3.2基因工程的基本操作程序（第(1)課時）高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第3章

基因工程第2節(jié)

基因工程的基本操作程序（第一課時）從社會中來1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟(jì)效益450億元。

培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟?蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心)3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測與鑒定一、目的基因的篩選與獲取（一）目的基因1.概念在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等相關(guān)的基因。2.作用根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。3.實(shí)例與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因Bt抗蟲蛋白基因簡稱

Bt基因（二）篩選合適的目的基因1.較為有效的方法之一從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選。2.認(rèn)識基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）、序列比對工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會和可能。01目的基因的篩選與獲取3.實(shí)例：Bt

抗蟲蛋白基因（Bt基因）的篩選過程用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害也對Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)不僅掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因一、目的基因的篩選與獲取一、目的基因的篩選與獲?、偻ㄟ^構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因②人工合成目的基因③利用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因前提：方法：DNA合成儀基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成（三）獲取目的基因的方法PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。

如果說，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，標(biāo)志著分子生物學(xué)時代的開啟，那么PCR技術(shù)則標(biāo)志著分子生物學(xué)的騰飛。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，徹底變革了生物化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)等等。一、目的基因的篩選與獲?。ㄋ模├肞CR獲取和擴(kuò)增目的基因：DNA半保留復(fù)制原理

體外操作環(huán)境對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制目的可在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因優(yōu)點(diǎn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)全稱它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。PCR一、目的基因的篩選與獲?。ㄋ模├肞CR獲取和擴(kuò)增目的基因：【重溫】DNA復(fù)制的過程解旋合成子鏈形成新DNACGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶（1）解旋CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT（2）合成子鏈CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPATPDNA聚合酶作用下形成磷酸二酯鍵子鏈延伸合成的方向？只能從5′－端→3′－端延伸，細(xì)胞內(nèi)有RNA引物結(jié)合到模板3′－端引發(fā)子鏈的延伸為什么子鏈的延伸方向是5′→3′？因?yàn)镈NA聚合酶不能直接將單個的核苷酸聚合成鏈，只能將單個核苷酸加到已有鏈的3′-端DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有鏈的3′-端為什么子鏈合成需要引物？CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATAA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT5'3'TAGCCGTATAGCCGATAT3'5'TTACGCGTATATATA5'3'（3）重新螺旋形成新的DNA分子01一、目的因的篩選與獲取問題:結(jié)合體內(nèi)DNA復(fù)制過程，思考PCR的進(jìn)行需要哪些條件？參與的組分在DNA復(fù)制中的作用

解旋酶DNA母鏈合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈引物提供DNA復(fù)制的模板斷開氫鍵，打開DNA雙鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（體外用高溫代替）4種脫氧核苷酸DNA聚合酶01耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）DNA母鏈引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液四種脫氧核苷酸(dNTP)1.基本條件:一般添加Mg2+（激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶）引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸長度通常為20~30個核苷酸模板、原料、能量、酶、引物、緩沖溶液、不同溫度一、目的基因的篩選與獲取（四）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因：2.PCR反應(yīng)過程耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（DNTP）引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）5’5’

變性

復(fù)性

延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。2.PCR反應(yīng)過程因?yàn)樽冃缘臏囟扰c氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時，所需溫度也就越低。905072℃變性3`5`5`3`2.PCR反應(yīng)過程905072℃復(fù)性2.PCR反應(yīng)過程905072℃延伸2.PCR反應(yīng)過程905072℃變性2.PCR反應(yīng)過程905072℃復(fù)性2.PCR反應(yīng)過程905072℃延伸2.PCR反應(yīng)過程905072℃變性2.PCR反應(yīng)過程905072℃復(fù)性2.PCR反應(yīng)過程905072℃延伸2.PCR反應(yīng)過程3.PCR的結(jié)果：由于一個循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式擴(kuò)增（約為

，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。指數(shù)2n4.PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。變性90℃以上延伸72℃左右復(fù)性50℃左右基本過程一、目的基因的篩選與獲?。ㄋ模├肞CR獲取和擴(kuò)增目的基因：PCR中的數(shù)量關(guān)系擴(kuò)增次數(shù)123nDNA片段數(shù)2482n含引物的DNA片段數(shù)2482n含其中一種引物的DNA片段數(shù)1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同時含兩種引物的DNA片段數(shù)0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的對數(shù)1＝21－13＝22－17＝23－12n－1含脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段數(shù)0＝21－20＝22－42＝23－62n－2nPCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程比較比較項(xiàng)目細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場所主要在細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞外(主要在PCR擴(kuò)增儀內(nèi))酶解旋酶、DNA聚合酶等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件控制溫度，需在不同溫度下進(jìn)行結(jié)果合成整個DNA分子擴(kuò)增特定的DNA片段或基因聯(lián)系①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料:均為四種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物開始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成（1）PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)

（

）（2）PCR擴(kuò)增技術(shù)中，需用解旋酶使雙鏈DNA解聚

（

）（3）PCR過程使用的DNA聚合酶的特點(diǎn)是耐高溫

（

）（4）PCR技術(shù)中，DNA模板鏈上堿基G和C的比例越高，DNA變性解鏈的溫度就越高

（

）判斷?？颊Z句，澄清易混易錯問題：獲取了足夠量的目的基因后，能直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞嗎？就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會直接被分解

不能原因那怎樣才能讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代呢？二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建人們所需要的基因作用：便于重組DNA分子的篩選位置：功能：基因的下游（一段特殊的DNA片段）終止轉(zhuǎn)錄位置：功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA?；虻纳嫌危ㄒ欢斡刑厥饨Y(jié)構(gòu)的DNA片段）（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用?；蚬こ痰暮诵?.目的：2.組成：問題:目的基因該插入什么位置？目的基因插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)載體需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入

，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能。啟動子和終止子之間的部位誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)物作用激活或抑制目的基因表達(dá)誘導(dǎo)型啟動子：【說明】有時為了滿足應(yīng)用需要，會在載體上人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。啟動子終止子起始密碼子終止密碼子位于基因上位于mRNA上翻譯的起始點(diǎn)翻譯的終點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的終點(diǎn)(本身不轉(zhuǎn)錄)決定氨基酸不決定氨基酸對比啟動子起始密碼子終止子終止密碼子所在位置DNAmRNADNAmRNA作用RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)。翻譯的起始點(diǎn)AUG(甲硫氨酸）GUG（纈氨酸）轉(zhuǎn)錄的終點(diǎn)翻譯的終點(diǎn)（UAA、UGA、UAG)問題:辨析：“啟動子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”。3.構(gòu)建過程：質(zhì)粒限制酶限制酶切割位點(diǎn)首先，用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個切口；01限制酶限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因目的基因然后用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段023.構(gòu)建過程：DNA連接酶重組DNA分子獲取目的基因質(zhì)粒利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，這樣就形成了一個重組DNA分子。033.構(gòu)建過程：質(zhì)粒限制酶限制酶DNA連接酶同種限制酶或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶切割重組DNA分子限制酶切割位點(diǎn)目的基因限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因思考：使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，會得到幾種重組DNA？有何缺點(diǎn)？怎么改進(jìn)？3.構(gòu)建過程：1、單酶切（同一種酶）：（1）目的（結(jié)果）：產(chǎn)生相同的黏性末端（2）DNA連接酶處理后會出現(xiàn)幾種產(chǎn)物：①目的基因——載體連接物②載體——載體連接物（弊端）③目的基因——目的基因連接物（弊端）②③分別叫做載體的自身環(huán)化和目的基因的自身環(huán)化啟動子方向目的基因轉(zhuǎn)錄方向限制酶切割abcdDNA連接