生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座

分離技術(shù)生物制藥工藝學(xué)第四章到第十一章生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第1頁(yè)第四章固相析出分離法改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出操作技術(shù)稱(chēng)為固相析出分離法。析出物為晶體時(shí)稱(chēng)為結(jié)晶；析出物為無(wú)定形固體稱(chēng)為沉淀法。固相析出法主要有鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，等電點(diǎn)沉淀法，結(jié)晶法等。鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度差異，經(jīng)過(guò)向溶液中引入一定數(shù)量中性鹽，使目標(biāo)物或雜蛋白以沉淀析出，到達(dá)純化目標(biāo)方法。鹽析機(jī)制：高濃度中性鹽溶液中存在著大量帶電荷鹽離子，它們能夠中和生物分子表面電荷，使之賴以穩(wěn)定雙電層受損，從而破壞分子外圍水化層；另外，大量鹽離子本身水合作用降低了自由水濃度，從另首先摧毀了水化層，使生物分子相互聚集而沉淀。生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第2頁(yè)有機(jī)溶劑沉淀法向水溶液中加入一定量親水性有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)溶解度，使其沉淀析出分離純化方法。主要機(jī)理：（1)親水性有機(jī)溶劑加入溶液后降低了介質(zhì)介電常數(shù)，使得溶質(zhì)分子之間靜電引力增加，聚集形成沉淀。(2)水溶性有機(jī)溶劑本身水合作用降低了自由水濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層厚度，降低了它親水性，造成脫水凝集。等電點(diǎn)沉淀法兩性電解質(zhì)，在溶液pH處于等電點(diǎn)（pI）時(shí)分子表面凈電荷為零，造成賴以穩(wěn)定雙電層及水化膜減弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。調(diào)整溶解pH值，使兩性溶質(zhì)溶解度下降，析出沉淀操作。生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第3頁(yè)結(jié)晶法改變?nèi)芤阂恍l件，使其中溶質(zhì)以結(jié)晶態(tài)析出過(guò)程稱(chēng)作結(jié)晶。（一）鹽析結(jié)晶法這是生化制藥中應(yīng)用最多結(jié)晶方法。其作用是經(jīng)過(guò)向結(jié)晶溶液中引入中性鹽，逐步降低溶質(zhì)溶解度使其過(guò)飽和，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后晶體形成并逐步長(zhǎng)大。（二）透析結(jié)晶（三）有機(jī)溶劑結(jié)晶（四）等電點(diǎn)結(jié)晶（五）溫度誘導(dǎo)結(jié)晶生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第4頁(yè)第五章吸附法吸附是物質(zhì)分子在兩相界面上濃度增加。因?yàn)榻缑嫔戏肿油瑫r(shí)受到不相等兩相分子作用力，所以界面分子力場(chǎng)是不飽和，即存在一個(gè)固體表面力，它能從外界吸附分子、原子或離子，并在吸附劑表面附近形成多分子層或單分子層。我們稱(chēng)物質(zhì)從流動(dòng)性（氣或液相）濃縮到固體表面從而到達(dá)分離過(guò)程稱(chēng)為吸附作用。把在表面上能發(fā)生吸附作用固體稱(chēng)為吸附劑；將被吸附物質(zhì)稱(chēng)為吸附物。生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第5頁(yè)預(yù)處理上樣吸附洗雜洗脫再生生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第6頁(yè)慣用吸附劑：1)活性炭是一個(gè)吸附能力很強(qiáng)非極性吸附劑，其吸附作用在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中較弱，吸附能力次序：水>乙醇>甲醇>乙酸乙酯>丙酮>氯仿。2)人造沸石人造沸石是一個(gè)人工合成無(wú)機(jī)陽(yáng)離子交換劑。用于細(xì)胞色素C分離。3)磷酸鈣凝膠在蛋白質(zhì)分離、精制中，較為慣用吸附劑為磷酸鈣凝膠。（羥基磷灰石）活性部位為鈣離子。4)白陶土5)氫氧化鋁凝膠用于蛋白質(zhì)及酶分離。生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第7頁(yè)6)氧化鋁活性氧化鋁是最慣用一個(gè)吸附劑，尤其適于親脂性成份分離，廣泛地用于在醇，酚，生物堿，染料，甾體化合物，苷類(lèi)，氨基酸，蛋白質(zhì)以及維生素等物質(zhì)分離。