘/次。（略）3.用微量移液器吸收100ul酶標抗人IgG抗體，分別加入第6至1孔。置濕盒中，于37℃恒溫箱中孵育30分鐘。4.取出酶標板，用洗滌液洗3次，3~5分鐘/次。5.按第6孔至第1孔次序，每孔各加100ul底物溶液，置37℃恒溫箱中10-15分鐘。6.觀察顯色反應。免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第5頁用PBS洗滌3次（將洗板液加入每孔，3min后傾去），以洗去未結合游離酶標抗體。不一樣濃度IgG100ul/孔酶標板126543酶標抗人IgG抗體底物觀察顯色免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第6頁四、結果1654321~5孔，伴隨包被抗原濃度降低，顏色逐步變淡6孔（對照）無色五、結論

ELISA可簡便、快速、定量地檢測抗原或抗體免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第7頁操作注意事項：1、正確掌握微量移液器使用方法：一檔取樣，二檔加樣。2、正確洗滌酶標板：勿使洗滌液溢出，造成交叉污染洗滌后應盡可能甩干孔內(nèi)殘液。3、注意加樣次序，加樣品時應注意從最高稀釋度逐一加至最低稀釋度。4、底物OPD有一定致癌作用，故操作時應小心，勿使底物沾染試驗臺等器材。5，槍頭（移液頭）忌丟入試驗臺微生物專用廢液缸內(nèi)。免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第8頁ELISA分類√直接法（CompetitiveELISA)：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標識抗原或抗體檢測液相中可溶性抗原或抗體√間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標識二抗檢測液相中未知抗體√雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標識一抗檢測液相中可溶性抗原免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第9頁SandwichELISAindirectELISA免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第10頁ELISA檢測抗原

Ag+Ab*?Ag-Ab*免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第11頁ELISA檢測抗體

Ab+Ag*?Ab-Ag*免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第12頁ELISA檢測抗體Ag+Ab1?Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*?Ag-Ab1-Ab2*

免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第13頁免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第14頁間接ELISA（可測各種細菌或病毒抗體，用途廣泛）顯色

免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第15頁免疫技術：以抗原-抗體反應原理為基礎，對樣品中對應抗原或抗體進行檢測。標識技術：將可被探測示蹤物質(zhì)用化學方法與化合物連接。標識免疫分析：用可微量或超微量檢測示蹤劑標識抗原、抗體，檢測免疫反應結果并確定待檢物。免疫標識技術補充免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第16頁放射免疫技術免疫熒光技術酶免疫技術三大經(jīng)典標識技術三大經(jīng)典標識技術免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第17頁放射免疫RIA以標識抗原與反應系統(tǒng)中未標識抗原競爭結合特異性抗體來測定待檢樣品中抗原量。

免疫放射IRMA以過量標識抗體與抗原非競爭結合，采取固相免疫吸附載體分離游離和結合標識抗體。放射受體分析RRA放射配體結合分析RBA其它放射免疫技術－原理免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第18頁二、放射免疫技術－慣用放射性核素

125I

3H射線γβ理化性

活潑

差核素豐度

>90%－半衰期60.2d12.3y標識方法簡單復雜標識設備低廉昂貴測量條件簡單復雜慣用標識核素免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第19頁熒光抗體技術熒光免疫測定均相熒光免疫測定（homogeneousfluorescenceimmunoassay）

非均相熒光免疫測定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）熒光免疫技術熒光免疫技術是將抗原抗體反應特異性與熒光技術敏感性相結合，反抗原或抗體進行定性、定位或定量檢測。熒光免疫技術類型免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第20頁熒光抗體技術基本原理

熒光素標識抗體與切片中組織細胞抗原反應，洗滌分離后熒光顯微鏡觀察展現(xiàn)特異熒光抗原抗體復合物及其部位，對組織細胞抗原進行定性和定位檢測，或?qū)Ρ旧砜贵w進行定性和滴度測定。免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第21頁Immunofluorescence,IF免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第22頁熒光顯微鏡

利用一定波長激發(fā)光對樣品進行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長熒光，對樣品結構或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。

免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第23頁病原體檢測寄生蟲（猴胚腎細胞內(nèi)弓形蟲）細菌（藤黃微球菌)熒光抗體技術應用免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第24頁免疫病理檢測腫瘤（人肝癌細胞）熒光抗體技術應用免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第25頁主要試劑:

酶標識抗體或抗原酶標物特點：

免疫學活性酶對底物催化活性抗原抗體反應特異性+酶高效催化反應專一性酶免疫測定法原理及特點免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第26頁特點：靈敏度高、特異性強、準確性好酶標識試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定操作簡便、對環(huán)境沒有污染。易與其它技術偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣新方法。原理：酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）特異性反應酶對底物顯色反應反抗原或抗體進行定位、定性或定量測定分析

原理及特點免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第27頁辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關輔基是酶活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比RZ值與酶活性無關，酶活性單位比RZ值更為主要ELISA中應用最為廣泛標識用酶慣用酶酶和酶作用底物免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第28頁酶免疫技術酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標本中抗原定位

液體標本中抗原或抗體定性和定量酶免疫技術分類免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第29頁堿性磷酸酶（AP）

菌源性AP腸粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫測定

慣用酶酶和酶作用底物免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第30頁HRP底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氫體DH2習慣上被稱為底物，底物有各種

H2O2為受氫體，HRP對受氫體專一性很高

慣用底物酶和酶作用底物免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第31頁HRP常見底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS慣用底物酶和酶作用底物免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第32頁OPD反應后顯橙黃色，加酸終止反應后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應后顯藍色，加酸終止反應后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應用最廣泛底物。

HRP常見底物

酶和酶作用底物免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第33頁AP底物

β-Gal底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）經(jīng)AP作用后產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

酶作用后，生成高強度熒光物，用熒光計測量。慣用底物酶和酶作用底物免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第34頁酶免疫技術關鍵組成部分

酶結合物（conjugate）酶標識物經(jīng)過化學反應或免疫學反應，讓酶與抗體或抗原形成結合物

酶標識抗體或抗原免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第35頁

酶聯(lián)免疫吸附試驗

免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第36頁底物顯色定性或定量分析原理包被反應加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結合在固相上抗原抗體復合物與未結合分離1234一、基本原理免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第37頁固相抗原或抗體

酶標識物（酶結合物）

酶反應底物

三個必要試劑

二、方法類型及反應原理免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第38頁雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色應用：

二價或二價以上較大分子抗原測定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測抗原方法免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第39頁免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第40頁1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標抗體與抗原結合4、加酶作用底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結合4、加酶作用底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無抗原與抗體結合3、加酶標抗體無抗原結合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第41頁競爭法

方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗原，酶標抗原與待檢物競爭與包被物結合。加底物顯色。

應用：用于只有一個抗原決定簇小分子半抗原（藥品、激素等）ELISA檢測抗原方法免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第42頁免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第43頁洗滌洗滌競爭法測抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標抗原競爭與抗體結合3、加酶作用底物不顯色或顯色弱3、加酶作用底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測物和酶標抗原，酶標抗原與抗體結合YE免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第44頁間接法方法

用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點一個酶標抗抗體檢測各種與抗原對應抗體應用

慣用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等測定ELISA檢測抗體方法免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第45頁免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第46頁1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無抗體與抗原結合3、加酶標抗Ig與抗體結合4、加酶作用底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結合3、加酶標抗Ig抗體4、加酶作用底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第47頁雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似應用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測抗體方法免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第48頁競爭法原理：類似檢測抗原競爭法

應用：乙型肝炎病毒關鍵抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)檢測ELISA檢測抗體方法免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第49頁捕捉法

應用：

病原體急性感染診療中IgM型抗體

甲型肝炎HAV-IgM抗體

乙型肝炎病毒關鍵HBc-IgM抗體ELISA檢測抗體方法免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第50頁捕捉法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕捉待測標本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標識特異性抗原抗體底物顯色

免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第51頁洗滌洗滌洗滌洗滌捕捉法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結合3、加特異性抗原，與特異性抗體結合4、加酶標抗體與特異性抗原結合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結合4、加酶標抗體無抗原結合，加底物不顯色免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第52頁人IL-2定量酶聯(lián)檢測

BAS-ELISA(生物素-親和素ELISA)免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第53頁

一、原理

ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay)是一個固相酶免疫測定方法，廣泛應用于各種抗原或抗體微量檢測，其基本原理是將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原－抗體反應在固相表面進行，經(jīng)過洗滌將固相上抗原－抗體復合物與液相中游離成份分離，再利用各種操作方法，測定可溶性抗原或抗體。

BAS-ELISA是在常規(guī)ELISA原理基礎上，結合生物素(B)與親和素(A)間高度放大作用，而建立一個檢測系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取一個堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高親和力(結合常數(shù)高達1015M-1)。生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價鍵結合。這么，結合了酶親和素分子與結合有特異性抗體生物素分子產(chǎn)生反應，既起到了多級放大作用，又因為酶在碰到對應底物時催化作用而呈色，到達檢測未知抗原(或抗體)分子目標。免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第54頁本試驗采取雙抗體夾心ELISA法。抗人IL-2單抗包被于酶標板上，標準品中IL-2會與單抗結合，游離成份被洗去。加入生物素化抗人IL-2抗體和辣根過氧化物酶標識親和素。生物素和親和素特異性結合；抗人IL-2抗體與結合在單抗上人IL-2結合而形成免疫復合物，游離成份被洗去。加入顯色劑，若反應孔中有IL-2，辣根過氧化物酶會使無色顯色劑現(xiàn)藍色，加終止液變黃。在450nm處測OD值，IL-2濃度與OD450值之間呈正比，繪制標準曲線。免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第55頁二、材料（人IL-2ELISA試劑盒）

1.1ng/ml人IL-2標準品2.標準品稀釋液3.生物素化抗人IL-2抗體（1:100）4.酶結合親和素（1:100）5.洗滌液6.顯色劑（過氧化氫－四甲基聯(lián)苯胺）7.終止液8.抗人IL-2單抗包被板條9.封板膠紙免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第56頁三、操作步驟

1.包被抗體：用0.05MPH9.6碳酸鹽緩沖液將已知抗體作適當稀釋，在每個聚苯乙烯酶標板反應孔中加0.1ml，4℃過夜(18-24小時)。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。

2.配制不一樣濃度標準品：

孔號12345678NS(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.1

人IL-2(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.1

稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:256免疫實驗醫(yī)學宣教專家講座第57頁3.加樣：將稀釋不一樣濃度標準品各100ul加入反應孔1~8孔中，同時第9孔作空白孔。37℃孵育60分鐘，洗滌4次，0.5