7)硅膠最慣用8)滑石粉惰性助濾劑9)硅藻土惰性助濾劑10)皂土11)聚酰胺粉12)大孔網(wǎng)格聚合物吸附樹(shù)脂極性，弱極性，非極性大孔吸附樹(shù)脂強(qiáng)酸性，弱酸性，強(qiáng)堿性，弱堿性等生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第8頁(yè)第六章離子交換法離子交換法是利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)協(xié)力差異進(jìn)行物質(zhì)分離操作方法。帶電粒子與離子交換劑間作用力是靜電力。它們結(jié)合是可逆，在一定條件下能夠結(jié)合，條件改變后也能被釋放出來(lái)。離子交換劑由惰性不溶性載體，功效基團(tuán)和平衡離子組成。生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第9頁(yè)X＋X＋X＋X＋X＋X＋Y＋X＋Z＋X＋Y＋Z＋Z＋Y＋Y＋Y＋X＋Z＋X＋Z＋X＋Z＋Z＋X＋X＋X＋Y＋Z＋Y＋Z＋Ｘ＋Ｘ＋X＋X＋X＋X＋Ｚ＋X＋Ｚ＋X＋X＋OH－nX＋平衡上樣吸附洗雜洗脫生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第10頁(yè)第七章凝膠層析它是將樣品化合物經(jīng)過(guò)一定孔徑凝膠固定相，用于流經(jīng)體積差異，使不一樣分子量組成得以分離層析。生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第11頁(yè)生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第12頁(yè)VC大分子小分子生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第13頁(yè)ABCV0ViGPC測(cè)分子量Y=A+BX生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第14頁(yè)第八章親和層析利用生物大分子特異性親和力而設(shè)計(jì)層析技術(shù)稱(chēng)為親核層析。在親和層析中起可逆結(jié)合特異性物質(zhì)稱(chēng)為配基（Ligand），與配基結(jié)合層析介質(zhì)稱(chēng)為載體（Matrix）親和層析設(shè)計(jì)原理和過(guò)程：1)配基固定化選擇適當(dāng)配基與不溶性支撐載體偶聯(lián)，或共價(jià)結(jié)合成含有特異性親和性分離介質(zhì)。2)吸附樣品親和層析介質(zhì)選擇性吸附酶或其它生物活性物質(zhì)，雜質(zhì)與層析間沒(méi)有親和作用，故不能被吸附而被洗滌去除。3)樣品洗脫選擇適宜條件使被吸附親和介質(zhì)上酶或其它生物活性物質(zhì)洗脫。生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第15頁(yè)LSLLS＋＋S＋S＋雜質(zhì)SS＋LLLLL配基樣品配基固定化吸附樣品樣品洗脫生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第16頁(yè)第九章離心技術(shù)沉降作用—懸浮液靜置時(shí)，在重力作用下，密度大于周?chē)芤汗腆w顆粒逐步下沉，成為沉降作用。離心技術(shù)—在離心力場(chǎng)作用下，加速懸浮液中固體顆粒沉降速度方法稱(chēng)為離心技術(shù)。相對(duì)離心力—通慣用離心力與重力比值表示離心機(jī)離心能力，也稱(chēng)分離原因，用符號(hào)×g或g表示。生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第17頁(yè)第十章膜分離技術(shù)分離范圍分離動(dòng)力普經(jīng)過(guò)濾>1μm壓力差微孔過(guò)濾0.01~1μm壓力差透析5~100?分子擴(kuò)散超級(jí)過(guò)濾5~100?壓力差反滲透<5?壓力差電滲析<5?電能生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第18頁(yè)第十一章制備型高效液相色譜制備型HPLC技術(shù)是利用大直徑柱，分離制備大量純物質(zhì)（>0.1g）HPLC分離依據(jù)是樣品中各組分之間帶電性，極性，疏水性，分子大小，等電點(diǎn)，親和性，螯合性等理化性質(zhì)差異。將樣品導(dǎo)入柱頭，流動(dòng)相在高壓泵作用下，其流量被準(zhǔn)確地控制經(jīng)過(guò)色譜柱，樣品中各組分在色譜柱中形成查速遷移，按時(shí)間先后流出層析柱，然后進(jìn)行檢測(cè)和分部搜集。泵色譜柱檢測(cè)器色譜數(shù)據(jù)處理溶劑生物制藥工藝學(xué)分離技術(shù)專(zhuān)家講座第19頁(yè)按固定相對(duì)樣品保留機(jī)理，HPLC大致可分為液固色譜，鍵合相色譜，離子交換色譜，離子對(duì)色譜，凝膠色譜，疏水色譜，親和色